通过rna原位杂交检测免疫球蛋白轻链限制性的制作方法

通过rna原位杂交检测免疫球蛋白轻链限制性的制作方法
【专利说明】通过RNA原位杂交检测免疫球蛋白轻链限制性
[0001] 本申请主张2013年3月15日提交的美国申请序列号No. 13/843408的优先权，和 2012年4月5日提交的美国临时申请序列号No.61/620634的优先权，和2012年10月22 日提交的美国临时申请序列号No. 61/717064的优先权，它们中的每一篇的全部内容作为 参考并入本文。
[0002] 本发明是在国家癌症学会（National Cancer Institute)授予的基金号 R43CA168019的政府支持下进行的。政府对本发明具有一定的权利。
【背景技术】
[0003] 本发明总体上涉及原位杂交测定，并且更具体地涉及用于诊断B细胞肿瘤的测 定。
[0004] 免疫球蛋白由两条重链和两条轻链组成。在B细胞分化期间，编码免疫球蛋白基 因的DNA经历重排以产生个体免疫系统可用的具有较大多样性的可能免疫球蛋白的免疫 球蛋白域的独特组合。每种成熟B细胞表达不同的免疫球蛋白域的组合。存在两类轻链， 分别表示为κ和λ。在B细胞成熟期间，所发生的DNA重排导致每种成熟B细胞表达具有 κ轻链或λ轻链中任一种的免疫球蛋白。因此，在给定分化的B细胞中，B细胞将表达κ 轻链或λ链中的一种。在正常哺乳动物生物体中，所述生物体将具有单独表达κ或λ轻 链中一种的B细胞群体，但是作为群体，其将具有κ和λ轻链表达细胞的混合。这种细胞 群体被认为是多克隆的。
[0005] 赘生性细胞的特征在于无限制的细胞生长。就B细胞肿瘤来说，肿瘤B细胞的无 限制细胞生长导致产生了包括相同细胞多个拷贝的群体B细胞。由于成熟B细胞通常表达 κ或λ轻链中的一种，因此肿瘤B细胞群体将显示出相同细胞的多种拷贝的特征，以及因 此仅表达κ链或仅表达λ轻链的细胞的多种拷贝的特征。这种含有相同细胞的多个拷贝 的群体被认为是克隆的，并且克隆性的特征在于赘生性细胞的异常细胞生长。
[0006] 因此，克隆性扩增（clonal expansion)是B细胞恶性肿瘤的标志之一，并且最常 表示为免疫球蛋白（Ig)轻链（κ或λ中的任一种）的限制性表达（Cook, "Molecular Hematopathology, "Tubbs&Stoler 主编，Cell and Tissue Based Molecular Pathology, Churchill Livingstone ElsevierQOOS))。]^轻链限制性（LCR)的临床实验室 检测是分化诊断（包括淋巴增生、非典型淋巴增生、慢性炎症和B细胞肿瘤）中有帮助的辅 助工具（Cook，如上，2008 ;Taylor, Applied Immunohistochem.Mol.Morphology 17:470 -482 (2009a) ；Taylor, Applied Immunohistochem. Mol. Morphology 17:366 - 374(2009b))〇
[0007] 通过免疫组织化学和常规显色原位杂交（CISH)的LCR鉴定对于表达大量κ或 AmRNA和细胞质免疫球蛋白的B细胞肿瘤来说是可行的（Beck等人，Diagnostic Mol. Pathol. 12:14 - 20(2003))。在福尔马林固定的石蜡包埋的（FFPE)组织中，浆细胞骨髓瘤 LCR几乎总是可行的。但是仅非霍奇金氏淋巴瘤（NHL)的罕见亚型（少数具有大量Ig mRNA 和蛋白质表达）是通过这些传统方法可评价的（Beck等人，如上，2003)。相反，在所有NHL 亚型的绝大部分中，放射自显影原位杂交足够灵敏以检测极低水平的轻链mRNA (Segal等 人，Diagnostic Mol. Pathol. : Am. J. Surg. Pathol.，part B, 3:170 - 177 (1994)，所述亚型 包括最常见的NHL变体-滤泡性淋巴瘤、弥漫性大B细胞淋巴瘤、小B淋巴细胞性淋巴瘤和 MALT型结外边缘区淋巴瘤。但是，放射自显影信号需要两周或更长时间来显影（Segal等 人，如上，1994)，对于临床控制来说，这种延迟是不可接受的。
[0008] 因此，需要用于良性和癌性B细胞样品鉴定的精确并且快速的测定。本发明满足 了这种需要并且也提供了相关优势。
[0009] 发明概述
[0010] 本发明提供了用于检测B细胞中免疫球蛋白轻链限制性和克隆性的方法。所述方 法可以包括以下步骤：从受试者获得B细胞样品；利用（i)设计为特异性杂交至免疫球蛋 白κ链恒定区（IGKCR) RNA的至少一种探针组；和（ii)设计为特异性杂交至免疫球蛋白λ 链恒定区（IGLCR)RNA的至少一种探针组对所述样品进行双重原位杂交测定；检测样品中B 细胞群体中与杂交的IGKCR探针有关的信号和与杂交的IGLCR探针有关的信号；和确定B 细胞群体中单个细胞内与杂交的IGKCR探针和杂交的IGLCR探针有关的信号模式，其中单 个细胞中的信号模式表明存在或不存在B细胞的轻链限制性和克隆性。
[0011] 在另外的实施方式中，本发明提供了检测B细胞中免疫球蛋白轻链限制性和克隆 性的方法。所述方法可以包括以下步骤：从受试者获得B细胞样品；利用（i)设计为特异 性杂交至免疫球蛋白κ链恒定区（IGKCR)RNA的至少一种探针组；（ii)设计为特异性杂交 至免疫球蛋白λ链恒定区（IGLCR)RNA的至少一种探针组；和可选地（iii)设计为特异性 杂交至免疫球蛋白λ样多肽5 (IGLL5) RNA的至少一种探针组对所述样品进行一种或多种 原位杂交测定；检测样品中B细胞群体中与杂交的IGKCR探针有关的信号、与杂交的IGLCR 探针有关的信号和与杂交的IGLL5探针有关的信号；和确定B细胞群体中单个细胞内与杂 交的IGKCR探针、杂交的IGLCR探针和杂交的IGLL5探针有关的信号模式，其中单个细胞中 的信号模式表明存在或不存在B细胞的轻链限制性和克隆性。
【附图说明】
[0012] 本专利或专利申请文件包含至少一幅彩图。索取需支付必要的费用，专利局将提 供带有彩图的本专利或专利申请公开文本的复本。
[0013] 图IA和图IB示出了原位杂交测定的实例，其示出了 K-限制性（模式1，图1Α， 左侧部分）和λ-限制性（模式2,图1Β，右侧部分）中明显的限制性轻链表达，其中在所 述肿瘤细胞中表达了两条轻链中的一条。
[0014] 图2示出了原位杂交测定，其中检测了 κ (左侧部分）和λ (右侧部分）信号两 者。
[0015] 图3Α-图3C示出了原位杂交测定，其中检测了 κ和λ信号两者。图3Α示出了 κ染色，而图3Β示出了 λ染色。图3C示出了用RNA酶A的处理和λ探针的使用。
[0016] 图4示出了编码IgA轻链的区域中人染色体22的一部分的示意图。
[0017] 图5Α-图示出了用λ和IGLL5探针的组织切片染色。图5Α和图5Β分别示出 了用λ和IGLL5探针的相邻组织切片的染色。图5C和图分别示出了使用λ和IGLL5 探针，通过荧光或显色测定检测的双重测定。
[0018] 图6示出了 B细胞淋巴瘤的原位杂交测定，其中κ和λ信号存在于相同细胞中。 用κ (左上部分）、λ (右上部分）、IGLL5(左下部分）染色组织样品，或用κ (DAB，棕色染 色）和λ (固红，红色染色）的双重染色（右下部分）。
[0019] 图7示出了原位杂交测定，其显示了不同细胞中的K和λ信号。用K (用De印 Space Black染色，黑色染色）和λ (固红，红色染色）探针进行双重染色。
[0020] 图8示出了基于κ、λ和IGLL5mRNA表达模式确定轻链限制性的示意图。数字 1-5对应于5种所观察的表达模式。
[0021] 图9示出了用于检测靶核酸，如免疫球蛋白κ轻链恒定区（IGKCR)mRNA、免疫球蛋 白λ链恒定区（IGLCR)mRNA或者免疫球蛋白λ样多肽5(IGLL5)的示例性探针构造。
[0022] 发明详述
[0023] 本发明涉及用于检测B细胞的免疫球蛋白轻链限制性和克隆性的方法。本发明所 述的方法提供了对于鉴定肿瘤B细胞有用的高灵敏度测定。本发明所述的方法还能够用于 区分和鉴定通常使用常规免疫球蛋白轻链限制性分析被鉴定为良性的肿瘤B细胞。因此， 本发明所述的方法能够用于诊断应用中，从而对B细胞肿瘤评价的诊断测定的有效性提供 更大的信心。
[0024] 已开发了 被称为 RNAscope? 的 RNA ISH 技术平台（Advanced Cell Diagnostics, Inc. ;Hayward CA)，其具有单分子灵敏度，能够多重检测并且适合于福尔 马林固定和石蜡包埋（FFPE)的组织（参见，例如，Masand等人，5:108 - 116(2011); Ukpo 等人，Am. J. Surg. Pathol. 35:1343 (2011) ;Wang 等人，J. Mol. Diagnostics 14:22 - 29(2012))。RNAscope?代表了分子形态中的重大技术进步，并且在诊断病理学中提供了 多种应用，特别是那些必须检测极低水平的mRNA的基于组织切片的测定。如本文所公开 的，将RNAscope?用于B细胞中的轻链限制性（LCR)检测并且发现其提供了优于先前的 LCR分析方法的结果和灵敏度。如本文进一步所公开的，RNAscope?.在LCR检测中的应用 产生了比简单的κ和λ链限制性更复杂的染色模式。这些模式的分析允许开发用于准确 确定B细胞的LCR，并因此确定其克隆性的测定和解释算法（interpretation algorithm) (参见实施例）。
[0025] 免疫系统肿瘤是多种细胞来源的肿瘤的异质组。非霍奇金淋巴瘤（NHL)是免疫系 统肿瘤的最大的单个组。就B细胞肿瘤来说，肿瘤的特征取决于肿瘤类型，其包括与肿瘤有 关的B细胞发展阶段。肿瘤源细胞可以与B细胞发展阶段有关并且通常是骨髓B细胞、卵 泡B细胞或免疫母细胞B细胞（参见Cecil Textbook of Medicine，第20版，Bennet和 Plum 主编，WB Saunders, Philadelphia PA(1996) ;Harrison, s Principles of Internal Medicine,第 14 版，Fauci 等人主编，McGraw-Hill, New York (1998))。基于分级（根据 5 年存活率），将B细胞淋巴瘤可被分类并且包括（例如）低级别淋巴瘤，如小淋巴细胞淋巴 瘤（SLL)、滤泡性小裂细胞淋巴瘤（FSCL)、滤泡性小裂细胞与大细胞混合性淋巴瘤（FML)和 粘膜相关淋巴组织（MALT);中级别淋巴瘤，如滤泡性大细胞型淋巴瘤（FLCL)、弥漫性小裂 细胞淋巴瘤（DSCL)、弥漫性小裂细胞与大细胞混合型淋巴瘤（DML)、弥漫性大细胞型（裂或 无裂）淋巴瘤（DLCL);和高级别淋巴瘤，如大细胞免疫母细胞型淋巴瘤（IBL)和小无裂细 胞型（伯基特和非伯基特）淋巴瘤（SNCL)。
[0026] 建立B淋巴细胞增殖的克隆性通常是通过证实单一种类的重链和/或轻链细胞 表面免疫球蛋白来实现的。在DNA水平，可以通过单一免疫球蛋白基因重排的存在确认克 隆性。在缺乏表面免疫球蛋白的前体B淋巴细胞肿瘤中，基因重排研宄是证实克隆性所必 需的。用于建立克隆性的常规测定法包括流式细胞术和/或基于免疫球蛋白或其他细胞 表面标志物的表面表达的免疫组织化学或者核酸基检测测定，如原位杂交或聚合酶链反应 (PCR)测定。如本文所讨论的，B淋巴细胞克隆性的一个标志是κ或λ轻链中一种的表达 的限制性。本发明涉及能够高度准确和快速检测免疫球蛋白轻链限制性的极敏感的原位杂 交测定的使用，其能够被用于B细胞肿瘤的诊断中。
[0027] 本发明的测定在临床应用，尤其是在B细胞肿瘤中是有用的。如本文所述，通过本 发明的测定和算法对LCR和B细胞克隆性的准确确定对于确诊B细胞增殖性疾病是有用 的，从而使得能够将B细胞肿瘤（克隆B细胞群体）与良性B细胞增殖性疾病（多克隆） 相区分。本发明所述的方法在将通常将鉴别为阴性或不确定的含有明显多克隆B细胞染色 模式的样品与含有具有κ和λ染色两者的单克隆细胞（即肿瘤细胞）的样品区分中是尤 其有益的。
[0028] 此外，本发明另外提供了用于区分具有潜在临床意义的多种κ / λ /IGLL5表达的 先前未识别模式（pattern)的测定和算法。已表明如通过流式细胞术确定的双轻链蛋白质 表达与侵袭性B细胞淋巴瘤有关（Fujiwara等人，Internal Med. 46:1458 - 1461 ((2007)) 〇 有可能的是κ / λ/IGLL5mRNA表达的不同模式是可能具有不同预后和/或对疗法的反应的 B细胞淋巴瘤的不同亚型的生物标志物。因此，本发明所述的方法可以用于鉴定B细胞淋巴 瘤的亚型和/或预测或监控对B细胞淋巴瘤疗法的反应。
[0029] 如本文所使用的，术语"核酸"，或者可替代地，术语"多核苷酸"是指核苷酸单体 单元的聚合物，如本领域技术人员公知的。示例性核酸包括例如DNA和RNA，其包括mRNA、 siRNA、hnRNA、基因组DNA、cDNA或核酸的其他公知形式。核酸或多核苷酸可以含有天然存 在的核苷酸，其包括公知的天然存在的核苷酸修饰，和非天然存在的核苷酸，如通过化学合 成制备的那些。这些修饰包括但不限于肽核酸（PNA)、修饰的寡核苷酸，例如，包含对于生 物RNA或DNA非典型的核苷酸的寡核苷酸，如2' -O-甲基化寡核苷酸等。多核苷酸的核苷 酸可以是脱氧核糖核苷酸、核糖核苷酸或核苷酸类似物，可以是天然的或非天然的，并且可 以是未取代的、未修饰的、取代的或修饰的。所述核苷酸可以通过磷酸二酯键或通过硫代磷 酯键、膦酸甲酯键、硼烷磷酸酯键等连接。所述多核苷酸另外可以包含非核苷酸成份，如标 记物、猝灭剂、保护基团等，如本文所公开的。所述多核苷酸可以是单链的或双链的。
[0030] 如本文所使用的，"核酸靶标"或"靶核酸"是指待检测的核酸或其区域。通过本 发明的方法，本领域技术人员能够容易地确定期望检测的靶核酸。如本文所述，本发明涉 及检测B细胞中免疫球蛋白轻链限制性和克隆性的方法。在本发明所述的方法中，靶核酸 通常是免疫球蛋白κ链恒定区（IGKCR)mRNA、免疫球蛋白λ链恒定区（IGLCR)mRNA和/ 或免疫球蛋白λ样多肽5(IGLL5)。利用公知的探针设计方法和公共数据库中可用的序 列，本领域技术人员能够容易地设计适合于检测IGKCR、IGLCR和/或IGLL5的探针。示例 性IGKCR序列可以在GenBank登录号No. AF026381. I (GI :3169769)中找到。示例性IGLCR 序列可以在 GenBank 登录号 No. U07991. I (GI :468246)和 HF541912. I (GI :444737700)中 找到。示例性 IGLL5 序列可以在 GenBank 登录号 No. NM_001178126. I (GI :295986607)和 匪_001256296.1(61:372466585)中找到。161(〇?、161^〇?和/或161^5的其他示例性序列可 在公共数据库，如NCBI的GenBank或EMBL中获得，并且也可以使用它们。如果需要，探针 可以考虑B细胞发育期间发生的DNA重排，包括特定外显子中探针的选择。
[0031] 如本文所使用的，"标记物"是有利于分子检测的部分。在本发明的背景中，常规 的标记物包括荧光、发光、光散射和/或比色标记物。适合的标记物包括酶，和荧光和显色 部分以及放射性核素、底物、辅因子、抑制剂、化学发光部分、磁性颗粒等。在本发明具体 的实施方式中，标记物是酶。示例性酶标记物包括（但不限于）辣根过氧化物酶（HRP)、 碱性磷酸酶（AP)、B-半乳糖苷酶、葡萄糖氧化酶等以及多种蛋白酶。其他标记物包括 但不限于荧光团、二硝基苯酚（DNP)等。标记物对于本领域技术人员来说是公知的，如， 例如，在 Hermanson, Bioconjugate Techniques, Academic Press, (1996)以及美国专利 No. 3, 817, 837 ;3, 850, 752 ;3, 939, 350 ;3, 996, 345 ;4, 277, 437 ;4, 275, 149 和 4, 366, 241 中所述的。多种标记物是可商购的并且可以在本发明的方法和测定中使用，其包括可 检测的酶/底物组合（Pierce，Rockford IL ;Santa Cruz Biotechnology, Dallas TX; Invitrogen, Carlsbad CA)。在本发明具体的实施方式中，酶能够利用显色或焚光底物以产 生可检测信号，如本文所述的。
[0032] 如本文所使用的，"原位杂交"或"ISH"是指使用直接或间接标记的互补DNA或RNA 链（如探针）以结合至或定位样品，具体地组织的部分或切片中特定核酸的一种杂交（原 位）。探针的类型可以是双链DNA(dsDNA)、单链DNA(ssDNA)、单链互补RNA(sscRNA)、信使 RNA(mRNA)、微小RNA(miRNA)和/或合成寡核苷酸。术语"荧光原位杂交"或"FISH"是指使 用荧光标记物的一类ISH。术语"显色原位杂交"或"CISH"是指使用显色标记物的一类ISH。 ISH、FISH和CISH方法对于本领域技术人员来说是公知的（参见，例如，Stoler，Clinics in Laboratory Medicine 10 (1):215-236 (1990) ； In situ hybridization.A practical approach, Wilkinson 主编,IRL Press, Oxford(1992) ；Schwarzacher and Heslop-Harrison, Practical in situ hybridization, BIOS Scientific Publishers Ltd, Oxford(2000)) 〇
[0033] 如本文所使用的，短语"免疫球蛋白轻链限制性"是指