B细胞中K或λ轻链的 表达。随着B细胞成熟并经历DNA重排以产生特定免疫球蛋白，轻链的表达变得限于κ 或λ中的一种，但是不能表达两者。免疫球蛋白轻链限制性对于本领域技术人员来说是 公知的，尤其是在血液病理学和B细胞肿瘤诊断领域中（参见，例如，Knowles, Neoplastic Hematopathology,第二版，Lippincott ffilliams&ffilkins, Philadelphia PA(2001)； Lehmen 等人，Am. J.Pathol. 159:2023-2029 (2001) ;Arber，J.Mol.Diagnsotics 2:178-190 (2000) ;Plank 等人，Am. J. Clin. Pathol. 103:330-337 (1995))。LCR 被广泛认为 是B细胞淋巴瘤的标志，但是在少数B细胞肿瘤病例中已报道了非限制性轻链表达的存在， 即在相同 B 细胞中表达 κ 和 λ 链两者（Xu, Arch. Pathol. Lab. Med. 130:853 - 856(2006))。
[0034] 如本文所使用的，术语"克隆"是指通过从单一细胞的细胞分裂产生的一组细 胞。如本文所使用的，当用于表示B细胞时，术语"克隆性"是指通过从亲代B细胞的 细胞分裂产生的B细胞群体。克隆性的检测是血液病理学领域中确定肿瘤B细胞的 标准工具。B细胞克隆性的检测对于本领域技术人员来说是公知的，尤其是在血液病 理学和B细胞肿瘤诊断领域中（参见，例如，Knowles, Neoplastic Hematopathology, 第二版，Lippincott ffilliams&ffilkins, Philadelphia PA(2001) ;Lehmen 等人，Am. J.Pathol. 159:2023-2029(2001) ;Arber，J. Mol. Diagnsotics 2:178-190(2000) ;Plank 等 人，Am. J. Clin. Pathol. 103:330-337(1995))。
[0035] 如本文所使用的，短语"信号模式（pattern of signal) "是指如通过可检测信号 所测量的细胞群体中可观察的特征。在本发明检测核酸的方面中，信号与核酸检测方法有 关，例如，本文所公开的标记物。如本文所述，细胞群体内可测量的和独特的信号模式能够 用于和B细胞群体的正常或肿瘤表型相关联。
[0036] 在一种实施方式中，本发明提供了用于检测B细胞中免疫球蛋白轻链限制性和克 隆性的方法。所述方法可以包括以下步骤：从受试者获得B细胞样品；利用（i)设计为特 异性杂交至免疫球蛋白κ链恒定区（IGKCR)RNA的至少一种探针组；和（ii)设计为特异性 杂交至免疫球蛋白λ链恒定区（IGLCR)RNA的至少一种探针组对所述样品进行双重原位杂 交测定；检测样品中B细胞群体中与杂交的IGKCR探针有关的信号和与杂交的IGLCR探针 有关的信号；和确定B细胞群体中单个细胞内与杂交的IGKCR探针和杂交的IGLCR探针有 关的信号模式，其中单个细胞中的信号模式表明存在或不存在B细胞的轻链限制性和克隆 性。
[0037] 如本文所公开的，本发明所述的方法使用高灵敏度原位测定来检测B细胞的免疫 球蛋白轻链限制性和克隆性。由于测定的高灵敏度，能够以单个核酸分子水平和以单个细 胞的空间分辨率来测量IGKCR和IGLCR表达。因此，该类测定在鉴别另外可能被忽略并分 类为良性的B细胞克隆性中是适用的，并且在诊断应用中尤其有用。如本文所公开的，已确 定与IGKCR和IGLCR探针以及与IGLL5探针有关的信号模式表明了样品中B细胞的轻链限 制性和克隆性的存在。
[0038] 在一种实施方式中，个体B细胞中仅与杂交的IGKCR探针有关的信号的模式表明 了样品中的κ限制性。尽管该模式先前被理解为表明了 κ限制性，但是本发明所述的方 法提供了低至单个核酸分子水平和单个细胞空间分辨率的高灵敏度检测。在另一种实施方 式中，其中个体B细胞中仅与杂交的IGLCR探针有关的信号的模式表明了样品中的λ限制 性。类似地，尽管该模式先前被理解为表明了 λ限制性，但是本发明所述的方法提供了低 至单个核酸分子水平和单个细胞空间分辨率的高灵敏度检测。
[0039] 在其他实施方式中，在群体内检测单独的B细胞中与杂交的IGKCR探针有关的信 号和与杂交的IGLCR探针有关的信号两者的模式表明样品是多克隆的。尽管该模式先前被 理解为表明了多克隆性，但是本发明所述的方法提供了低至单个核酸分子水平和单个细胞 空间分辨率的高灵敏度检测。在另一种实施方式中，在相同B细胞中与杂交的IGKCR探针 有关的信号和与杂交的IGLCR探针有关的信号两者的模式表明样品是单克隆的。此外，本 发明所述的方法提供了检测单个核酸分子水平和单个细胞空间分辨率上的表达模式的能 力。先前的方法不能实现这种检测，并且在样品中检测了 κ和λ探针两者的情况下，这种 样品将可能被鉴别为阴性多克隆细胞样品，这是因为样品中κ和λ轻链表达两者的检测 是多克隆性，即正常B细胞样品的特征。然而，出人意料地发现使用本发明的高度灵敏的测 定，事实上对λ和κ轻链mRNA表达两者具有阳性信号模式的细胞群体可以是克隆的。因 此，本发明所述的方法能够区分这种假阴性并且能够正确地将样品鉴别为含有克隆的B细 胞群体。因此，本发明提供了能够更准确地诊断和显著除去假阴性或模糊性（ambiguity) 的方法。由于可以在单个核酸分子水平和以单个细胞的空间分辨率测量与κ和λ探针有 关的信号的本发明的极灵敏的测定，这种出人意料的观察结果可以在临床上用于消除假阴 性并分辨（resolve)模糊性。该类方法在诊断人B细胞肿瘤中是尤其有用。
[0040] 在另一种实施方式中，本发明提供了用于检测B细胞中免疫球蛋白轻链限制性和 克隆性的方法。这种方法可以包括以下步骤：从受试者获得B细胞样品；利用（i)设计为 特异性杂交至免疫球蛋白κ链恒定区（IGKCR)RNA的至少一种探针组；（ii)设计为特异性 杂交至免疫球蛋白λ链恒定区（IGLCR)RNA的至少一种探针组；和可选地（iii)设计为特 异性杂交至免疫球蛋白λ样多肽5(IGLL5)RNA的至少一种探针组对所述样品进行一种或 多种原位杂交测定；检测样品中B细胞群体中与杂交的IGKCR探针有关的信号，与杂交的 IGLCR探针有关的信号和与杂交的IGLL5探针有关的信号；和确定B细胞群体中单个细胞 内与杂交的IGKCR探针、杂交的IGLCR探针和杂交的IGLL5探针有关的信号模式，其中单个 细胞中的信号模式表明存在或不存在B细胞的轻链限制性和克隆性。
[0041] 在本发明所述方法的一种实施方式中，可以在连续切片上作为单重反应 (singleplex reaction)进行一种或多种原位杂交测定。在这种情况下，在单独的原位杂交 测定中使用IGKCR、IGLCR和IGLL5探针并且通常在连续切片上单独测量相关信号。可替代 地，IGKCR探针组和IGLCR探针组的杂交可以在相同的原位杂交测定中杂交。尽管可选地 可以在相同的杂交测定中进行包括IGLL5探针组的三重测定，但是通常在其中IGKCR探针 组和IGLCR探针组被杂交的测定的单独原位杂交测定中进行IGLL5探针组的杂交。
[0042] 如本领域所公知的，适合的阴性对照可以可选地包含在杂交测定中。例如，可以使 用至少一种阴性对照探针组进行杂交测定。用于在原位杂交测定中使用的阴性对照的使用 和设计对于本领域技术人员来说是公知的。尤其有用的阴性对照包括特别是不会杂交至鉴 别的B细胞的那些。因此，这种阴性对照可以基于杂交至已知在B细胞中不表达的序列的 探针，例如，组织特异性探针。特别有用的阴性对照将是设计用于完全不同的生物，具体地 非哺乳动物生物，并且更具体地非真核生物，如细菌的探针。本领域技术人员将容易地知道 如何选择适合于原位杂交测定的适合的阴性对照。
[0043] 在使用IGKCR、IGLCR和IGLL5的本发明所述的方法中，所述方法可以用于另外区 分假阴性，并因此提供了比用于检测B细胞克隆性的传统方法更准确的测定。在一种实施 方式中，个体B细胞中仅与杂交的IGKCR探针有关的信号的模式表明了样品中的κ限制 性。如以上所讨论的，这种模式是已知的，但是可以使用本发明的方法以单个核酸分子水平 和以单个细胞的空间分辨率来确定。在另一种实施方式中，个体B细胞中仅与杂交的IGLCR 探针有关的信号的模式表明了样品中的λ限制性。类似地，这种模式是已知的，但是可以 使用本发明的方法以单个核酸分子水平和以单个细胞的空间分辨率来确定。在另一种实施 方式中，检测单独的B细胞中与杂交的IGKCR探针有关的信号和与杂交的IGLCR探针有关 的信号两者的模式表明样品是多克隆的。此外，这种模式是已知的，但是可以使用本发明的 方法以单个核酸分子水平和以单个细胞的空间分辨率来确定。
[0044] 在本发明的其他实施方式中，在相同B细胞中与杂交的IGKCR探针有关的信号和 与杂交的IGLCR探针有关的信号两者的模式表明样品是单克隆的。如以上所讨论的，这种 信号模式的观察结果使得能够区分克隆的，并因此是肿瘤的B细胞群体，使用先前方法将 有可能将所述群体鉴别为多克隆，并因此对于肿瘤细胞是阴性的。因此，本发明所述的方法 区分相同细胞内这种IGKCR和IGLCR杂交的探针的检测模式的能力导致假阴性确定的减少 并产生了更高准确性的测定。
[0045] 如本文所述，本发明所述方法的高灵敏度导致了对于与IGKCR、IGLCR和IGLL5探 针有关的信号模式的其他意外观察结果。这样的观察结果提供了假阴性的进一步减少。在 具体的实施方式中，其中在相同B细胞中存在与IGKCR探针有关的信号和与IGLCR探针有 关的信号两者并且其中与杂交的IGLL5探针有关的信号水平大于或等于与杂交的IGLCR探 针有关的信号水平的模式表明了 κ限制性。这种观察结果是基于以下认识，即在一些情况 中，与λ探针有关的显著信号实际涉及与IGLL5的交叉杂交。由于在非重排的λ基因中 存在IGLL5,因此所述细胞事实上是κ限制性的和克隆的。此外，本发明所述的测定方法的 高灵敏度提供了假阴性的减少。
[0046] 在其他实施方式中，其中在相同B细胞中存在与IGKCR探针有关的信号和与IGLCR 探针有关的信号两者并且其中与杂交的IGLL5探针有关的信号水平小于与杂交的IGLCR探 针有关的信号水平的模式表明了克隆的、非限制性样品。基于本发明测定的高灵敏度，这种 观察结果也是出人意料的并且是可获得的（参见实施例）。如本文所讨论的，将免疫球蛋白 轻链限制性用作B细胞克隆性和肿瘤确定的标志。非限制性B细胞实际上是克隆的观察结 果是出人意料的并且由于其为非限制性实际上是克隆的、非限制性样品因而又提供了可能 已将样品鉴别为阴性的情况。
[0047] 本发明所述的方法使得能够开发用于以更高的准确度水平确定轻链限制性和克 隆性的算法（参见实施例和图8)。简言之，通过本发明的方法分析了样品，所述方法提供了 低至单个分子水平的检测灵敏度和低至单个细胞水平的空间分辨率。这种高灵敏度检测比 先前的方法明显更灵敏，并且对先前未识别的克隆的B细胞群体分层提供了认识，否则所 述克隆的B细胞群体将可能被先前的测定方法鉴别为多克隆的，并因此是良性的。本发明 所述的方法可以用于使单个细胞，并且甚至是细胞内的单个核酸分子显象。就传统B细胞 分析来说，已将κ限制性克隆细胞（图8,模式1)、λ限制性克隆细胞（图8,模式2)和单 独表达κ或λ但作为群体具有κ和λ表达两者的多克隆细胞（图8,模式5)的存在用 于确定B细胞的免疫球蛋白限制性和克隆性。
[0048] 由于本发明所述方法的高灵敏度水平，因此鉴别了先前未观察到的其他模式。这 些其他模式涉及显示出κ和λ两种探针信号的克隆群体，使用先前的测定方法将有可能 将所述群体鉴别为良性的多克隆群体。在单个细胞水平，在相同细胞内观察到了 κ和λ 信号两者（图8,模式3和模式4)。以先前测定较低的分辨率，κ和λ信号两者的存在将 有可能被鉴别为良性的多克隆细胞群体。本发明所述的方法提供了将这些克隆群体与多克 隆群体相区分的能力。在一种模式（模式3)中，发现κ和λ信号的存在是由和免疫球蛋 白样多肽5(IGLL5)的交叉杂交所引起的。该蛋白是由未重排的XDNA所表达的。因此，尽 管该信号对应于杂交的λ探针，但是细胞不表达重排的λ，而实际上是κ限制性的。这可 以通过确定IGLL5和λ的相对表达来区分。在模式3中，以大于或等于λ表达的水平表 达IGLL5,并因此所述细胞群体是κ限制性的和克隆的。
[0049] 另外，使用本发明所述的方法发现了其他表达模式。在该其他模式（模式4)中， 表达了 κ和λ两者。可以通过类似地确定IGLL5和λ的相对表达将该模式与模式3相 区别。在模式4中，低于λ的水平的IGLL5的表达表明与λ探针有关的信号对应于λ表 达。这种表达模式对应于非限制性的克隆的B细胞群体。因此，本发明所述的方法提供了 高灵敏度测定，其可以用于将B细胞群体进一步分层并准确鉴别使用先前已知测定将会被 鉴别为良性的多克隆群体的克隆B细胞群体。因此，作为用于检测免疫球蛋白限制性和B 细胞克隆性的高度准确和高灵敏度的测定，本发明所述的方法是特别有用的，并且所述方 法提供了显著减少的假阴性。
[0050] 本文所公开的使用本发明所述的方法的结果提供了对B细胞肿瘤高灵敏度并且 更准确的评价。本发明所述的方法能够区分并鉴别将可能被分类为阴性多克隆细胞的肿瘤 性克隆B细胞。因此，本发明所述的方法提供了比用于检测B细胞中免疫球蛋白轻链限制 性和克隆性的先前方法更好的结果。因此，本发明所述的方法能够用于B细胞肿瘤的诊断 中。因此，如本文所公开的，本发明提供了使用本发明方法诊断B细胞肿瘤的实施方式。本 发明所述的方法对于评价具有低轻链表达和/或与κ和λ表达有关的信号的本文所述的 意外观察结果的B细胞类型中的肿瘤是特别有用的，使用先前的方法，上述两种情况均将 导致假阴性或未区分的结果。
[0051] 本发明所述的方法对于预测和/或监控用于治疗B细胞肿瘤病况的治疗性结果也 是有用的。基于本发明所述方法的高灵敏度，所述方法可以用于监控疾病发展和/或症状 缓解。由于本发明所述的方法比先前的方法更灵敏，并且可以以单个核酸分子水平和单个 细胞的空间分辨率检测κ和λ信号，因此这可以是特别有用的。由于本发明所述的方法更 灵敏，因此它们对于监控对治疗起反应的疾病逆转可以是特别有用的，这是因为预期肿瘤B 细胞数目将更低。因此，在其他实施方式中，本发明提供了使用本发明方法监控对疗法的反 应的方法。
[0052] 如本文所公开的，用于进行基于原位杂交的本发明的测定的一种方法包 括RNAscope?测定的使用。RNAscope?,原位杂交测定是从Advanced Cell Diagnostics, Inc. (Hayward CA)可商购的。先前已描述了RNAscope?测定，例如，在美 国专利 No. 7709198、美国专利公开 2008/0038725 和 2009/0081688 以及 WO 2007/001986 和 WO 2007/002006中。以下将更详细地描述多个实施方式中的RNAscope?测定。应理解 可以用可商购的RNAscope?,原位杂交测定或如本文所述的该类测定的变化形式进行本 发明的测定。
[0053] 如本文所使用的，术语"标记探针"是指直接或间接结合至靶标分子并且使得靶标 能够被检测的实体。标记探针（或"LP"）含有通常是包含一个或多个直接或间接提供可检 测信号的标记物的单链多核苷酸或寡核苷酸的核酸结合部分。标记物可以共价连接到多核 苷酸，或者可以构造多核苷酸以结合至标记物。例如，生物素化的多核苷酸可以结合抗生蛋 白链菌素-结合的标记物。所述标记探针可以（例如）直接杂交至靶核酸，如IGKCR、IGLCR 或IGLL5,或者它可以杂交至核酸，所述核酸反过来杂交至所述靶核酸或杂交至已杂交至所 述靶核酸的一个或多个其他核酸。因此，标记探针可以包含与靶核酸的多核苷酸序列，具体 的，靶核酸的一部分互补的多核苷酸序列。如本文所述，可替代地，所述标记探针可以包含 与扩增子（amplifier)、预扩增子（preamplifier)、中间复合物等中的多核苷酸序列互补 的至少一种多核苷酸序列。如本文所使用的，包含酶标记物的标记探针是指包含核酸结合 部分（如寡核苷酸）和偶联至所述核酸结合部分的酶或非酶标记物的标记探针。如本文所 公开的，酶或非酶标记物与核酸结合部分的偶联可以是共价的或通过高亲合力结合相互作 用，如生物素/抗生物素蛋白或其他类似的高亲合力结合分子。
[0054] 如本文所使用的，"靶探针"是能够杂交至靶核酸并且将标记探针或中间复合物分 子捕获或结合至该靶核酸的多核苷酸。所述靶探针可以直接杂交至所述标记探针，或它可 以杂交至一种或多种核酸，所述核酸反过来杂交至所述标记探针；例如，靶探针可以杂交至 中间复合物中的扩增子或预扩增子。因此，所述靶探针包括与所述目标核酸的多核苷酸序 列互补的第一多核苷酸序列和与所述标记探针、扩增子、预扩增子等的多核苷酸序列互补 的第二多核苷酸序列。靶探针通常是单链的，从而互补序列可用于和相应的靶核酸、标记探 针、扩增子或预扩增子杂交。
[0055] 如本文所使用的，"扩增子"是能够杂交至多个标记探针的分子，通常是多核苷酸。 通常，所述扩增子杂交至多个相同的标记探针。扩增子还可以杂交至靶核酸、至少一种靶探 针或结合至靶探针的核酸，如预扩增子。例如，所述扩增子可以杂交至至少一个靶探针和多 个标记探针，或结合至前置扩增子和多个标记探针。所述扩增子可以是（例如）线性、分叉、 梳状或分枝核酸。如本文对所有多核苷酸所述的，扩增子可以包括修饰的核苷酸和/或非 标准的核苷酸间键以及标准脱氧核糖核苷酸、核糖核苷酸和/或磷酸二酯键。适合的扩增 子在（例如）美国专利 No. 5, 635, 352、5, 124, 246、5, 710, 264、5, 849, 481 和 7, 709, 198 以 及美国专利公开2008/0038725和2009/0081688中有所描述。
[0056] 如本文所使用的，"预扩增子"是用作一个或多个靶探针和一个或多个扩增子之间 的中间