架可能是优 选的。
[0162] 根据本发明的教导，dsRNA分子可以是天然存在的或合成的。
[0163] dsRNA可以是长和短dsRNA分子的混合物，例如dsRNA、s iRNA、s iRNA+dsRNA、 siRNA+miRNA或所述这些的组合。根据一个具体的实施方案，dsRNA是siRNA (100%)。根 据一个具体的实施方案，dsRNA是不同比率的siRNA+dsRNA组合。例如1-1的比率：在RNA 酶III处理后，一种dsRNA与相同序列混合。按照另一个实施方案，dsRNA与siRNA的比率 为 2:1、1. 5:1、1. 3:1、1:0. 01、1:0. 05 或 1:0. 1。按照另一个实施方案，dsRNA 与 siRNA 的比 率为2:1-1:0. 1。根据一个具体的实施方案，dsRNA是纯化的dsRNA (100%)。
[0164] 设计dsRNA分子用于特异性靶向目标靶基因。应认识到，dsRNA可用来减量调节 一种或多种目标基因。如果靶向多种目标基因，则使用包含靶向许多目标基因的多种dsRNA 分子的异质组合物。或者，将所述多种dsRNA分子分别施用于种子（但不是作为单一组合 物）。根据一个具体的实施方案，使用用于单一靶的多种不同dsRNA分子，其可单独或同时 (即共制剂）施用。
[0165] 按照本发明的一个实施方案，目标基因是植物内源性的。减量调节所述基因通常 对于赋予植物改良的农业、园艺、营养性状是重要的（"改进"或"提高"在下文中进一步定 义）。应认识到，用dsRNA处理可导致目标基因的增量调节（其遵循下文提供的建议机制）， 然而，所述增量调节可能是瞬时的。本发明人能够通过调节黄瓜和番茄中内源基因的表达 赋予对生物性胁迫的抗性，从而赋予对感染的抗性，如实施例35和41所示。
[0166] 本文所用的"内源的"是指表达（mRM或蛋白质）发生在植物中的基因。通常，内 源基因在植物中天然表达或来源于植物。因此，植物可以是野生型植物。然而，植物还可以 是遗传修饰的植物（转基因）。
[0167] 目标基因的减量调节可能对赋予改进的生物量、生长势、产量、非生物胁迫耐受 性、生物性胁迫耐受性之一或至少一个（例如两个或更多个）或改进的氮利用效率是重要 的。
[0168] 示例性的目标基因包括但不限于酶、结构蛋白质、植物调节蛋白、miRNA目标基因 或非编码 RNA 例如植物 miRNA。W02011067745、WO 2009125401 和 WO 2012056401 提供表 达可被沉默以改进植物性状的miRNA序列或miRNA的靶的实例（分别例如mRNA167、miRNA 156、miR164及其靶NFY、SPL17和NAC)。随后实施例部分中描述了可按照本发明的教导进 行调节的目标基因的其它实例。
[0169] 目标基因可包含转录为编码多肽的mRNA的核酸序列。
[0170] 或者，目标基因可以是非编码基因例如miRNA或siRNA。
[0171] 例如，为了使目标mRNA的表达沉默，可如下选择适于与本发明的一些实施方案一 起使用的dsRNA的合成。第一，扫描mRNA序列，包括3' UTR和5' UTR。
[0172] 第二，应用任何序列比对软件，例如可获自NCBI服务器的BLAST软件 (wwwdotncbidotnlmdotnihdotgov/BLAST/)，将mRNA序列与合适的基因组数据库进行比 较。滤出显示与其它编码序列有明显同源性的mRNA序列的推定区域。
[0173] 选择合格的目标序列作为dsRNA合成的模板。优选的序列是与基因组中的其它基 因几乎没有同源性的那些序列以降低"脱靶"作用。
[0174] 应认识到，本发明的一些实施方案的RNA沉默剂不必限于仅含有RNA的那些分子， 而且还包括化学修饰的核苷酸和非核苷酸。
[0175] dsRNA可采用本领域已知的任何方法合成，包括酶合成或固相合成。在含或不含 上述修饰的短多核苷酸序列的情况下，这些尤其有用。用于执行固相合成的装置和试剂是 市售的，可获自例如Applied Biosystems。也可采用用于所述合成的任何其它方法；寡核 苷酸的实际合成尽在本领域技术人员的能力范围内，并可通过详述于以下文献的已确立方 法，应用固相化学，例如氰基乙基亚磷酰胺接着脱保护、脱盐并通过例如自动化trityl-on 方法或 HPLC 纯化来完成：例如 Sambrook, J.和 Russell, D. W. (2001)，"Molecular Cloning: A Laboratory Manual"；Ausubel, R. Μ·等编辑（1994， 1989)， "Current Protocols in Molecular Biology,，' 第 I-III 卷，John Wiley & Sons, Baltimore, Maryland ;Perbal, B. (1988)，"A Practical Guide to Molecular Cloning," John Wiley & Sons, New York;以及Gait, M. J.编辑（1984)，"Oligonucleotide Synthesis，'。
[0176] 如所提及的，使裸dsRNA分子与种子直接接触。
[0177] 种子可以是任何植物的种子，例如绿色植物界总科包括单子叶植物和双子叶植物 的种子。下文中列举了其它植物。按照本发明的一个实施方案，植物的细胞包含依赖于RNA 的RNA聚合酶活性和dsRNA的目标RNA分子以确保dsRNA的扩增。
[0178] 本文所用术语"植物"包括整株植物、植物的袓代和子代及植物部分，包括种子、嫩 枝、茎、根（包括块茎）和分离的植物细胞、组织和器官。植物可呈现任何形式，包括悬浮培 养物、胚、分生组织区、愈伤组织、叶、配子体、孢子体、花粉和小孢子。应认识到，植物或其种 子可以是转基因植物。
[0179] 本文所用短语"植物细胞"是指来源于或自破碎的植物细胞组织或植物细胞培养 物分离的植物细胞。
[0180] 本文所用短语"植物细胞培养物"是指任何类型的天然（天然存在的）植物细胞、 植物细胞系和遗传修饰的植物细胞，其不装配形成完整植物，使得植物的至少一个生物结 构不存在。任选本发明这个方面的植物细胞培养物可包含特定类型的植物细胞或多种不同 类型的植物细胞。应注意，任选特征是特定类型的植物细胞的植物培养物最初可来源于多 个不同类型的所述植物细胞。
[0181] 按照本发明的一些实施方案，预期任何有市场或科学价值的植物。特别可用于 本发明方法的植物包括属于总科绿色植物界的所有植物，特别是包含饲料或豆科饲料、 观赏植物、粮食作物、乔木或灌木的单子叶植物和双子叶植物，其选自：金合欢（Acacia spp·)、槭（Acer spp·)、称猴桃（Actinidia spp·)、七叶树（Aesculus spp·)、澳洲贝壳 杉(Agathis australis)、Albizia amara、Alsophila tricolor、须芒草(Andropogon spp.)、落花生（Arachis spp)、模榔（Areca catechu)、Astelia fragrans、鹰嘴紫云 英（Astragalus cicer)、红苏木（Baikiaea plurijuga)、禅木（Betula spp.)、芸苔 (Brassica spp.)、木揽（Bruguiera gymnorrhiza)、Burkea africana、Butea frondosa、 Cadaba farinosa、朱樓花（Calliandra spp)、茶（Camellia sinensis)、美人蓮（Canna indica)、辣椒（Capsicum spp.)、决明（Cassia spp. )、Centroema pubescens、Chacoomeles spp.、肉桂（Cinnamomum cassia)、咖啡树（Coffea arabica)、Colophospermum mopane、 多变小冠花（Coronillia varia)、沙枸子（Cotoneaster serotina)、山楂（Crataegus spp.)、黄瓜（Cucumis spp.)、桕木（Cupressus spp.)、银藏（Cyathea dealbata)、媪 梓（Cydonia oblonga)、日本柳杉（Cryptomeria japonica)、香茅（Cymbopogon spp.)、 Cynthea dealbata、媪梓、Dalbergia monetaria、Davallia divaricata、山虫马虫皇（Desmodium spp.)、粗糖虫丰贝藏（Dicksonia squarosa)、Dibeteropogon amplectens、Dioclea spp、扁 豆（Dolichos spp. )、Dorycnium rectum、维形稗（Echinochloa pyramidalis)、Ehraffia spp. λ Eleusine coracana、幽眉草（Eragrestis spp.)、刺桐(Erythrina spp.)、按树 (Eucalyptus spp. )、Euclea schimperi、Eulalia vi/losa、Pagopyrum spp.、Feijoa sellowlana、草莓（Fragaria spp.)、千斤拔（Flemingia spp)、Freycinetia banksli、童氏 老鹤草（Geranium thunbergii)、银杏（GinAgo biloba)、Glycine javanica、Gliricidia spp、陆地棉（Gossypium hirsutum)、银禅（Grevillea spp.)、Guibourtia coleosperma、 岩黄耆（Hedysarum spp.)、牛鞭草（Hemaffhia altissima)、Heteropogon contoffus、 大麦（Hordeum vulgare)、红荀茅（Hyparrhenia rufa)、小连翅（Hypericum erectum)、 Hypeffhelia dissolute、Indigo incamata、鸾尾（Iris spp.)、Leptarrhena pyrolifolia、 胡枝子（Lespediza spp.)、萬苣（Lettuca spp.)、银合欢（Leucaena leucocephala)、 Loudetia simplex、Lotonus bainesli、百脉根（Lotus spp.) Λ Macrotyloma axillare、 苹果（Malus spp·)、木薯（Manihot esculenta)、紫花苜猜（Medicago saliva)、水杉 (Metasequoia glyptostroboides)、大蕉（Musa sapientum)、烟草（Nicotianum spp.)、 Onobrychis spp.、Ornithopus spp.、水稻(Oryza spp. )、Peltophorum africanum、狼 尾草（Pennisetum spp.)、鳄梨（Persea gratissima)、牵牛花（Petunia spp.)、菜豆 (Phaseolus spp.)、力口拿利海麥（Phoenix canariensis)、Phormium cookianum、石捕 (Photinia spp.)、白云杉（Picea glauca)、松（Pinus spp.)、豌豆（Pisum sativam)、桃 拓罗汉松（Podocarpus totara)、Pogonarthria fIeckii、Pogonaffhria squarrosa、杨 (Populus spp.) λ Prosopis cineraria、花方萁松（Pseudotsuga menziesii)、Pterolobium stellatum、西洋梨（Pyrus communis)、栎（Quercus spp. )、Rhaphiolepsis umbellata、 Rhopalostylis sapida、Rhus natalensis、Ribes grossularia、Ribes spp.、刺槐（Robinia pseudoacacia)、蔷薇（Rosa spp.)、悬钩子（Rubus spp.)、柳（Salix spp.) ΛSchyzachyrium sanguineum、金松（Sciadopitys vefficillata)、北美红杉（Sequoia sempervirens)、 巨杉（Sequoiadendron giganteum)、高梁（Sorghum bicolor)、菠菜（Spinacia spp·)、 Sporobolus f mbriatus、Stiburus alopecuroides、矮柱花草（Stylosanthos humilis)、 葫芦荼（Tadehagi spp)、落羽杉（Taxodium distichum)、Themeda triandra、车轴 草（Trifolium spp·)、小麦（Triticum spp·)、异叶铁杉（Tsuga heterophylla)、越桔 (Vaccinium spp.)、香豆（Vicia spp.)、葡萄（Vitis vinifera)、Watsonia pyramidata、马 蹄莲（Zantedeschia aethiopica)、玉米（Zea mays)、觅、洋蓟、芦舆、花椰菜、抱子甘蓝、甘 蓝、欧洲油菜（canola)、胡萝卜、花椰菜、序菜、绿叶羽衣甘蓝（collard greens)、亚麻、羽衣 甘蓝、小扁豆、油籽油菜、黄秋葵、洋葱、马铃薯、水稻、大豆、水稻草、糖甜菜、甘蔗、向日葵、 番茄、南瓜、荼、玉米、小麦、大麦、黑麦、燕麦、花生、豌豆、小扁豆和苜蓿、棉、油菜籽、欧洲油 菜、胡椒、向日葵、烟草、煎子、桉树、乔木、观赏植物、多年生草和饲料作物。或者，藻和其它 非绿色植物界可用于本发明的方法。
[0182] 按照本发明的一些实施方案，本发明方法使用的植物是作物植物，包括但不限于 棉、芸苔属植物、油籽油菜、芝麻、橄榄树、椋榈油、香蕉、小麦、玉米（com或maize)、大麦、 苜蓿、花生、向日葵、水稻、燕麦、甘蔗、大豆、草皮草、大麦、黑麦、高粱、甘蔗、菊苣、莴苣、番 茄、西葫芦、甜椒、茄子、黄瓜、甜瓜、西瓜、菜豆、木槿、黄秋葵、苹果、玫瑰、草莓、红辣椒、大 蒜、豌豆、小扁豆、欧洲油菜、菊花、拟南芥、花椰菜、甘蓝、甜菜、昆诺阿藜、菠菜、南瓜、洋葱、 亜葱、烟草、马铃薯、甜菜、番木瓜、菠萝、芒果、拟南芥（Arabidopsis thaliana)和还用于园 艺、花丼栽培或林业的植物，例如但不限于杨树、冷杉、桉树、松树、观赏植物、多年生草和饲 料作物、松桕类植物、藓类、藻，以及列于World Wide Web (dot) nationmaster (dot) com/ encyclopedia/Plantae 的其它植物。
[0183] 根据一个具体的实施方案，植物选自玉米、水稻、小麦、番煎、棉和高粱。
[0184] 根据一个具体的实施方案，种子是没有经过化学/物理处理的未包覆的或新鲜的 种子。
[0185] 种子的洗绦实行30分钟_4小时。其它不例性的洗绦范围为1分钟-10分钟、10 分钟-30分钟。洗涤溶液可包括弱洗涤剂例如Tween-20。洗涤剂的浓度可为0.01-0. 2%或 0·2-1%。
[0186] 种子在与dsRNA接触之前可进行引发或洗涤。
[0187] 本文所用术语"引发"是指控制种子内的水合水平使得萌发所需的代谢活性可 出现，但防止胚根出现。种子内不同的生理活性可以不同的水分水平存在（Leopold和 VertUCCi，1989 ;Tayl〇r，1997)。萌发过程中最后的生理活性是胚根出现。胚根出现的开始 需要高的种子含水量。通过限制种子含水量，可存在萌发所需的所有代谢步骤而无胚根出 现的不可逆行为。在胚根出现之前，种子被认为是耐干燥的，因此可通过干燥降低引发种子 的含湿量。在干燥后，引发种子可保存直到播种的时候。
[0188] 商业上使用数种不同的引发方法。其中，液体或渗透引发和固体基质引发似乎具 有最多追随者（Khan等，1991)。
[0189] 按照本发明的一个实施方案，引发在盐、螯合剂、聚乙二醇或其组合（例如螯合剂 和盐）存在下实行。
[0190] 或者，引发在水（例如去离子水或双重去离子水）存在下实行。根据一个具体的 实施方案，引发在100% ddw存在下实行。
[0191] 通常使用几种类型的种子引发： 渗透引发（渗透调节）一是标准引发技术。将种子在具有低水势的充分充气的溶液中 培育，然后洗涤并干燥。可通过加入渗压剂例如甘露糖醇、聚乙二醇（PEG)或盐像KCl实现 溶液的低水势。
[0192] 水引发（滚筒引发）一通过将有限量的水持续或相继地加入种子中来实现。滚筒 被用于这个目的，并且也可通过湿空气施加水分。"田间浸渍"是一项价廉有用的技术，通过 将种子（谷类、豆类）在温水中培育有限时间来实施。
[0193] 基质引发（基质调节）一是将种子培育在含有限量的水的固体不溶性基质（蛭石、 硅藻土、交联高吸水性聚合物）中。该方法提供慢的吸涨作用。
[0194] 预萌发种子一仅对少数种是可行的。与正常引发形成对比，允许种子进行胚根突 出。这之后是针对特定阶段分选、再诱导耐干燥性的处理以及干燥。预萌发种子的使用引 起快速均匀的幼苗发育。
[0195] 因此，按照示例性的实施方案，种子是经引发的种子。
[0196] 值得注意的是，在与dsRNA接触前将种子用水（重蒸水，ddW)处理而不引起种子的 任何引发是可能的。例如，用水处理片刻（例如30秒钟-1小时、30秒钟-0. 5小时、30秒 钟-10分钟、30秒钟-5分钟或45秒钟-5分钟）。
[0197] 应认识到，dsRNA可包含在水（例如自来水、蒸馏水或重蒸水）中，即没有任何上 述引发有效浓度的盐、螯合剂、聚乙二醇或其组合（例如螯合剂和盐）。
[0198] 按照示例性的实施方案，种子是未经引发的种子。
[0199] 实施例1中提供了将dsRNA引入种子中的一种非限制性示例性方法，其被视为本 说明书的组成部分。
[0200] 在洗涤/引发和干燥步骤时的温度可相同或不同。
[0201] 按照示例性的实施方案，洗涤/引发在4_28°C下实行。
[0202] 按照示例性的实施方案，引发/洗涤溶液或含dsRNA的溶液缺乏固体载体。
[0203] 按照示例性的实施方案，引发/洗涤溶液或含dsRNA的溶液缺乏转移剂，例如表面 活性剂或盐。
[0204] 按照本发明的另一个实施方案，对与dsRNA分子进行接触的种子进行洗涤，以除 去种子曾接触过的作用剂，例如杀虫剂、杀真菌剂、杀昆虫剂、肥料、涂布剂和着色剂。
[0205] 因此，按照示例性的实施方案，种子（在用dsRNA处理前）基本上不含（即不含有 效量的）杀虫剂、杀真菌剂、杀昆虫剂、肥料、涂布剂和着色剂。
[0206] 然后对种子进行干燥。
[0207] 按照示例性的实施方案，干燥在 20-37°C、20-30°C、22-37°C、15-22°C或 20-25°C 下实行10-20小时、10-16小时或甚至2-5小时。
[0208] 当计算接触溶液中裸dsRNA的浓度时，要考虑各种因素。
[0209] 这些取决于以下至少一种：种子大小、种子重量、种子体积、种子表面积、种子密度 和种子透性。
[0210] 例如，就种子大小、重量、体积和表面积而言，估计玉米种子比拟南芥和番爺种子 需要较长处理。至于透性和密度，估计小麦种子比番茄种子需要在较高浓度下的较长处理。
[0211] 处理溶液中dsRNA的示例性浓度包括但不限于0. 01-0. 3 Pg/>1、0. 01-0. 15 Pg/ M-1>0.