序连接的DNA。在某些实施方案中，细胞可为哺乳动物细胞。在某些实施方案 中，细胞可为B细胞、T细胞、NKT细胞或癌细胞。
[0049] 在其它实施方案中，本公开提供以下方法，所述方法包括用缀合到寡核苷酸的珠 粒将单细胞分开于隔室中；使细胞裂解；允许从细胞释放的mRNA转录物与缀合到珠粒的寡 核苷酸杂交；进行逆转录酶聚合酶链式反应以从来源于单细胞的至少两个转录物形成至少 两个cDNA ;以及测序附接到珠粒的cDNA。
[0050] 在另一实施方案中，本公开提供一种方法，所述方法包括混合细胞与直径小于细 胞直径的珠粒，其中珠粒缀合到寡核苷酸，隔离体积小于5nL的隔室内的细胞和珠粒，使细 胞裂解并且允许mRNA转录物与珠粒缔合，从隔室分离珠粒和缔合mRNA，进行逆转录，接着 对珠粒缔合的mRNA进行PCR扩增，以及测序每个珠粒的DNA产物以鉴别与每个珠粒缔合的 cDNA。
[0051 ] 在其它实施方案中，本公开提供一种系统，其包括含水流体相出口，其安置在环形 流动油相内，其中水相流体包含细胞悬浮液并且分散于流动油相内，产生具有包含细胞的 含水悬浮液的低尺寸分散性的乳化液滴。
[0052] 在其它实施方案中，本公开提供一种组合物，其包含珠粒、能够结合mRNA的寡核 苷酸，和对所关注转录物特异的两个或更多个引物。
[0053] 在某些实施方案中，本公开还提供一种装置，其包括微孔的有序阵列，每个微孔具 有设计以容纳单淋巴细胞的尺寸。在一个实施方案中，微孔可为直径为56 μ m并且深度为 50 μ m的圆形孔，总体积为125pL。此类微孔通常体积在20-3, OOOpL范围内，尽管各种各样 的孔大小、形状和尺寸可用于单细胞容纳（single cell accommodation)。在某些实施方 案中，微孔可为纳米孔。在某些实施方案中，装置可为芯片。本公开的装置允许单芯片中数 万个单细胞的直接包埋，其中每个细胞在它自己的微孔中。在某些实施方案中，芯片可为显 微镜载片的大小。在一个实施方案中，微孔芯片可用于捕获在其自身单独微孔中的单细胞 (图6)。微孔芯片可由聚二甲基硅氧烷（PDMS)制成；但是，本领域中已知的其它合适材料 如聚丙稀酰亚胺（polyacrylimide)、娃和蚀刻玻璃也可用于产生微孔芯片。
[0054] 与寡核苷酸缀合的一些珠粒或其它粒子也可根据本公开的方法捕获于具有单细 胞的微孔中。在某些实施方案中，珠粒可包括固定在珠粒表面上的寡核苷酸。在其它实施 方案中，珠粒可为磁性的。在其它实施方案中，珠粒可包覆有一个或多个寡核苷酸。在某 些实施方案中，寡核苷酸可为poly (T)、对重链扩增特异的序列和/或对轻链扩增特异的序 列。透析膜覆盖微孔，在裂解试剂透析到微孔中同时保持细胞和珠粒在微孔中。裂解试剂 引起细胞的mRNA转录物释放到具有珠粒的微孔中。在寡核苷酸为poly (T)的实施方案中， p〇ly(A)mRNA尾由珠粒上的poly(T)寡核苷酸捕获。因此，每个珠粒包覆有单细胞的mRNA 分子。然后将珠粒汇集、洗涤并且重悬浮在具有用于重叠延伸（OE)逆转录酶聚合酶链式反 应（RT-PCR)的试剂的溶液中。本反应混合物包括设计以产生包含共价连接在一起的两个 所关注转录物的cDNA的单PCR产物的引物。在热循环之前，试剂溶液/珠粒悬浮液在油相 中乳化以产生每个液滴具有不大于一个珠粒的液滴。将OE RT-PCR的连接cDNA产物回收 并且用作巢式PCR的模板，所述巢式PCR扩增所关注的连接转录物。然后对巢式PCR的纯 化产物测序，并且分析配对信息（图6)。在其它实施方案中，限制和连接可用于连接所关注 的多转录物的cDNA。在其它实施方案中，重组可用于连接所关注的多转录物的cDNA。
[0055] 本公开还提供一种方法以捕捉珠粒上单细胞的mRNA，进行cDNA合成，连接单细胞 的两个或更多个所需cDNA的序列以产生单分子，并且最终通过高通量（下一代）测序显示 连接转录物的序列。根据本公开，增大生物分析中通量的一种方式为使用产生大量3-维平 行化微型反应器的乳液。分子生物学的乳液方案通常得到每毫升109-1011个液滴（子pL 体积）。用于单细胞聚合酶链式反应（PCR)的以乳液为基础的方法已被广泛接受，并且乳液 PCR为许多下一代测序方案中发现的稳健且可靠的程序。但是，乳滴中极高通量RT-PCR还 未实现，因为液滴内的细胞裂解物抑制逆转录酶反应。RT-PCR的细胞裂解物抑制可通过稀 释到合适体积来减轻。
[0056] 在另一实施方案中，细胞裂解于含有用于核酸捕获的珠粒的乳滴中。在某些实施 方案中，珠粒可与寡核苷酸缀合。在某些实施方案中，寡核苷酸可为Poly(T)。在其它实施 方案中，寡核苷酸可为对所关注的转录物特异的引物。在某些实施方案中，珠粒可为磁性 的。具有细胞和珠粒两者的悬浮液的水溶液通过将含水细胞/珠粒悬浮液注射到油相的快 速移动流中来乳化到油相中。移动油相所产生的剪切力在含水悬浮液注射到流中时产生液 滴，产生具有低液滴大小分散性的乳液。每个细胞与缀合有寡核苷酸的一些珠粒一起在它 自己的液滴中。液滴大小的均匀性有助于确保单独液滴不含有多于一个细胞。然后将细胞 热裂解，并且将混合物冷却以允许珠粒捕获mRNA。将乳液破乳，并且收集珠粒。将珠粒重悬 浮于乳液OE RT-PCR的溶液中以将所关注的转录物的cDNA连接在一起。根据本公开进行 巢式PCR和连接的转录物的测序。在某些实施方案中，细胞的含水悬浮液包含逆转录试剂。 在某些其它实施方案中，细胞的含水悬浮液包含聚合酶链式反应和逆转录酶聚合酶链式反 应试剂中的一种。在其它实施方案中，限制和连接可用于连接所关注的多转录物的cDNA。 在其它实施方案中，重组可用于连接所关注的多转录物的cDNA。
[0057] 在另一实施方案中，含有单个细胞和RT-PCR试剂的乳滴通过注射到快速移动油 相中形成。然后直接对这些液滴进行热循环。在某些实施方案中，重叠延伸逆转录聚合酶 链式反应可用于连接所关注的多转录物的cDNA。
[0058] 在另一实施方案中，单细胞的所关注的cDNA经由RT-PCR附接到如下文所述的珠 粒上，并且使用高通量测序直接测序珠粒上的转录物。三种功能化寡核苷酸引物的等量混 合物可缀合到功能化珠粒。一种寡核苷酸可为poly(T)以捕获mRNA的poly(A)尾。其它 两种寡核苷酸可为用于扩增所关注的转录物的特异性引物。以这种方式制备的珠粒与水溶 液中的细胞混合，并且将细胞/珠粒悬浮液乳化，以使得每个细胞与过量珠粒一起在它自 己的液滴中。在某些实施方案中，每个液滴可含有平均55个珠粒。将细胞热裂解，并且珠 粒上的poly (T)寡核苷酸结合mRNA。将乳液破乳，并且将珠粒收集、洗涤，并且重悬浮于具 有用于RT-PCR的试剂和引物的溶液中，所述RT-PCR将导致所关注的转录物以转录物附接 到珠粒的这种方式的扩增。将珠粒悬浮液乳化，并且进行RT-PCR。将珠粒收集并用于进行 高通量测序，所述高通量测序使用至少两个不同引物通过起始多次序列读取直接测序附接 到珠粒的两个转录物，其中每一起始引物对所关注的转录物为特异的。两个转录物通过高 通量测序网格中的珠粒位置配对，显示从单细胞一起表达的序列。测序可在例如Applied Biosystem 的 SOLiD 平台、Life Technologies 的 Proton Torrent 或 Illumina 的 HiSeq 测 序平台上进行。
[0059] OE RT-PCR的引物设计确定给定细胞表达的哪些所关注转录物连接在一起。例如， 在某些实施方案中，可设计引起VH和VL链转录物的相应cDNA共价连接在一起的引物。连 接cDNA的测序显示单细胞表达的VH和VL序列对。在其它实施方案中，还可设计引物组， 以使得可确定单个细胞中表达的TCR对的序列，或以使得可确定是否细胞群体共表达任何 两个所关注的基因。
[0060] 偏差可为使用多扩增引物的PCR反应中的显著问题，因为引物效率中的小差异由 于PCR的指数特性而产生大的产物差别。减少引物偏差的一个方式为通过用同一引物扩增 多基因，这在多重引物组的情况下通常是不可能的。通过将公共扩增区纳入到所关注的多 独特引物的5'端，从而将公共扩增区在第一复制事件期间添加到所有PCR产物的5'端。在 起始复制事件之后，扩增通过仅在公共区引发来实现以减小引物偏差并且允许最终PCR产 物分布保持代表原始模板分布。
[0061] 这种公共区可以各种方式采用。一个清楚的应用为添加以较高浓度的公共扩增引 物和以低浓度的独特引物（具有5'公共区），以使得大多数核酸扩增针对减小的扩增偏差 经由公共序列发生。另一应用为扩增产物的以表面为基础的捕获，例如在乳液PCR期间将 PCR产物捕获到微型珠粒上。如果公共序列寡核苷酸固定到珠粒表面上，则所关注的PCR产 物将在扩增期间变成共价连接到珠粒。以这种方式，广泛多样的一组转录物可使用单固定 化寡核苷酸序列捕获到表面上。
[0062] 例如，两个不同的公共区可以相同浓度固定到珠粒表面上（例如，一个公共序列 用于重链，并且不同的公共序列用于轻链）。在PCR扩增之后，珠粒将包覆有大致50%重链 扩增产物，和50%轻链扩增产物。珠粒表面上重链与轻链代表之间的这种平衡有助于确保 当珠粒进行高通量测序时重链和轻链的信号足够。
[0063] 因此，在某些实施方案中，本公开提供包括以下的方法：将公共序列添加到对一组 基因靶标特异的两个或更多个寡核苷酸的5'区；以及通过引发公共序列进行所述组基因 靶标的核酸扩增。在某些实施方案中，公共序列η固定到表面上。在其它实施方案中，公共 序列可用于捕获扩增产物。