用于使基因表达沉默的组合物和方法
【专利说明】用于使基因表达沉默的组合物和方法
[0001] 发明领域和背景 本发明在其一些实施方案中涉及将dsRNA导入植物种子以调节基因表达的方法。
[0002] 随着世界人口不断增加，对食物、燃料和纤维的需求日益增长以及变化万千的气 候，农业面临着前所未有的挑战。非常需要研发具有改良性状的植物，其中对农民和种子公 司有重大利益的一些主要性状包括改进的非生物胁迫耐受性、肥料使用效率、抗病性、产量 等等。
[0003] 植物性状改良通常通过遗传工程或经典育种进行。非常需要通过特定的基因改变 用于性状改良的新的方法。这些包括用于基因过量表达或基因沉默的方法。序列特异性基 因沉默的一项强大技术是通过RNA干扰（RNAi)。RNAi最早发现于线虫秀丽隐杆线虫（C. elegans) (Fire等1998，yVaitfre，391:806-811)，是其中可通过将与个别基因同源的双链 RNA (dsRNA)导入细胞而使所选基因的表达特异性沉默的一种机制。在细胞内，dsRNA分子 被RNA酶III相关酶（Dicer)切割成21-27个核苷酸的较短片段。这些片段，称为小干扰 RNA (siRNA)，被掺入RNA诱导的沉默复合体（RISC)中。在另外的加工之后，siRNA转化成 单链RNA，用作最终切割目标信使RNA的指导序列。通过使用RNAi使相关目标基因特异性 沉默，可改变生物体的基本性状。特别对于植物，对可能导致高的胁迫抗性和更好的作物产 量的修饰有着不可思议的潜力。
[0004] 在植物中，通常通过产生过量表达经转录产生dsRNA的DNA片段的转基因植物，来 进行RNAi。这种dsRNA随后被加工成介导目标基因切割和沉默的siRNA。
[0005] 这种技术的主要技术限制是许多重要的植物作物种难以或不可能转化，阻碍了 指导dsRNA产生的构建体的组成型表达。而且，有关抗病毒转基因植物的潜在生态影响 的问题迄今为止严重限制了它们的应用[Tepfer, 2002，Annu. Rev. Phytopathol. 40， 467-491]〇
[0006] 获取转基因植物的另一个障碍归因于使转化和再生事件发生在同一细胞类型中 的难度。
[0007] 因此开发用于获取不依赖于组织培养程序固有方法的转化种子的方法是植物分 子生物学研究的前缘。
[0008] 其它【背景技术】包括： 美国20040055041教导了通过利用超声处理系统接着用土壤杆菌感染的种子转化。
[0009] Chee等，1989 Plant Physiol. 91:1212-1218教导了使用含有表达转基因的二元 载体的土壤杆菌接种发芽大豆的胚芽、子叶节和邻近的子叶组织进行的大豆转化。
[0010] 其它的相关【背景技术】：W02011/001434、美国 20080022423、WO 2011112570、WO 2007/080127、WO 2007/080126、美国 20060272049、美国 2010068172、美国 20070250947、 W09926467、美国 20030154508、TO 02/14472、美国 20030150017、美国 201000154083。
[0011] 发明概沭 按照本发明一些实施方案的一个方面，提供将裸dsRNA引入种子的方法，所述方法包 括在允许dsRNA渗透入种子的条件下使种子与裸dsRNA接触，从而将dsRNA引入种子中。
[0012] 按照本发明一些实施方案的一个方面，提供包含外源裸dsRNA的分离种子，其中 种子缺乏驱动dsRNA在植物中表达的异源启动子。
[0013] 按照本发明一些实施方案的一个方面，提供包含外源裸dsRNA的分离种子。
[0014] 按照本发明一些实施方案的一个方面，提供包含以类似浓度存在于种子的胚和胚 乳中的外源dsRNA的分离种子。
[0015] 按照本发明一些实施方案的一个方面，提供包含空间上分布在植物种子的胚和胚 乳中的外源dsRNA的分离种子，其空间分布不同于来源于重组表达外源dsRNA的转基因植 物的种子的外源dsRNA的空间分布。
[0016] 按照本发明一些实施方案的一个方面，提供包含外源dsRNA的分离种子，其中与 重组表达外源dsRNA的转基因种子相比，外源dsRNA与由其成熟的siRNA的浓度比率在所 述种子中较高。
[0017] 按照本发明一些实施方案的一个方面，提供包含外源dsRNA的分离种子，其中植 物种子缺乏驱动外源dsRNA表达的异源启动子，其中与重组表达外源dsRNA的转基因种子 的空间分布相比，外源dsRNA和/或由其成熟的siRNA的空间分布在所述种子中改变。
[0018] 按照本发明一些实施方案的一个方面，提供包含外源裸dsRNA和缺乏驱动dsRNA 在植物中表达的异源启动子的植物或植物部分。
[0019] 按照本发明一些实施方案的一个方面，提供包含大量种子的含种子装置。
[0020] 按照本发明一些实施方案的一个方面，提供包含大量任何种子的播种田（sown field)〇
[0021] 按照本发明的一些实施方案，所述方法还包括在所述接触后将所述种子干燥。
[0022] 按照本发明的一些实施方案，所述方法还包括在所述产生后使所述植物在非生物 胁迫或生物胁迫下生长。
[0023] 按照本发明的一些实施方案，设计裸dsRNA用于减量调节植物基因的表达。
[0024] 按照本发明一些实施方案的一个方面，提供产生植物的方法，所述方法包括： (a) 提供任何种子；和 (b) 使种子萌发以产生植物。
[0025] 按照本发明一些实施方案的一个方面，提供调节基因表达的方法，所述方法包 括： (a) 在允许dsRNA渗透入种子的条件下使植物的种子与裸dsRNA接触，从而将dsRNA 引入种子中；和任选 (b) 产生种子的植物。
[0026] 按照本发明的一些实施方案，设计裸dsRNA用于减量调节植物基因的表达。
[0027] 按照本发明的一些实施方案，设计裸dsRNA用于减量调节病毒病原体基因的表 达。
[0028] 按照本发明的一些实施方案，渗透是进入种子的胚乳并且备选地或另外地进入种 子的胚中。
[0029] 按照本发明的一些实施方案，裸dsRNA不整合到种子的基因组。
[0030] 按照本发明的一些实施方案，所述条件导致在萌发后dsRNA存在于植物中至少10 天。
[0031] 按照本发明一些实施方案的一个方面，提供抑制植物病毒的目标基因的表达的方 法，所述方法包括向植物病毒提供植物或植物部分，从而抑制植物病毒的目标基因的表达。
[0032] 按照本发明的一些实施方案，所述方法还包括在提供后观察病毒病原体可感染性 或可复制性的降低。
[0033] 按照本发明一些实施方案的一个方面，提供将裸dsRNA引入种子中的试剂盒，其 包括； ⑴裸dsRNA;和 (ii)引发溶液（priming solution)。
[0034] 按照本发明的一些实施方案，裸dsRNA和引发溶液装在分开的容器中。
[0035] 按照本发明的一些实施方案，dsRNA包含siRNA。
[0036] 按照本发明的一些实施方案，dsRNA包含siRNA和dsRNA。
[0037] 按照本发明的一些实施方案，接触通过用dsRNA接种种子来实行。
[0038] 按照本发明的一些实施方案，所述方法还包括在接触前引发种子。
[0039] 按照本发明的一些实施方案，所述引发如下实行： (i) 在接触前洗涤种子；和 (ii) 在步骤（i)后将种子干燥。
[0040] 按照本发明的一些实施方案，在双重去离子水存在下实行洗涤。
[0041] 按照本发明的一些实施方案，实行洗涤2-6小时。
[0042] 按照本发明的一些实施方案，洗涤在4_28°C下实行。
[0043] 按照本发明的一些实施方案，洗涤在25_30°C下实行10-16小时。
[0044] 按照本发明的一些实施方案，在终浓度为0. 001-100 μ@/μ1的裸dsRNA存在下实 行接触。
[0045] 按照本发明的一些实施方案，在终浓度为0.001-0. 5 μ8/μ1的裸dsRNA存在下实 行接触。
[0046] 按照本发明的一些实施方案，所述方法还包括在接触后用选自杀虫剂、杀真菌剂、 杀昆虫剂、肥料、涂布剂和着色剂的作用剂处理种子。
[0047] 按照本发明的一些实施方案，所述处理包括用作用剂涂布种子。
[0048] 按照本发明的一些实施方案，种子不含选自杀虫剂、杀真菌剂、杀昆虫剂、肥料、涂 布剂和着色剂的作用剂。
[0049] 按照本发明的一些实施方案，dsRNA用于减量调节编码基因的表达。
[0050] 按照本发明的一些实施方案，dsRNA用于减量调节非编码基因的表达。
[0051] 按照本发明的一些实施方案，种子是绿色植物界（Viridiplantae)总科的。
[0052] 按照本发明的一些实施方案，所述条件允许dsRNA在种子的胚乳中蓄积以及备选 地或另外地在种子的胚中蓄积。
[0053] 按照本发明的一些实施方案，按照选自以下的参数调节裸dsRNA的浓度：种子大 小、种子重量、种子体积、种子表面积、种子密度和种子透性。
[0054] 按照本发明的一些实施方案，接触在打破种子休眠和胚出现之前实行。
[0055] 按照本发明的一些实施方案，种子是经引发的种子。
[0056] 按照本发明的一些实施方案，种子或植物包含扩大dsRNA表达的依赖于RNA的RNA 聚合酶活性。
[0057] 按照本发明的一些实施方案，种子是杂种种子。
[0058] 按照本发明一些实施方案的一个方面，提供按照本文所述方法可获得的种子。
[0059] 除非另有说明，否则本文所用的所有技术和/或科学术语都具有本发明所属领域 普通技术人员通常所理解的相同含义。虽然类似或等同于本文所述方法和材料的方法和材 料可用于本发明实施方案的实践和测试，但下面描述了示例性的方法和/或材料。万一有 冲突，则以本专利说明书，包括定义为准。另外，材料、方法和实施例只是说明性的，不必是 限制性的。
[0060] 附图简沭 本文只通过实例，参照附图描述了本发明的一些实施方案。现具体参照详细的附图， 要强调的是所显示的细节是通过实例并用于说明性论述本发明实施方案的目的。在这一方 面，与附图一起的描述使本领域技术人员明白如何可实施本发明的实施方案。
[0061] 附图中： 图IA-C显示在萌发后直到3周水稻苗中CGMMV的dsRNA的稳定性。图IA :在萌发后1 周，通过RT-PCR鉴定的dsRNA。上图：L一 100 bp DNA梯条带，泳道1-6:未处理对照种子， 7-16:处理种子，泳道17:阴性对照（混合物），泳道18:阳性对照（质粒）。下图用作cDNA 质量的阳性对照，持家基因一微管蛋白的PCR。图IB :在萌发后2周，通过PCR鉴定的dsRNA。 上图：L一DNA梯条带，1-2对照种子，3-12 dsRNA处理种子，13阳性对照（质粒），14-15阴 性对照（DDW)。下图显示微管蛋白持家基因的结果。图1C:在萌发后3周，dsRNA的稳定性。 上图：L一DNA梯条带，1-4对照种子，5-9 dsRNA处理种子，11阳性对照（质粒），12为阴性 对照（混合物）。下图显示微管蛋白持家基因的结果。
[0062] 图2A-B显示分别在萌发后10天和4周，通过RT-PCR对番茄和高粱苗的CGMMV dsRNA的鉴定。图2A:在萌发后10天，CGMMV dsRNA在番茄苗中是稳定的。L一DNA梯条带， 1-4 :对照种子，5-17 :dsRNA处理种子，18-19 :阴性对照（DDW)，20 :PCR阳性对照（质粒）。 图2B :在萌发后4周，CGMMV dsRNA在高粱苗中是稳定的。1-2 :对照种子，3-6 :处理种子， 7 :阴性对照（DDW)。
[0063] 图3显示在萌发后5周，CGMMV来源的dsRNA不整合到处理水稻种子的基因组中。 进行了 3个不同的DNA PCR反应：（1)微管蛋白PCR (泳道1-5) ; 1-2是对照植物，3-4是 dsRNA处理植物，5是阴性对照（ddW)，（2) DNA CGMMV的第一个PCR (泳道6-10) ;6-7是对 照植物，8-9是dsRNA处理植物，10是阳性对照（携带CGMMV序列的质粒），（3) DNA CGMMV 的第二个PCR (泳道11-16) ; 11-12是对照植物，13-14是dsRNA处理植物，15是阴性对照 (ddW)，16是阳性对照（携带CGMMV序列的质粒）。L一 100 bp DNA梯条带。
[0064] 图4A-C显示在萌发后7和15天，通过RT-PCR的玉米苗中⑶S dsRNA的稳定性。 图4A :在萌发后1周，⑶S dsRNA在玉米苗嫩枝中是稳定的。L是DNA梯条带，1-5是对照植 物，6-8和11-18是dsRNA处理植物，9是阴性对照（ddW)，10是阳性对照（质粒）。图4B : 在萌发后1周，⑶S dsRNA在玉米苗根中是稳定的。1-5是对照植物，6-10是dsRNA处理植 物，11是阴性对照（ddW)，12是阳性对照（质粒）。图4C :在萌发后15天，⑶S dsRNA在玉 米苗根中是稳定的。L一DNA梯条带，1是阳性对照（质粒），2是对照植物，3是阴性对照 (ddW)，4是dsRNA处理植物。
[0065] 图5A-B显示在萌发后1周⑶S dsRNA不整合到处理玉米种子的基因组中。上图凝 胶显示对⑶S基因的DNA PCR : 1-3是对照植物，4-6是dsRNA处理植物，7是阳性对照（质 粒）。下图凝胶是用于DNA提取的阳性对照，显示对遍在蛋白基因的DNA PCR:l-3是对照 植物，4-6是dsRNA处理植物，7是阴性对照（ddW)。
[0066] 图6显示实验前siGLO的凝胶电泳分析。L一 100 bp梯条带，1 一5 μ?的2 μΜ siGLO 溶液，2 -15 μ?的2 μΜ siGLO溶液，3 - 30 μ?的2 μΜ siGLO溶液。可观察到与20-24 bp 的荧光siRNA分子的预期大小相应的条带。
[0067] 图7A-C是显示荧光siRNA分子渗透入各种植物种子中的图像。两个左侧图像 显示用荧光siRNA处理的种子，两个右侧图像显示未处理对照种子。荧光图像在种子用2 μΜ终浓度的siRNA处理后24小时拍摄。图7A-在IOX物镜放大倍数下观察到的拟南芥 (Arabidopsis)种子，图7Β-在5Χ物镜放大倍数下观察到的水稻种子，图7C-在5Χ物镜放 大倍数下观察到的番茄种子。
[0068] 图8A-C显示在用siGLO dsRNA处理后24小时的水稻种子。该图显示在不同放大 倍数下各图像左边的处理种子，边上是对照未处理种子。
[0069] 图9A-F是用siGLO dsRNA处理后48小时切开的水稻种子的光图像和荧光图像。 将siGLO处理水稻种子和对照水稻种子切片以使用荧光双目镜观察荧光dsRNA的内部分 布。图9A - 4粒水稻种子的光形态：底部2个siGLO处理种子，顶部2个未处理种子。图 9B-图9A中观察的种子的荧光图像。图9C一siGLO处理水稻种子的荧光图像（见图9A和 B左底部）的放大。图9D-未处理水稻种子的荧光图像的放大。图9E - siGLO处理种子的 荧光图像的放大，显示与图9C中观察到种子相比更完全的染色模式。图9F-与图9E相比 未处理种子的荧光图像的放大。
[0070] 图10A-E是用siGLO dsRNA处理后48小时切开的番茄种子的荧光图像。将siGLO 处理番茄种子和对照番茄种子切片，以使用荧光双目镜观察荧光dsRNA的内部分布。图 IOA一未处理番爺种子的外表面的突光图像。图IOB -siGLO处理番爺种子外表面的突光 图像。图IOC - siGLO处理番茄种子外表面切片（见图IOB图像的方框）的放大图像。图 IOD-切开的未处理番爺种子的内表面的突光图像。图IOE-切开的siGLO处理番爺种子的 内表面的荧光图像，胚的轮廓清楚可见。
[0071] 图IlA-H是用siGLO dsRNA处理后48小时切开的黄瓜种子的荧光图像。将siGLO 处理黄瓜种子和对照黄瓜种子切片，以使用荧光双目镜观察荧光dsRNA的内部分布。图 IlA - siGLO处理黄瓜种子内表面的荧光图像。图IlB-未处理黄瓜种子内表面的荧光图 像。图IlC一E - siGLO处理黄瓜种子内表面的前部、中部和后部（分别）切片的放大图像。 在中部切片中可观察到胚的轮廓（图11D)。图IlF-H-未处理黄瓜种子内表面的前部、中 部和后部（分别）切片的放大图像。
[0072] 图12A-D是用siGLO dsRNA处理后48小时各种植物种的切开种子的荧光图像，包 括菜豆、番茄、高粱和小麦。将siGLO处理种子和对照种子切片，以使用荧光双目镜观察荧 光dsRNA的内部分布。还拍摄了各种子的光图像，并与种子的荧光图像放在一起以供参考。 两个左侧图像显示dsRNA处理种子，两个右侧图像显示未处理对照种子。图12A显示dsRNA 处理菜豆种子和对照菜豆种子的2个实例。图12B显示dsRNA处理番茄种子和对照番茄种 子。图12C显示dsRNA处理高粱种子和对照高粱种子。图12D显示dsRNA处理小麦种子和 对照小麦种子。
[0073] 图13显示水稻种子的时程SiGLO处理结果。测试了用siGLO dsRNA培育时间对荧 光强度（表明dsRNA渗透的数量和质量）的作用。将未经处理（1)的对照种子与用SiGLO dsRNA处理4个不同培育时间的种子在一起进行拍照；10分钟（2)，3. 5小时（3)，5. 5小时 (4)和24小时（5)。
[0074] 图14A-D显示通过dsRNA/siRNA混合物使水稻中的PDS-I基因沉默。图14A - 2% 琼脂糖凝胶上I3DS-I dsRNA的分析。自左到右：100 bp，dsDNA和dsRNA产物1，在DNase turbo 后的 dsDNA 和 dsRNA，DNase turbo 和 RNaseIII 后的 dsDNA 和 dsRNA，空区和产物 2 的 相同dsDNA和dsRNA。图14B-处理后5天萌发的水稻种子的照片，对照在左边。图14C一 处理后7天萌发的水稻种子的照片，对照在下部。图14D-处理后14天种植的水稻种子的 照片，红色X表示死的幼苗，对照在左边。
[0075] 图15是显示ros-i沉默处理导致叶绿素漂白和生长抑制的照片。对照植物（在 左边）显示正常着色和生长速率，而处理后30天，PDS沉默的植物（在右边）看上去颜色 较浅和尺寸较小，表明叶绿素漂白和生长抑制的迹象。
[0076] 图16A-C显示通过实时PCR测定的PDS-I表达水平。图16A是处理后7天萌发 的水稻种子的照片，对照在下部。图16B-处理后5周种植的水稻种子的照片，对照植物在 左边，与ros-i沉默的植物相比，有较暗的绿色。图16C-从对照和ros-i沉默的植物提取 RNA，通过实时PCR检查ros-l表达水平。UBQ5表达水平用作归一化子，对照植物中的ros-l 表达水平用作校准子，得到1的值。
[0077] 图17显示处理后5天对照（左）和Hap2e dsRNA处理的（右）萌发种子的根发 育无表型差异。这就表明种子处理对种子发芽和最初发育没有任何负作用。
[0078] 图18A-C显示在萌发后5天使用在水稻苗叶片提取的RNA中测试3种不同引物组 的RT-PCR，Hap2e (miR169目标基因）的成功的源于dsRNA的表达改变。图18A-用第一 引物组的RT-PCR，其中两个引物位于dsRNA分子自身内。图18B-第二引物组，其中正向引 物的5'部分在dsRNA中，3'部分在mRNA中，反向引物位于dsR