类胚胎的血管中。
[0068] 在一个实施方案中，在转染试剂与多核苷酸混合之前，所述转染试剂包含脂质 体（Lipofectamine) 2000或3:1 (w/w)的DOSPA和DOPE混合物，所述转座子是Tol2或 mini-Tol2,所述转染混合物包含编码Το12转座酶的多核苷酸。
[0069] 本发明进一步提供用于产生包含基因修饰的生殖细胞的禽类的方法，所述方法包 含：
[0070] (i)将包含与转染试剂混合的多核苷酸的转染混合物注入禽类胚胎的血管中，由 此所述多核苷酸插入所述禽类中的一或多个生殖细胞的基因组中；以及
[0071] (ii)将所述胚胎在足以使所述胚胎发育成小鸟的温度下孵育；
[0072] 其中所述转染试剂包含阳离子脂质和中性脂质，所述多核苷酸进一步包含编码锌 指核酸酶的序列，并且所述转染混合物被注入处于阶段13-14的禽类胚胎的血管中。
[0073] 在一个实施方案中，在转染试剂与多核苷酸混合之前，所述转染试剂包含脂质体 2000 或 3:1 (w/w)的 DOSPA 和 DOPE 混合物。
[0074] 显而易见的是，本发明一个方面的优选特征和特性可用于本发明的许多其他方 面。
[0075] 遍及本说明书的词语"包含"或其变体应被理解为意指包括所述元件、整数或步 骤，或元件、整数或步骤的组，但并不排除任意其他元件、整数或步骤，或元件、整数或步骤 的组。
[0076] 以下通过下述非限制性的实施例，并参照随后的附图对本发明进行描述。
【附图说明】
[0077] 图1 :将与脂质体2000复合的编码EGFP的DNA直接注入禽类胚胎。从7天胚胎 中取出的性腺的荧光（左边）和匹配的亮视野（右边）图像。
[0078] 图2 :将与脂质体2000复合的编码EGFP的DNA直接注入14天的禽类胚胎。从14 天胚胎中取出的性腺的荧光（右边）和匹配的亮视野（左边）图像。最后一张荧光图像是 来自左手边胚胎中绿色细胞集群的特写。该区域从用鸡vasa同源物（cvh)染色的性腺的 剩余部分分割开。性腺的剩余部分的一小部分用作阴性对照。
[0079] 图3 :将与脂质体2000复合的编码EGFP的DNA直接注入禽类胚胎。对细胞中的 PGC标志物cvh进行染色。DAPI染色示出核酸材料，并对所有细胞染色。PGC特异性标志物 cvh对细胞亚群染色（更亮的灰色细胞）。箭头所指为转化的细胞，其接受经直接注射的转 座子，并被染成绿色。
[0080] 图4 :通过直接注入禽类胚胎确认体外优化。14天胚胎性腺中的EGFP表达。
[0081] 图5 :将与脂质体2000复合的编码EGFP的DNA以及包含编码shRNA的多个序列 的多弹头（multi-warhead)构建体直接注入鸡肉用品系（broiler line)胚胎。来自12天 性腺的荧光图像。
[0082] 图6 :将与脂质体2000复合的编码EGFP的DNA、多弹头构建体和伸展的发夹构建 体直接注入产蛋品系（layer line)鸡胚胎。直接注射后14天胚胎性腺的荧光图像。
[0083] 图7 :将Tol2-EGFP构建体与两个多shRNA表达盒（pMAT084和PMAT085)的每一 个直接注入。14天取出的10个性腺的图像，示出EGFP表达。
[0084] 图8 :筛选PCR产物的凝胶电泳，表明PB shRNA整合入直接注射的胚胎。直接注入 ZFN和修复质粒（含有PB shRNA) 5天后，从来自ZFN处理的胚胎以及来自对照胚胎的PGC 富集的样品中提取DNA。然后进行筛选PCR以检测PB shRNA整合入基因组。泳道1示出 PB注入的胚胎，泳道2为对照胚胎，泳道3为ZFN处理的细胞（阳性对照），泳道4为水对 照。
[0085] 序列表的关键
[0086] SEQ ID NO: I-Tol2 EGFP构建体多核苷酸序列
[0087] SEQ ID NO:2 - Το12转座酶氨基酸序列
[0088] SEQ ID NO:3 - Screen 7 的寡核苷酸引物
[0089] SEQ ID NO:4 - Screen 6 的寡核苷酸引物
[0090] SEQ ID N0:5-miniTol2正向寡核苷酸引物
[0091] SEQ ID N0:6-miniTol2反向寡核苷酸引物
[0092] SEQ ID N0:7-miniTol2 检测探针
[0093] SEQ ID N0:8 -基因组对照区域正向引物
[0094] SEQ ID N0:9-基因组对照区域反向引物
[0095] SEQ ID NO: 10 -基因组对照区域探针
[0096] 发明详述
[0097] 通用抟术和宙义
[0098] 除非其他特别限定，本文所用的所有技术和科技术语应被理解为具有与本领域 (例如，蛋白质化学、生物化学、细胞培养、分子遗传学、微生物学和免疫学）普通技术人员 通常所理解的相同的含义。
[0099] 除非其他另有说明，本发明中所用的重组DNA和蛋白质、细胞培养和免疫学技 术是本领域技术人员熟知的标准程序。所述技术在以下文献中通篇描述和解释，例如 J.Perbal, A Practical Guide to Molecular Cloning, John Wiley and Sons(1984), J. Sambrook et al. , Molecular Cloning:A Laboratory Manual,3rd edn, Cold Spring Harbour Laboratory Press(2001), R. Scopes, Protein Purification - Principals and Practice, 3rd edn, Springer(1994), T. A. Brown(editor), Essential Molecular Biology: A Practical Approach,Volumes I and 2,IRL Press (1991),D.M.Glover and B. D. Hames(editors), DNA Cloning: A Practical Approach, Volumes 1-4, IRL Press (1995and 1996), and F.M. Ausubel et al. (editors), Current Protocols in Molecular Biology, Greene Pub. Associates and Wiley-Interscience (1988,包括至今的 所有更新），Ed Harlow and David Lane (editors)Antibodies:A Laboratory Manual, Cold Spring Harbour Laboratory, (1988)， 以及 J. E. Coligan et al. (editors)Current Protocols in Immunology, John Wiley&Sons(包括至今的所有更新）。
[0100] 本文所用术语"禽类"指分类学上的"鸟纲"中的任意种、亚种或品种的生物体，例 如但不限于如下生物体：鸡、火鸡、鸭、鹅、鹌鹑、野鸡、鹦鹉、雀类、鹰、乌鸦和走禽类（包括 鸵鸟、鸸鹋和食火鸡）。术语包括不同已知品系的原鸡（Gallus gallus)(鸡），例如白色 来亨鸡（White Leghorn)、褐色来亨鸡（Brown Leghorn)、横纹洛克鸡（Barred-Rock)、苏塞 克斯郡鸡（Sussex)、新罕布什尔鸡（New Hampshire)、罗德岛鸡（Rhode Island)、澳洲黑鸡 (Australorp)、米奴加鸡（Minorca)、阿木鸡（Amrox)、加州灰色鸡（California Gray)、意 大利帕特里奇彩色鸡（Italian Partidge-colored)，以及火鸡、野鸡、鹌鹑、鸭子、鸵鸟和其 它通常商业规模饲养的家禽的品种。
[0101] 术语"家禽"包括所有为了肉或蛋的饲养、收获或驯养的禽类，例如鸡、火鸡、鸵鸟、 小母鸡（game hen)、雏鸽、珠鸡、雉鸡、鹌鹑、鸭、鹅和食火鸡（emu)。
[0102] 本文所用"基因修饰的禽类"或"转基因禽类"是指任意禽类，其中所述禽类的一 或多个细胞包含通过人为干涉引入的异源核酸。
[0103] 言接注射抟术
[0104] 鸡中的生殖细胞系在来自阶段X胚胎的外胚层的细胞进入新生内胚层时起 始（Kagami et al·，1997;以及Petitte, 2002)。随着内胚层向前发展，前原生殖细胞 被向前推入生殖新月体，在那里它们可被鉴定为大的充满糖原的细胞。通过这些形态学 标准对生殖细胞系中的细胞的最早鉴定在孵化开始后约8小时（用由Hamburger and Hamilton，（1951)建立的分阶段系统的阶段4)。从阶段4开始直到其在阶段12-17期间迀 移通过脉管系统，原生殖细胞定位于生殖新月体。在这段时间，原生殖细胞为约200个细胞 的小群体。随着性腺分化，原生殖细胞从脉管系统迀移进入性腺嵴，并整合入卵巢或睾丸。
[0105] 之前通过将来自不同发育阶段（囊胚层至20天胚胎）的供体PGC和性腺生殖细 胞移植入受体胚胎，已产生了生殖细胞系嵌合鸡。从禽类原生殖细胞（PGC)的长期培养物 获得转基因鸡的方法也已在例如美国专利申请20060206952有记载。当通过已知程序与宿 主禽类胚胎组合时，这些修饰的PGC经转运通过生殖细胞系以产生基因修饰的后代。
[0106] 与依赖于从供体胚胎中收获PGC的常用的现有技术方法相比，本发明的所述方法 包括将转染混合物直接注入禽类胚胎。因此，本发明的所述方法可用于转染包括PGC和胚 胎生殖细胞的禽类生殖细胞。
[0107] 转染混合物
[0108] 在本发明的方法中，多核苷酸与适合的转染试剂复合或混合。本文所用术语"转 染试剂"是指添加到多核苷酸中的组合物，用于增强所述多核苷酸被包括但不限于禽类细 胞如原生殖细胞的真核细胞的吸收。虽然可以使用本领域已知的适合转染真核细胞的任 意转染试剂，本发明人发现包含阳离子脂质的转染试剂特别适用于本发明的方法。因此， 在一个优选实施方案中，单价阳离子脂质选自如下一或多种：DOTM(N-[1-(2,3-二油酰氧 基）丙基]-^^三甲基氯化铵）、0(7^?(1，2-双（油酰氧基）-3-3-(三甲基氨）丙烷）、 DMRIE (1，2-双十四烷基氧基丙基3-二甲基-羟基乙基铵溴化物）或DDAB (二甲基双十八 烧基溴化按）。优选的多价阳离子脂质为脂精胺（Lipospermine)，特别是DOSPA (2, 3-二 油基氧基-N-[2-(精胺羧酰胺）乙基]-N，N-二甲基-1-丙铵三氟醋酸盐）和DOSPER(1， 3-二油酰基氧基-2-(6-羧基精胺基）丙酰胺），以及二和四烷基四甲基精胺，包括但不限 于TMTPS (四甲基四棕榈酰精胺）、TMTOS (四甲基四油烯基精胺）、TMTLS (四甲基四月桂基 精胺）、TMTMS(四甲基四肉豆蔻基精胺）和TMDOS(四甲基二油烯基精胺）。阳离子脂质任 选地与非阳离子脂质，特别是中性脂质组合，例如