任选地其中所述多个标记探针包含连接或结合至靶核酸分子不同区的标记探针；和其中每 组标记探针包含不同的酶或非酶标记物并且靶向不同的核酸靶标；通过杂交将两组或更多 组标记探针与样品中的两个或更多靶核酸，例如，至少第一靶核酸和第二靶核酸，或其他的 靶核酸连接或结合；如果酶是标记物，则将样品与第一标记探针组的第一酶的第一底物接 触；将第一底物与第一酶反应，借此产生与第一靶核酸分子有关的第一可检测信号；如果 酶是标记物，则将样品与第二标记探针组的第二酶的第而底物接触；将第二底物与第二酶 反应，借此产生与第二靶核酸分子有关的第二可检测信号；并且检测第一可检测信号和第 二可检测信号，借此检测样品中的第一和第二靶核酸。可替代地，可以使用直接偶联至标记 探针的不同的可检测标记物。
[0072] 图9B显示了使用探针组的本发明的实施方式。如图9B所示，使用了一组标记探 针，其中所述组内的标记探针靶向靶核酸的不同区域。本领域技术人员将容易地理解，尽管 图9B中显示的实施方式显示了标记探针通过中间复合物与靶核酸的结合，但是可以使用 标记探针直接结合至靶核酸的构造。一般地，用于靶核酸的标记探针组将杂交至靶核酸不 相重叠的区域。这使得组内每个标记探针能够彼此独立并且非竞争性地结合，借此使信号 最大化。尽管组内的标记探针结合至靶核酸不同的区域，但是相同的不同的酶或不同的非 酶标记物偶联至组内的每个标记探针。因此，不是通过标记探针结合靶核酸的单个区域，如 图9A中所示，而是将多个标记探针结合至靶核酸。由于相同的不同的酶或不同的非酶标记 物偶联至组中的每个标记探针，因此酶的多个拷贝结合至靶核酸。因此，这种构造可以用于 显著提高与靶核酸有关的可检测信号。
[0073] 如上所述，标记探针组中的标记探针可以直接杂交至靶核酸分子。可替代地，标记 探针可以通过第一和第二中间复合物结合至靶核酸分子（参见图9B)。如本文所述，中间复 合物可以包含含有与靶核酸互补的第一区的分子以及含有与标记探针互补的至少一个第 二区的相同的或另一种分子（参见图9B)。如图9B所示，使用标记探针组提供了与各自靶 核酸有关的提高的可检测信号。
[0074] 在另一种实施方式中，本发明所述的方法可以使用中间复合物，其中所述中间 复合物包含多个分子，而不是单个分子。这种中间复合物对于放大可检测信号，从而 提供靶核酸的高灵敏度检测是特别有用的。用于放大信号的这些方法在（例如）美 国专利 No. 5, 635, 352、5, 124, 246、5, 710, 264、5, 849, 481 和 7, 709, 198,以及美国专利 2008/0038725 和 2009/0081688 以及 TO 2007/001986 和 TO 2012/054795 中有述。
[0075] 在使用中间复合物的一种实施方式中，所述中间复合物可以包含扩增子或预扩增 子。图9C中显示了这种实施方式。具体地，图9C显示了中间复合物，其中使用了扩增子。 通过使用其本身包含靶核酸结合区的扩增子，标记探针的多个拷贝可以通过单个扩增子连 接至靶核酸。尽管在图9C中作为结合至扩增子的两个标记探针显示，但是应理解这仅是示 例性的并且标记探针的多个拷贝可以根据需要结合至扩增子。因此，多个标记探针可以杂 交至一个或多个扩增子。与图9B中所示的实施方式类似，可以使用结合至靶核酸不同区域 的多个扩增子，借此通过结合至标记探针的多个拷贝的每个扩增子提供了甚至更大的信号 放大。就象本文所述的其他实施方式一样，用于靶向特定核酸靶标的标记探针偶联至相同 的酶或相同的不同的非酶标记物。尽管图9C显示了预扩增子的使用，但应理解可以使用其 中扩增子设计直接结合至靶核酸而不使用预扩增子的探针构造。
[0076] 在图9C中所示的另一种实施方式中，中间复合物可以包含扩增子和预扩增子。在 这种构造中，预扩增子包含核酸靶标结合区和用于扩增子的多个结合位点。因此，多个扩增 子可以杂交至预扩增子。此外，扩增子可以包含标记探针的多个结合位点，并且用于特定核 酸靶标的标记探针包含相同的酶或非酶标记物，从而将相同的不同的酶标记物或不同的非 酶标记物与靶核酸相关联。在使用预扩增子的构造中，预扩增子杂交至靶核酸。尽管如下 所述，在图9C中用靶探针进行显示，但是应理解如果需要，可以设计预扩增子从而使其直 接结合至祀核酸。
[0077] 在另一种实施方式中，中间复合物可以包含靶探针、扩增子和预扩增子。图9C中 显示了这种实施方式。与上述实施方式类似，预扩增子与多个结合的扩增子使用，并且多个 标记探针结合至扩增子。然而，不是将预扩增子直接结合至核酸靶标，而是使用了靶探针。 通过使用靶探针，预扩增子不需要具有核酸靶标结合区。相反，靶探针设计包含用于核酸靶 标的结合区。如果使用不止一个靶探针，则可以设计多个靶探针以结合至靶核酸的不同区 域，如图9C所示。在这种构造中，可以通过靶探针而不是设计并产生用于靶向靶核酸不同 区域的不同预扩增子将相同的预扩增子用于多个结合事件。尽管在图9C中以"Z"构造进 行显示，但是应理解可以使用任何适合的构造，只要靶探针包含与靶核酸互补的区域和预 扩增子。此外，应理解可以使用单个靶探针来结合预扩增子，而不是对每个扩增子使用两个 靶探针，如图9C中所示。
[0078] 因此，在具体的实施方式中，中间复合物可以包含靶探针、扩增子和预扩增子（参 见图9C)。另外，多个标记探针可以杂交至一个或多个扩增子，多个扩增子可以杂交至预扩 增子，并且预扩增子可以杂交至靶探针。
[0079] 在另一种实施方式中，可以使用与图9C中所示的类似的构造，其中中间复合物 包含靶探针、预扩增子和扩增子。不使用单一靶探针将预扩增子结合至靶核酸，而是使 用两种或更多种靶探针将预扩增子结合至靶核酸（参见图9C)。一般地，可以使用两个 靶探针（即一对靶探针）将预扩增子结合至靶核酸来实现这种构造的优势。在美国专 利 No. 7, 709, 198、美国专利公开 2008/0038725 和 2009/0081688 以及 WO 2007/001986 和TO2007/002006中描述了这种构造及其提高灵敏度和降低背景的优势。美国专利 No. 7709198和美国专利公开2008/0038725和2009/0081688另外描述了选择靶探针（包括 靶探针对）特征的详细信息，其包括长度、取向、杂交条件等，如以下更详细描述的。
[0080] 如本文所公开的，尽管图中通常显示一种或两种靶核酸的检测，但是应理解这些 方法可以容易地应用于一个靶核酸或两个或更多个核酸靶标，例如，3、4、5、6、7、8、9、10 或甚至更大数目的不同的核酸靶标的多重检测。例如，可以在本发明的方法中进行检测 IGKCR、IGLCR和/或IGLL5mRNA的测定。所需的是作为每个靶核酸的不同的标记物使用的 适合数目的不同的酶或非酶标记物的可用性。因此，本发明所述的方法可以应用于检测样 品中多个核酸靶标，具体地两个或更多个核酸靶标。
[0081] 本领域技术人员应理解使用本发明方法，任何数目的适合样品可以用于检测靶核 酸。在本发明方法中使用的样品通常将是生物样品或组织样品。这种样品可以得自生物 受试者，包括生物组织样品或者采集自个体的体液来源的样品或生物材料的一些其他来源 (如活组织检查）的样品。生物样品还包括含有或怀疑含有癌症前期或癌细胞或组织的生 物受试者区域的样品，例如，活组织检查、骨髓样品或血液样品。这些样品可以是（但不限 于）分离自生物（如哺乳动物，具体地人）的器官、组织、组织部分和/或细胞。对于B细 胞的分析，可以使用含有用于分析的适合数目的B细胞的适当的血液、骨髓或组织样品。这 些样品包括（但不限于）组织切片或骨髓凝块切片。在具体的实施方式中，组织切片或骨 髓切片是福尔马林固定、石蜡包埋的（FFPE)。
[0082] 可以通过用于处理生物样品的任何一些常规方法处理样品或生物样本。例 如，细胞可以作为分离或处理的，例如，作为组织切片或其他组织样本使用，其包括固定 的细胞，如用福尔马林固定和石蜡包埋（FFPE)的组织、新鲜冰冻的组织、白血球等。用 于处理用于原位杂交的组织或细胞样品的方法对于本领域技术人员来说是公知的（参 见，例如，Stoler, Clinics in Laboratory Medicine 10(1):215-236(1990) ;In situ hybridization. A practical approach, Wilkinson,主编 IRL Press, Oxford(1992)； Schwarzacher and Heslop-Harrison, Practical in situ hybridization, BIOS Scientific Publishers Ltd，0xford(2000))。处理用于可能的B细胞肿瘤分析的 样品的方法在临床诊断学和血液病理学领域中是公知的（参见Knowles, Neoplastic Hematopathology,第 2 版,Lippincott ffilliams&ffilkins, Philadelphia PA(2001)； Lehmen 等人，Am. J.Pathol. 159:2023-2029 (2001) ;Arber，J.Mol.Diagnsotics 2:178-190 (2000) ;Plank 等人，Am. J. Clin. Pathol. 103:330-337 (1995)) 〇
[0083] 如本文所公开的，本发明所述的方法提供了检测相同样品中多个靶核酸的方便 的测定方法。除了标记探针与酶或非酶标记物的直接偶联外，在另一种实施方式中，抗体 可以用作中间物来标记靶核酸。先前已描述了同时检测两种DNA靶标的方法，如双色显 色ISH(CISH)测定（US2011/033176)，其中针对两种不同基因的探针与半抗原（如地高辛 (DIG)或二硝基苯基（DNP))结合。然后，抗DIG和抗DNP抗体或者与不同的酶（如辣根过 氧化物酶和碱性磷酸酶）结合的其他适合的抗半抗原抗体用于产生不同颜色的沉淀物。尽 管测定允许两种靶标的显像，但是使用将酶针对靶核酸的抗体发生显像。
[0084] 如本文所公开的，通过使用包含核酸以结合至靶核酸的标记探针，可以通过使用 在硅片中适合的寡核苷酸设计并且通过使用公知的方法选择和控制杂交条件来实现高水 平的特异性和选择性。可以对选择性和特异性优化这种系统，并且最大程度减小核酸靶标 之间的非特异性结合。此外，本发明所述的方法提供了其中通过核酸杂交将不同的酶或非 酶标记物靶向核酸的系统，其中酶或非酶标记物直接偶联至标记探针的核酸部分。尽管本 发明所述的方法可以使用抗体作为中间物将酶靶向核酸，但是在具体的实施方式中，所述 方法使用包含结合至互补核酸序列的核酸部分和酶或非酶标记物的标记探针，其中使用了 酶或非酶标记物与标记探针的核酸部分的直接偶联。
[0085] 本发明另外提供了包含用于进行本发明方法的组分的试剂盒。在一种实施方式 中，本发明提供了用于检测人B细胞中免疫球蛋白轻链限制性和克隆性的试剂盒。试剂 盒可以含有用于进行RNA原位杂交测定的试剂，其包括设计为杂交至免疫球蛋白λ样多 肽5 (IGLL5) RNA的至少一个探针组；和信号放大系统。通常，这种试剂盒将在适合的容器 中提供。在另一种实施方式中，试剂盒还可以包含设计为杂交至免疫球蛋白κ链恒定区 (IGKCR)RNA的至少一个探针组；和设计为杂交至免疫球蛋白λ链恒定区（IGLCR)RNA的至 少一个探针组。可选地，试剂盒还可以包含至少一个阴性对照探针组。在具体的实施方式 中，试剂盒含有用于进行原位杂交测定，如RNAscope?测定的试剂。
[0086] 除上述组分之外，这些试剂盒可以任选地包括（例如）标记探针、扩增子、预扩增 子、靶探针等。对于本文所公开的任何构造，可以设计这些组分。本发明的试剂盒可以（例 如）包含含有不同酶的标记探针和适合于各个酶的显色或荧光底物，或者不同的非酶标记 物以用于实施本发明的方法。试剂盒可以含有非靶标特异性组分，其可以用于检测任何所 需的靶核酸，其中试剂盒的使用者独立设计靶标特异性结合组分，例如，IGKCR、IGLCR和/ 或IGLL5mRNA的探针。可替代地，可以设计试剂盒以包含组分，所述组分包括用于一种或多 种特定靶核酸（如IGKCR、IGLCR和/或IGLL5mRNA)的结合试剂。试剂盒另外可以包括使 用试剂盒组分实施本发明方法的说明书。
[0087] 如本文所述，本发明的实施方式可以包括靶探针的使用。在美国专利 No. 7, 709, 198、美国专利公开 2008/0038725 和 2009/0081688 以及 W02007/001986 和 WO 2007/002006中描述了这种构造及其提高灵敏度和降低背景的优势。No. 7, 709, 198和美 国专利公开2008/0038725和2009/0081688另外描述了选择靶探针（包括靶探针对）特 征的详细信息，其包括长度、取向、杂交条件等。基于美国专利7, 709, 198、美国专利公开 2008/0038725 和 2009/0081688 以及 WO 2007/001986 和 WO 2007/002006 的教导，本领域 技术人员可以容易地鉴别适合的构造。基于本文的公开内容和7, 709, 198、美国专利公开 2008/0038725 和 2009/0081688 以及 WO 2007/001986 和 W02007/002006 的教导，在以下所 提供的说明中，本领域技术人员将理解如在这些参考文献中所使用的和如下文所讨论的， 术语"标记延伸子（label extender) "可以与如本文所述和附图中所示的术语"靶探针"互 换使用。
[0088] 简言之，第一常规类型的实施方式包括检测两个或更多个所关心的核酸的方法。 在所述方法中，样品包含或怀疑包含所关心的核酸、m个标记延伸子的两种或更多种亚型， 其中m为至少2并且提供了标记探针系统。m个标记延伸子的每个亚型能够与所关心的核 酸中的一个杂交。例如，所关心的核酸可以是161(0?、161^0?和/或161^5。标记探针系统 包含标记物，并且标记探针系统的组分能够同时杂交至亚型中的m个标记延伸子中的至少 两个。每个所关心的核酸杂交至其对应的m个标记延伸子的亚型，并且标记探针系统杂交 至m个标记延伸子。然后，检测标记物是否存在。由于通过标记延伸子和标记探针系统的 杂交将标记物与所关心的核酸相关联，因此标记物的存在与否与所关心的并因此在来源样 品中的核酸的存在与否相关。标记探针系统任选地包括预扩增子、放大多聚体和标记探针， 其中预扩增子能够同时杂交至m个标记延伸子中的至少两个并且杂交至多个放大多聚体， 并且其中所述放大多聚体能够同时杂交至预扩增子并且杂交至多个标记探针。
[0089] 如上所述，标记探针系统的组分能够同时杂交至亚型中m个标记延伸子的至少两 个。通常，杂交至两个或更多个标记延伸子的标记探针系统的组分是放大多聚体或预扩增 子。因此，在一个方面，标记探针系统包含放大多聚体或预扩增子，其中放大多聚体或预扩 增子能够杂交至至少两个标记延伸子，并且标记探针系统在杂交温度杂交至m个标记延伸 子，其中杂交温度大于每个单个标记延伸子和放大多聚体或预扩增子之间复合物的熔融温 度Tm。杂交温度通常比Tm高约5°C或以上，例如，比Tm高约7°C或以上，约10°C或以上，约 12°C或以上，约15°C或以上，约17°C或以上或甚至约20°C或以上。
[0090] 每个标记延伸子通常包含与相应所关心的核酸中的多核苷酸序列互补的多核苷 酸序列L-1，和与标记探针系统组分中多核苷酸序列互补的多核苷酸序列L-2。在一类实施 方式中，亚型中m个标记延伸子分别具有L-2的L-I 5'或者分别具有L-2的L-I 3'。L-2 的长度可以是不同的。例如，序列L-2的长度可以是20个核苷酸或更小，例如，L-2的长度 可以在9至17个核苷酸或者12至15个或者13至15个核苷酸。
[0091] 另一常规类型的实施方式提供了使用标记延伸子构造检测一个或多个核酸的方 法。在所述方法中，样品包含或怀疑包含所关心的核酸、m个标记延伸子的一个或多个亚型， 其中m为至少2并且提供了标记探针系统。m个标记延伸子的每个亚型能够与所关心的核 酸中的一个杂交。标记探针系统包含标记物，并且标记探针系统的组分（例如，预扩增子或 放大多聚体）能够同时杂交至亚型中的m个标记延伸子中的至少两个。每个标记延伸子包 含与相应所关心的核酸中的多核苷酸序列互补的多核苷酸序列L-1，和与标记探针系统组 分中的多核苷酸序列互补的多核苷酸序列L-2,并且所述至少两个标记延伸子（例如，亚型 中的m个标记延伸子）分别具有L-2的L-I 5'并且分别具有L-2的L-I 3'。
[0092] 每个所关心的核酸杂交至其对应的m个标记延伸子的亚型，并且标记探针系统在 杂交温度下杂交至m个标记延伸子。杂交温度高于每个单个标记延伸子和标记探针系统组 分之间复合物的熔融温度Tm。由于通过标记延伸子和标记探针系统的杂交将标记物与所关 心的核酸相关联，因此可以确定所关心的核酸存在与否。
[0093] 另一常规类型的实施方式提供了在多重测定中将标记物捕获至所关心的第一核 酸的方法，其中检测了两种或更多种所关心的核酸。在所述方法中，提供了包含所关心的第 一核酸并且还包含怀疑含有一种或多种其他所关心的核酸的样品。还提供了 m个标记延伸 子的第一亚型，其中m为至少2,和包含所述标记物的标记探针系统。m个标记延伸子的第一 亚型能够杂交至所关心的第一核酸，并且所述标记探针系统的组分能够同时杂交至第一亚 型中m个标记延伸子的至少两个。所关心的第一核酸杂交至m个标记延伸子的第一亚型，并 且标记探针系统杂交至m个标记延伸子，借此将标记物捕获至所关心的第一核酸。当相关 时，对上述实施方式提及的基本所有特征也适用于这些方法；例如，相对于标记延伸子的构 造，每个亚型中标记延伸子的数目、标记探针系统的组成、标记物类型、所关心的核酸数目、 样品和/或核酸的来源等。
[0094] 另一常规类型的实施方式提供了将标记物捕获至所关心的核酸的方法。在所述方 法中，提供了 m个标记延伸子，其中m为至少2。m个标记延伸子能够杂交至所关心的核酸。 还提供了包含标记物的标记探针系统。标记探针系统