显示自用25 μ g/ml dsRNA处理24小时的种子萌发的7. 5周龄玉米 植物中TBl mRNA表达的实时PCR分析的柱状图。图58A显示在用TBl dsRNA (SEQ ID NO: 145)和作为对照的CGMMV dsRNA (SEQ ID NO: 8和11)处理后TBl mRNA表达的倍数变化。 每个条形柱表示1株植物。将每个个别植物的表达值归一化至用CGMMV dsRNA处理的所有 植物的表达中位值。图58B显示图58A中所示数据的中位值。TBl表达相对于CGMMV对照 的变化的P值为0.065。误差条表示数据的标准差。
[0119] 图59A-C是显示自用50 μ g/ml dsRNA处理24小时的种子萌发的5日龄玉米嫩 枝和12日龄叶片的NAC mRNA表达的实时PCR分析的柱状图。图59A-在用dsRNA (NAC和 ⑶S分别为SEQ ID NO: 83和21)处理后放入萌发箱的种子。图59B-用dsRNA处理后经 洗涤和干燥的种子。⑶S dsRNA用作对照。每个圆点表示一株植物。图59C-自以与图59A 和59B中相同的方式处理的种子萌发并种植在土壤中的12日龄玉米叶中NAC mRNA表达的 实时PCR分析。注意在萌发后5天NAC mRNA增量调节，此后减量调节。
[0120] 图60A-D是显示自用50 μ g/ml dsRNA处理24小时的种子萌发的1周龄和2周 龄莴苣植物中HY5 mRNA表达的实时PCR分析的示图。图60A显示在用HY5. 5 dsRNA (SEQ ID NO: 156)、HY5.6 dsRNA (SEQ ID NO: 160)或两种的混合物（1:1，共 50 Pg/ml)处理后 1周龄植物中HY5.5 mRNA的表达水平。⑶S dsRNA (SEQ ID NO: 21)或0· ImM EDTA (缓冲 液）用作对照。每个圆点表示一株植物。图60B显示在用HY5. 5 dsRNA、HY5. 6 dsRNA或两 种的混合物处理后1周龄植物中HY5. 6 mRNA的表达水平。⑶S dsRNA或0,1mM EDTA (缓冲 液）用作对照。每个圆点表示一株植物。图60C显示在用HY5. 5 dsRNA (SEQ ID NO: 156)、 HY5. 6 dsRNA (SEQ ID NO: 160)或两种的混合物（1:1，共50 Pg/ml)处理后2周龄植物中 HY5.5 mRNA 的表达水平。⑶S dsRNA (SEQ ID NO: 21)、DHFR dsRNA (SEQ ID NO: 167)或 O.lmM EDTA (缓冲液）用作对照。每个圆点表示一株植物。图60D显示在用HY5. 5 dsRNA (SEQ ID NO: 156)、HY5.6 dsRNA (SEQ ID NO: 160)或两种的混合物（1:1，共 50 Pg/ml) 处理后2周龄植物中HY5. 6 mRNA的表达水平。⑶S dsRNA (SEQ ID NO: 21)、DHFR dsRNA (SEQ ID NO: 167)或0· ImM EDTA (缓冲液）用作对照。每个圆点表示一株植物。
[0121] 图61是显示自用50 μ g/ml dsRNA (SEQ ID NO: 167)处理24小时的种子萌发 的1周龄莴苣植物中DHFR mRNA表达的实时PCR分析的示图。⑶S dsRNA (SEQ ID NO: 21) 或O.lmM EDTA (缓冲液）用作对照。每个圆点表示一株植物。
[0122] 图62A-B显示用DNDl dsRNA处理的黄瓜种子的作用。图62A是显示自用100 μ g/ ml dsRNA (SEQ ID NO: 171和172)处理24小时的种子萌发的15日龄黄瓜植物中DNDl mRNA表达的实时PCR分析的示图。GUS dsRNA (SEQ ID NO: 21)或O.lmM EDTA (制剂） 用作对照。每个圆点表示一株植物。图62B显示用DNDl dsRNA处理种子后11天黄瓜根的 百分比瘿瘤评级。GFP dsRNA和0.1 mM EDTA (制剂）为对照处理。
[0123] 图63是显示自用100 μ g/ml dsRNA (SEQ ID NO: 180和181)处理24小时的种 子萌发的15日龄黄瓜植物中PMR5 mRNA表达的实时PCR分析的示图。GFP dsRNA (SEQ ID NO: 176)或0· ImM EDTA (制剂）用作对照。每个圆点表示一株植物。
[0124] 图64是显示自用100 μ g/ml dsRNA (SEQ ID NO: 185和186)处理24小时的种 子萌发的15日龄黄瓜植物中TubG mRNA表达的实时PCR分析的示图。GFP dsRNA (SEQ ID NO: 176)或0· ImM EDTA (制剂）用作对照。每个圆点表示一株植物。
[0125] 图65是显示自用100 μ g/ml dsRNA (SEQ ID NO: 24和25)处理24小时的种子 萌发的15日龄番茄植物中DNDl mRNA表达的实时PCR分析的示图。GFP dsRNA (SEQ ID NO: 176)或0· ImM EDTA (制剂）用作对照。每个圆点表示一株植物。
[0126] 图66是显示自用100 μ g/ml dsRNA (SEQ ID NO: 32)处理24小时的种子萌发的 15日龄番茄植物中PMR5 mRNA表达的实时PCR分析的示图。GFP dsRNA (SEQ ID NO: 176) 或O.lmM EDTA (制剂）用作对照。每个圆点表示一株植物。
[0127] 图67是显示自用100 μ g/ml dsRNA (SEQ ID NO: 37和38)处理24小时的种子 萌发的15日龄番茄植物中MLO mRNA表达的实时PCR分析的示图。GFP dsRNA (SEQ ID NO: 176)或0· ImM EDTA (制剂）用作对照。每个圆点表示一株植物。
[0128] 图 68 是显示自用 Bil (SEQ ID NO: 42 和 43)和 PMR5 (SEQ ID NO: 198) dsRNA 处理的种子萌发的15日龄番茄植物中白粉病的平均百分比的柱状图。GFP dsRNA用作对 照。
[0129] 图69是显示自用50 μ g/ml dsRNA (SEQ ID NO: 190和194)处理24小时的种子 萌发的1周龄大豆植物中PHYAE3 mRNA表达的实时PCR分析的示图。⑶S dsRNA (SEQ ID NO: 21)用作对照。每个圆点表示一株植物。
[0130] 本发明具体实施方案的描沭 本发明在其一些实施方案中涉及将dsRNA导入植物种子以调节基因表达的方法。
[0131] 在详细解释本发明的至少一个实施方案之前，要了解本发明不必将其应用局限于 下面的描述中所提供的或通过实施例所例示的细节。本发明能够以各种方式实施或进行其 它的实施方案。
[0132] 随着世界人口的大量增长及植物生长和栽培产地有限，在这些变换的条件下迫切 需要提高植物产量。
[0133] RNAi已显现为调节基因表达的有力工具，其可用于产生胁迫耐受性改进的植物。
[0134] 在植物中，通常通过产生过量表达经转录产生dsRNA的DNA片段的转基因植物来 进行RNAi。这种dsRNA然后被加工成siRNA，siRNA通常通过RNA诱导沉默复合体（RISC) 或通过翻译抑制而靶向目标基因切割，来介导目标基因的沉默。
[0135] 这项技术的主要技术限制是许多重要的植物作物种难以或不可能转化，阻碍了 指导dsRNA产生的构建体的组成型表达。而且，有关抗病毒转基因植物潜在的生态影响 的问题迄今为止严重限制了它们的应用[Tepfer, 2002，Annu. Rev. Phytopathol. 40， 467-491]〇
[0136] 本发明人现已设计出将dsRNA分子直接引入植物种子中的新的技术。这些dsRNA 进入种子，并开始在植物的生命周期内持续的沉默过程，产生具有改良的目标性状的植物。 被引入的dsRNA是裸露的，因此没有外源转录调节元件被引入植物中，因此减少了与转基 因植物相关的环境顾虑。另外，修饰种子可萌发生成植物而不需要进行费力和繁重的组织 培养再生步骤。
[0137] 如下文和接下来的实施例部分中的描述，本发明人能够设置将裸dsRNA引入种子 所必需的条件（参见例如实施例1)。裸dsRNA不整合至基因组中，并且在植物中和在溶液中 十分稳定（实施例2-4)。裸dsRNA通过单子叶植物和双子叶植物两者的种皮（即testa)渗 入，并分布在种子的胚乳和胚中（实施例5-6)。本发明人能够改变内源基因（实施例7-14) 以及外源病毒基因（实施例2)的表达。这些结果在单子叶植物和双子叶植物组两者中的 许多植物中再现。因此本发明人能够提供导致基因表达显著改变的大范围的剂量和动力学 (参见例如实施例23-29)。这些结果在小麦中被进一步确定，并通过显示萌发延迟的生物 作用来证实（实施例30)。在引入用于不同目标的dsRNA后，基因表达在玉米中改变（实施 例31和32)。用dsRNA处理的其它蔬菜包括黄瓜和莴苣（实施例33-37)。本发明人还能 够显示在另一种经济作物即大豆中的基因表达改变（参见实施例42)。因此，本发明的结果 足以表明本发明的教导提供有成本效益的植物种子的处理以获得所需的农业和园艺表型。 不受理论束缚，认为新提出的转化形式和基因表达的调节取决于并与以下有关： (i) 将裸dsRNA引入种子内部（与仅种皮相对）。通过将种子浸泡在包含dsRNA的溶 液中使得dsRNA通过种皮渗入，或者通过浸渍使得dsRNA涂布种子并在播种后通过种皮渗 入，来实行引入； (ii) dsRNA信号的扩增；和 (iii) dsRNA信号扩散在整株植物中。
[0138] 第一步只在最初的种子处理期间和种子处理后不久发生一次，而第二步和第三步 以重复回路发生，只要沉默信号在植物中保持活性。
[0139] 所述发明的一种提议的无约束作用方式基于以下各个步骤： 将dsRNA引入种子中 一个典型的成熟种子由包裹在母本种皮（testa)内的胚和胚与种皮之间大量的胚乳 组织层组成。胚乳在种子发育、萌发和幼苗建植期间用作胚的营养源。
[0140] 种子萌发通常始于将种子暴露于水中，水被胚和胚乳吸收。然后胚乳的体积膨大， 一些植物种的胚乳能够生长到其最初体积的数倍。休眠直到该阶段的胚，此时从休眠中解 除，开始细胞分裂、增殖和分化。胚乳为发育中的胚提供养分，直到它发育到足以开始光合 作用和自养生长。
[0141] 根据这些种子萌发的已知机制，提出了"将dsRNA引入种子中"的初始步骤的两种 可能的作用方式： dsRNA分子被用于种子处理的基于水的溶液携带直接进入胚中。
[0142] dsRNA分子作为胚乳吸水过程的一部分进入胚乳。这些分子随后在萌发和种子发 育期间，在胚发育时作为来自胚乳的养分流的一部分供给胚。
[0143] 根据图7-13所述结果，估计发生两种选择的组合。也就是说，dsRNA中的一些直 接进入胚中，一些保留在胚乳中，并在种子萌发期间供给发育中的胚。
[0144] dsRNA信号的扩增 一旦dsRNA分子进入胚中，则被RNA酶III样酶例如Dicer或Dicer样（DCL)酶识别 和加工。DCL酶将长的dsRNA分子加工成短的双链RNA (称为siRNA或shRNA)，其通常为 21-24个核苷酸（nt)长。siRNA链之一通常快速降解，第二链可掺入RISC (RNA诱导沉默复 合体）蛋白质复合体中，所述复合体含有Argonaute (AGO)蛋白。AGO蛋白含有结合siRNA 的PIWI结构域和具有RNA酶活性的PAZ结构域。随后，siRNA/AGO复合体识别与siRNA互 补的mRNA分子，并通过切割或翻译抑制导致其沉默。
[0145] siRNA然后从RISC复合体中释放，此时可用作依赖RNA的RNA聚合酶（RDRP)的引 物，所述酶是一种植物界特有的酶，可通过产生新的dsRNA分子（第二siRNA)，来产生扩增 的沉默信号。这些新合成的dsRNA可再次如上文所述加工，因此维持和扩增沉默信号。
[0146] 沉默信号的扩散 沉默扩散在植物中是已知的和被充分认识的现象。短距离的细胞到细胞的扩散被认为 是通过胞间连丝而发生。这个过程被认为由21nt长的作为DCL酶的产物的siRNA介导。此 夕卜，通过穿过整株植物的韧皮部从源到库（sink)实现系统扩散。
[0147] 假设在所述方法中，一旦沉默信号开始并如上所述扩增，则发生沉默信号的扩散。 这可包括通过各种siRNA信号分子的短距离扩散和系统扩散两者。
[0148] 因此按照本发明的一方面，提供将裸露的双链RNA (dsRNA)引入种子中的方法，所 述方法包括在允许dsRNA渗透入种子的条件下使种子与裸dsRNA接触，从而将dsRNA引入 种子中。
[0149] 本文所用短语"裸dsRNA"是指在植物细胞中不可转录的dsRNA核酸分子。因此， 裸dsRNA分子不包含在核酸表达构建体（例如病毒载体）中。按照本发明的一些实施方案， 裸dsRNA分子不来源于病毒载体。按照一些实施方案，dsRNA不是天然病毒感染的产物。按 照一些实施方案，裸dsRNA可包含用于体外转录的调节元件，例如T7启动子。按照本发明 的一些实施方案，裸dsRNA可被修饰例如化学修饰以赋予较高的生物利用度、渗透入种子 中和/或延长的保存期限。
[0150] 本文所用术语"dsRNA"涉及通过碱基配对保持在一起的反向平行的聚核糖核酸 的二条链。两条链可以是相同长度或不同长度，只要以超过全长至少80%、90%、95%或100% 互补性形成的双链结构的两条链之间有足够的序列同源性。按照本发明的一个实施方案， dsRNA分子没有突出端。按照本发明的另一个实施方案，dsRNA分子包含突出端。按照其它 的实施方案，使链对齐，使得不对齐的（即相对链上不存在互补的碱基）的链的末端有至少 1、2或3个碱基，使得当链退火时，双链体的一端或两端存在1、2或3个残基的突出端。
[0151] 所述任何dsRNA分子可按照本发明的教导使用，只要通过依赖RNA的RNA聚合酶 (RDRP)进行扩增。
[0152] 本发明的教导涉及不同长度的dsRNA，其中较短的形式即X短于或等于50 bp (例 如17-50)，被称为siRNA或miRNA。51-600个较长的dsRNA分子在本文被称为dsRNA，其可 被进一步加工用于siRNA分子。
[0153] 术语"siRNA"是指诱导RNA干扰（RNAi)途径的小的抑制性RNA双链体（通常介 于17-30个碱基对之间，但也有较长的碱基对例如31-50 bp)。通常，siRNA以化学方法合 成作为21聚体，其具有中心19 bp双链体区和末端上对称的2碱基3' -突出端，尽管最近 描述了与在相同位置的21聚体相比，长为25-30个碱基的化学合成的RNA双链体的效能可 增加多达100倍。据推理，在触发RNAi中使用较长RNA所获得的实测效能的增加产生于给 Dicer提供底物（27聚体）而不是产物（21聚体），而且这提高了 siRNA双链体进入RISC 的速率或效率。
[0154] 已发现，3' -突出端的位置影响siRNA的效能，且在反义链上具有3' -突出端的不 对称双链体一般比有义链上具有3'-突出端的那些更有效（Rose等，2005)。这可归因于加 载入RISC的不对称链，因为当靶向反义转录物时，观察到相反的功效模式。
[0155] 双链干扰RNA (例如siRNA)的链可连接形成发夹或茎环结构（例如shRNA)。因 此，如所提及的，本发明的一些实施方案的RNA沉默剂也可为短发夹RNA (shRNA)。
[0156] 本文所用术语"shRNA"是指这样的RNA剂，即具有茎环结构、包含互补序列的第一 和第二区域、区域的互补程度和取向足够使得区域之间发生碱基配对、第一区域和第二区 域通过环区域连接、环因环区域内核苷酸（或核苷酸类似物）之间缺乏碱基配对所引起。环 中核苷酸的数目介于3-23或5-15或7-13或4-9或9-11之间并包括3、23或5、15或7、 13或4、9或9、11。环中的一些核苷酸可参与与环中其它核苷酸的碱基对的相互作用。可 用来形成环的寡核苷酸序列的实例包括5'-UUCAAGAGA-3'（Brummelkamp，T. R.等（2002) Science 296: 550，DEQ ID NO: 22)和5，-UUUGUGUAG-3'（Castanotto, D.等（2002) RNA 8:1454，SEQ ID NO: 23)。本领域技术人员应认识到，所得的单链寡核苷酸形成包含能够 与RNAi机器相互作用的双链区域的茎-环或发夹结构。
[0157] 本文所用短语"微小RNA (本文亦可互换称为"miRNA"或"miR"）或其前体"是指 用作转录后调节物的微小RNA (miRNA)分子。通常，miRNA分子是长度约20-22核苷酸的 RNA分子，其可加载至RISC复合体中，并且直接切割另一种RNA分子，其中其它RNA分子包 含与miRNA分子的核苷酸序列基本互补的核苷酸序列。
[0158] 通常，miRNA分子自"pre-miRNA"或如本文所述的pre-miRNA分子的前体被存在 于任何植物细胞中的蛋白质（例如DCL蛋白）加工，并加载至RISC复合体中，在所述复合 体中可指导目标RNA分子的切割。
[0159] Pre-微小RNA分子通常自pri-微小RNA分子（初级转录物）加工。侧接pre-微 小RNA的单链RNA区段对于pri-miRNA加工成pre-miRNA是重要的。切割位点似乎取决于 距茎-ssRNA 连接点的距离（Han 等，2006，Cell 125，887-901，887-901)。
[0160] 本文所用的"pre-miRNA"分子是可呈二级结构的约100-约200个核苷酸，优选约 100-约130个核苷酸的RNA分子，该二级结构包含不完整的双链RNA茎和单链RNA环（亦 称为"发夹"），并且还包含双链RNA茎中miRNA (及其互补序列）的核苷酸序列。根据一 个具体的实施方案，miRNA及其互补序列位于距miRNA双链RNA茎的游离端约10-约20个 核苷酸。单链环区域的长度和序列不是决定性的，可相当大地在长度例如30和50 nt之间 变化。miRNA与其互补序列之间的互补性不必是完全的，可容许约1-3个不配对核苷酸的凸 出。可通过本领域的常规计算机算法（例如mFOLD)预测RNA分子所采取的二级结构。来 自被DCL活性释放并加载至RISC复合体中的pre-miRNA的双链RNA茎的特定链取决于5' 端的互补程度，籍此在该链（其在5'端上最少参与被切割的dsRNA茎的不同链的核苷酸之 间的氢键结合）被加载至RISC复合体中，并决定目标RNA分子降解的序列特异性。然而， 如果来自特定合成的pre-miRNA分子的miRNA分子凭经验不是功能性的（因为"错误"链 加载至RISC复合体中），则可通过交换pre-miRNA分子的dsRNA茎各个链上的miRNA分子 及其互补序列的位置来解决这个问题，这将是极显然的。如本领域已知，涉及两个氢键结合 的A和U或涉及两个氢键结合的G和U之间的结合没有涉及3个氢键结合的G和C的强。 下表1-8提供示例性的发夹序列。
[0161] 天然存在的miRNA分子可包含在其天然存在的pre-miRNA分子中，但也可通过交 换自所述现有pre-miRNA分子正常加工的miRNA分子的核苷酸序列为另一目标miRNA的核 苷酸序列，将它们引入现有的pre-miRNA分子支架。pre-miRNA的支架也可以是完全合成 的。同样地，合成miRNA分子可包含在现有的pre-miRNA分子支架或合成的pre-miRNA支 架内，并自其加工。对于其正确加工成设计的微小RNA的效率，特别是当作为嵌合基因（其 中除pre-微小RNA以外其它DNA区域例如非翻译前导序列或转录终止和聚腺苷酸化区域 被掺入初级转录物中）表达时，相对于其它pre-miRNA支架，一些pre-miRNA支