细胞转染方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及转染细胞的方法。具体地，本发明涉及转染禽类中原生殖细胞的方法， 以及繁殖具有修饰性状的禽类的方法。
【背景技术】
[0002] 用以开发转基因或基因修饰禽类的有效技术的发展对于农业和生物制药产业，以 及通过功能基因组学研宄增加我们对禽类生物学的了解均至关重要。在面临人口增长时， 家禽生产在确保全球食品安全中将扮演重要角色，当今生物技术的进步，例如转基因家禽 的发展将有助于该产业满足增产的需求。
[0003] 更具体地，应用转基因技术修饰家禽中无法通过传统育种获得的性状，例如抗病 性和性别决定调节，如今成为可能，并为家禽产业提供巨大好处。对于生物制药蛋白的需求 迅速增长，直到最近仍在使用基于细胞的体外制造系统，其生产用于疾病治疗的新重组蛋 白。转基因家畜作为重组蛋白生产的生物反应器的应用如今正发展为昂贵且劳动密集的基 于细胞的系统的主要替代。鸡转基因技术的发展使得鸡蛋被开发成用于高水平生产和纯化 生物制药蛋白的生物反应器。
[0004] 也有试图导入选定的外源基因，其通过将所述外源基因克隆入逆转录病毒载体 (例如网状内皮病毒或禽类白血病病毒），将重组病毒注入受精卵，允许病毒感染发育中的 胚胎（例如原生殖细胞）从而建立嵌合性腺或卵细胞，以及使用得到的重组体尝试将外源 基因导入后代。然而养禽业不愿意商业化使用该技术，因为病毒（处于天然状态）是病原 体，甚至不同的复制活性的病毒载体某些时候能引起肿瘤，而复制非活性变体需要较高或 反复的剂量。甚至复制缺陷的病毒构建体也能造成与内源病毒包膜重组从而变成复制活性 的风险。另外，这些载体目前局限于尺寸相对较小（例如2kb或更小）的DNA插入片段。
[0005] 也有试图将外源DNA注入通过手术从母鸡中取出的未发育的受精卵中。然而，该 方法需要将发育的胚胎在一系列代孕容器中孵育。另外，其需要专门的产卵群体（laying flock)和反复的练习以获得所需的手术和技术技能。
[0006] 可替代的方法包括将基因修饰的胚胎细胞或原生殖细胞（PGC)注入产卵后不久 的受体胚胎。在该方法中，生成PCG培养物，其保留了分化成功能性卵细胞或精子的能力， 所述卵细胞或精子在整合入发育的胚胎中时产生细胞。该类型的PCG培养物能被基因修 饰，然后注入受体胚胎。所述受体胚胎通常会通过γ辐照修饰，削弱内源原生殖细胞，从而 给予被注入的细胞定植于性腺嵴的选择优势。被修饰的细胞继而会成熟并产生能够将转基 因传递到至少下一代的精子或卵细胞。然而，该技术因其需要将PGC从供体胚胎中移除，及 其后续培养并重新导入受体胚胎而非常耗时。另外，使用该技术所能获得的包含基因修饰 的PGC的禽类的效率很低。
[0007] 因此，仍有对基因修饰禽类原生殖细胞的方法的需求。
[0008] 发明概述
[0009] 本发明人发现，将与DNA混合的转染试剂直接注入发育的禽类胚胎血液中导致 DNA被导入原生殖细胞（PGC)，并且所述DNA插入所述禽类的基因组。
[0010] 相应地，本发明提供用于产生包含基因修饰的生殖细胞的禽类的方法，所述方法 包含：
[0011] (i)将包含与转染试剂混合的多核苷酸的转染混合物注入禽类胚胎的血管中，由 此所述多核苷酸插入所述禽类中的一或多个生殖细胞的基因组中。
[0012] 在一个实施方案中，所述方法进一步包含（ii)将所述胚胎在足以使所述胚胎发 育成小鸟的温度下孵育。
[0013] 所述转染混合物优选被注入处于约阶段12-17PGC迀移时的禽类胚胎。在一个优 选实施方案中，所述转染混合物被注入处于阶段13-14的禽类胚胎。
[0014] 尽管任意适合的转染试剂均可用于本发明的方法，但优选包含阳离子脂质的转染 试剂。
[0015] 在一个实施方案中，所述转染试剂包含选自如下一或多种的单价阳离子脂质： DOTMA (N-[l-(2, 3-二油酰氧基）丙基]-N，N，N-三甲基氯化铵）、DOTAP (1，2-双（油酰氧 基）-3-3-(三甲基氨）丙烷）、DMRIE (1，2-双十四烷基氧基丙基3-二甲基-羟基乙基铵溴 化物）和DDAB (二甲基双十八烷基溴化铵）。
[0016] 在另一个实施方案中，所述转染试剂包含选自如下一或多种的多价阳离子脂质： DOSPA (2, 3-二油基氧基-N-[2-(精胺羧酰胺）乙基]-N，N-二甲基-1-丙铵三氟醋酸盐） 和DOSPER(1，3-二油酰基氧基-2-(6-羧基精胺基）丙酰胺）、TMTPS (四甲基四棕榈酰精 胺）、TMT0S(四甲基四油烯基精胺）、TMTLS(四甲基四月桂基精胺）、TMTMS(四甲基四肉豆 蔻基精胺）和TMDOS (四甲基二油烯基精胺）。
[0017] 在另一个实施方案中，所述转染试剂包含DOSPA (2，3-二油基氧基-N- [2-(精胺羧 酰胺）乙基]-N，N-二甲基-1-丙铵三氟醋酸盐）。
[0018] 在另一个实施方案中，所述转染试剂进一步包含中性脂质。所述中性脂质可以包 含例如DOPE (二油酰磷脂酰乙醇胺）、DPhPE (二植烷酰磷脂酰乙醇胺）或胆固醇。
[0019] 在一个具体实施方案中，在转染试剂与多核苷酸混合之前，所述转染试剂包含 3:1 (w/w)的 DOSPA 和 DOPE 混合物。
[0020] 有利地，本发明的所述方法适于将多核苷酸导入生殖细胞基因组的非逆转录病毒 方法的应用。因此，在一个实施方案中，所述多核苷酸进一步包含编码转位子或锌指核酸酶 的核苷酸序列。
[0021] 在一个具体实施方案中，所述转染混合物包含编码转座酶的多核苷酸。所述转座 酶可以由诸如质粒中的DNA编码，或者可替代地，编码所述转座酶的多核苷酸是RNA。
[0022] 在一个特定实施方案中，所述转座子选自Tol2、mini_Tol2、Sleeping Beauty和 PiggyBac0
[0023] 在另一个实施方案中，所述多核苷酸包含编码锌指核酸酶的序列。
[0024] 在禽类中被基因修饰的生殖细胞可以是胚胎生殖细胞，优选所述细胞是原生殖细 胞。
[0025] 在一个实施方案中，所述注入混合物被注入蛋壳中的胚胎，所述胚胎在所述蛋壳 中发育。
[0026] 所述转染混合物中的多核苷酸可以是RNA分子或编码多肽的DNA分子，或编码包 含双链区域的RNA的DNA分子。在一个具体实施方案中，所述多核苷酸编码包含双链区域 的RNA。所述RNA分子可以例如是siRNA、shRNA或RNA诱饵（decoy)。
[0027] 在另一个实施方案中，所述多核苷酸编码多肽。
[0028] 在一个实施方案中，与缺少所述RNA分子或多肽的细胞相比，所述RNA分子或多肽 减少病毒在细胞中的复制。
[0029] 本发明的方法可被用于靶向禽类的任意病毒病原体。在一个实施方案中，所述病 毒是流感病毒。
[0030] 本发明进一步提供包含基因修饰的生殖细胞的禽类，其中所述禽类由本发明的方 法产生。
[0031] 本发明进一步提供本发明的禽类的基因修饰的生殖细胞，其中所述生殖细胞包含 插入到基因组中的多核苷酸。
[0032] 本发明进一步提供由包含本发明的基因修饰的细胞的禽类生产的精子。
[0033] 本发明进一步提供由包含本发明的基因修饰的细胞的禽类生产的蛋。
[0034] 本发明进一步提供用于基因修饰禽类中的生殖细胞的方法，所述方法包含：
[0035] (i)将包含与转染试剂混合的多核苷酸的转染混合物注入蛋中含有的禽类胚胎的 血管中；以及
[0036] (ii)将所述胚胎在足以允许所述胚胎发育成小鸟的温度下孵育；
[0037] 其中所述多核苷酸被插入禽类中的一或多个生殖细胞的基因组中。
[0038] 在另一个实施方案中，所述方法包含本文所述发明的一或多个特征。
[0039] 本发明进一步提供了用于产生基因修饰的禽类的方法，所述方法包含：
[0040] (i)获得包含本发明的基因修饰的生殖细胞的禽类；
[0041] (ii)由包含基因修饰的生殖细胞的所述禽类繁殖产生后代；以及
[0042] (iii)选择包含插入到基因组中的多核苷酸的后代。
[0043] 本发明进一步提供由本发明的方法产生的基因修饰的禽类。
[0044] 本发明进一步提供生产食品的方法，所述方法包含：
[0045] (i)获得包含本发明的基因修饰的生殖细胞的禽类或本发明的基因修饰的禽类； 以及
[0046] (ii)由所述禽类生产食品。
[0047] 在一个实施方案中，所述方法包含从所述禽类收获肉和/或蛋。
[0048] 本发明进一步提供了繁殖基因修饰的禽类的方法，所述方法包含：
[0049] (i)实施本发明的方法以产生小鸟或后代；
[0050] (ii)允许所述小鸟或后代发育成性成熟的禽类；以及
[0051] (iii)由所述性成熟的禽类繁殖产生基因修饰的禽类。
[0052] 在一个实施方案中，本发明提供根据本发明的方法产生的基因修饰的禽类。
[0053] 本发明进一步提供调节禽类性状的方法，所述方法包含：
[0054] (i)将包含与转染试剂混合的多核苷酸的转染混合物注入禽类胚胎的血管中，由 此所述多核苷酸插入所述禽类中的一或多个生殖细胞的基因组中；以及
[0055] (ii)将所述胚胎在足以允许所述胚胎发育成小鸟的温度下孵育；
[0056] 其中所述多核苷酸编码调节禽类性状的多肽或包含双链区域的RNA分子。
[0057] 在一个实施方案中，所述RNA分子包含siRNA、shRNA或RNA诱饵。
[0058] 在一个实施方案中，所述性状选自肌肉质量、性别、营养成分和/或抗病性。
[0059] 本发明进一步提供增加禽类对病毒抗性的方法，所述方法包含实施本发明的方 法，其中所述多核苷酸是减少病毒在细胞中复制的siRNA、shRNA或RNA诱饵，或者所述多核 苷酸编码减少病毒在细胞中复制的抗病毒肽。
[0060] 在一个具体实施方案中，所述病毒是流感病毒。
[0061] 本发明进一步提供根据本发明的方法产生的禽类。
[0062] 在本发明的某些实施方案中，所述禽类选自鸡、鸭、火鸡、鹅、矮脚鸡或鹌鹑。
[0063] 在本发明的方法的另一个实施方案中，所述转染混合物进一步包含靶向性核酸 酶，或编码靶向性核酸酶的多核苷酸，以便于所述多核苷酸整合入生殖细胞的基因组。例 如，所述靶向性核酸酶可以选自锌指核酸酶、TALEN和CRISPR。
[0064] 本发明进一步提供用于产生包含基因修饰的生殖细胞的禽类的方法，所述方法包 含：
[0065] (i)将包含与转染试剂混合的多核苷酸的转染混合物注入禽类胚胎的血管中，由 此所述多核苷酸插入所述禽类中的一或多个生殖细胞的基因组中；以及
[0066] (ii)将所述胚胎在足以使所述胚胎发育成小鸟的温度下孵育；
[0067] 其中所述转染试剂包含阳离子脂质，所述多核苷酸进一步包含编码转座子的序 列，并且所述转染混合物被注入处于阶段13-14的禽