04-0. 15 M-g/M-l>0. 1-100 M-g/M-l>0. 1-50 M-g/M-l>0. 1-10 M-g/M-l>0. 1-5 M-g/M-l>0. 1~1 M-g/M-l>0. 1~0. 5 M-g/M-l>0. 15-0. 5 M-g/M-l>0. l-〇. 3 M-g/M-l>0. 01-0,1 M-g/M-l>0. 01-0. 05 M-g/ μ1、0. 02-0. 04 Pg/>1、0. 001-0. 02 根据一个具体的实施方案，处理溶液中dsRNA的 浓度为 〇· 01-0. 15 或 0· 04-0. 15 μ8/μ1。
[0212] 根据一个具体的实施方案，与dsRNA的接触在螯合剂例如EDTA或另一处螯合剂例 如DTPA (0.01-0,1 mM)存在下实行。
[0213] 接触溶液可包含转移剂,例如表面活性剂或盐。
[0214] 所述转移剂的实例包括但不限于盐例如脂肪酸（例如动物脂或牛油脂肪胺或磷 脂脂质转染胺或脂质转染试剂（1-20 nM或0.1-1 nM))的钠或锂盐和有机硅表面活性 齐U。其它有用的表面活性剂包括有机硅表面活性剂，包括非离子有机硅表面活性剂，例如 乙氧基化三硅氧烷表面活性剂或硅氧烷聚醚共聚物例如聚环氧烷改性七甲基三硅氧烷和 烯丙氧基聚丙二醇甲基醚的共聚物（以Silwet? L-77表面活性剂市售可获得，CAS编号 27306-78-1 和 EPA 编号：CAL. REG. NO. 5905-50073-AA，现可获自 Momentive Performance Materials, Albany, Ν· Υ· ) 〇
[0215] 有用的物理作用剂可包括（a)研磨剂，例如金刚砂、刚玉、沙、方解石、浮石、石榴 石等，（b)纳米粒，例如碳纳米管，或（c)物理力。碳纳米管披露于Kam等（2004) J. Am. Chem. Soc.，126 (22) :6850-6851 ;Liu 等（2009) Nano Lett·，9(3):1007-1010;及 Khodakovskaya 等（2009) ACS Nano, 3(10) :3221-3227。物理力因子可包括加热、冷却、施 加正压或超声处理。用于植物被多核苷酸渗透入的实验室调节的作用剂包括例如施加化学 试剂、酶处理、加热或冷却、用正压或负压处理或超声处理。在田间用于调节植物的作用剂 包括化学试剂，例如表面活性剂和盐。
[0216] 种子与dsRNA的接触可采用本领域已知的任何方法实行，只要抑制量的dsRNA进 入种子。这些实例包括但不限于浸湿、喷施或用粉末、乳液、混悬液或溶液涂布；同样，通过 任何合适的方法将多核苷酸分子施于植物，例如喷施或擦拭溶液、乳液或混悬液。
[0217] 本文所用的"抑制量"是指足以减量调节目标基因达至少20%、30%、40%、50%或更 高、比如说60%、70%、80%、90%或更高甚至100%的dsRNA的量。抑制量可以是在植物中放大 形成的结果。
[0218] 根据一个具体的实施方案，接触可通过浸湿（即接种）实行，使得种子用处理溶液 振荡可提高渗入和浸透，因此缩短处理时间。振荡通常在50-150 RPM下实行，并取决于处理 溶液的体积。振荡可实行4-24小时（1-4小时、10分钟-1小时或30秒钟-10分钟）。本文 的教导还设想短的培育时间例如至多10分钟。实施例包括但不限于30秒钟-7分钟、30秒 钟-5分钟、30秒钟-3分钟、30秒钟-2分钟、30秒钟-1分钟，1分钟-10分钟或1分钟-5 分钟。在本发明的范围内还考虑了浸渍。因此，将种子浸入dsRNA溶液中数秒例如1-10秒 钟、1-5秒钟、1-3秒钟或1-2秒钟。在此期间，dsRNA可吸附在种子表面。所吸附的涂布种 子的dsRNA在萌发时可渗透种子或幼苗。培养在4-28°C或15-22°C (例如8-15°C、4-8°C、 22-28°C )下在暗中发生。
[0219] 根据一个具体的实施方案，接触发生在种子休眠中断和胚出现之前。
[0220] 在接触之后，优选在种子休眠中断和胚出现之前，可用上述作用剂（例如杀虫剂、 杀真菌剂等）对种子进行处理（例如涂布）。
[0221] 实行接触，使得dsRNA进入胚、胚乳、种皮或3种的组合中。
[0222] 在与处理溶液接触之后，可在25_37°C下对种子进行干燥直到30小时。例如，在 30°C下将种子干燥16小时。
[0223] 根据一个具体的实施方案，种子（例如分离的种子）包含外源裸dsRNA，且其中至 少10或20个分子的dsRNA进入分离种子的胚乳中。
[0224] 本文所用术语"分离的"是指从天然生理环境中分离。在种子的情况下，分离种子 从植物的其它部分分离。在核酸分子（例如dsRNA)的情况下从胞质分离。
[0225] 根据一个具体的实施方案，dsRNA不是从植物基因组中表达，因此不是基因组的组 成部分。
[0226] 根据一个具体的实施方案，提供包含在种子的胚和胚乳中以类似浓度（例如约 1: 1、2:1或1:2)存在的外源dsRNA的分离种子。研究表明与当dsRNA从核酸表达构建体表 达时所观察到的相比，将裸dsRNA直接引入种子中导致胚乳中较高浓度的dsRNA。
[0227] 根据一个具体的实施方案，提供包含空间上分布在植物种子的胚和胚乳中的外源 dsRNA的分离种子，其空间分布不同于来源于重组表达外源dsRNA的转基因植物的种子中 的所述外源dsRNA的空间分布。
[0228] 测量RNA分子在种子中的定位的方法是本领域众所周知的。实施例部分中所述 siGlo的使用就是这种方法的一个实例。
[0229] 按照备选或其它的实施方案，提供包含外源dsRNA的分离种子，其中与重组表达 所述外源dsRNA的转基因种子相比，所述外源dsRNA与由其成熟的siRNA的浓度比例在种 子中较高。
[0230] 本文所用术语"较高"是指高至少约 3%、5%、7%、10%、15%、20%、25%、30%、50%、60%、 70%、80%、90%或甚至几倍。
[0231] 按照备选或其它的实施方案，提供包含外源dsRNA的分离种子，其中植物种子缺 乏用于驱动所述外源dsRNA表达的异源启动子，其中与重组表达所述外源dsRNA的转基因 种子相比，所述外源dsRNA和/或由其成熟的siRNA在种子中的空间分布改变。
[0232] 术语"重组表达"是指自核酸构建体表达。
[0233] 按照另一个实施方案，提供可通过本文所述任何方法获得（或得到）的植物种子。
[0234] 确定成功引入dsRNA的方法包括但不限于RT-PCR (例如定量测定目标基因或裸 dsRNA的水平）、表型分析例如生物量、生长势、产量和胁迫耐受性、根结构、叶尺寸、谷粒大 小和重量、含油量、纤维素以及细胞生物学技术。
[0235] 按照本发明的实施方案，有时观察到通过本文所述种子处理所靶向的基因增量调 节。这主要在起主要调节物作用的基因例如微小RNA的靶（例如SPL和NAC)和参与调节 关键过程的其它基因（例如HY5)中观察到。参见例如接下来的实施例部分的实施例23和 32〇
[0236] 不受理论束缚，研究表明，这种现象可能与这些基因表达调节中的潜在反馈回路 有关。这些基因可能被严格调节，因此植物可能通过过度补偿一个方向的基因表达的强变 化而起反应以在相反方向上改变其表达。因此，例如有可能基因将在处理后前几个小时或 几天最初呈现减量调节，在植物生命周期的后期可能变成增量调节。参见例如接下来的实 施例部分的实施例32。因此，本发明人观察到玉米在处理后5天NAC基因增量调节，而在处 理后10和12天减量调节。这在莴苣中针对Hy 5. 5或5. 6基因得到了进一步证实。
[0237] 种子可在种植前保存1天至数月（例如在4-KTC下）。
[0238] 所得种子可在暗中萌发以产生植物。
[0239] 因此提供包含外源裸dsRNA且没有驱动dsRNA在植物中表达的异源启动子的植物 或植物部分。
[0240] 本文所用的"没有驱动dsRNA表达的异源启动子"意指植物或植物细胞不包括在 植物中转录dsRNA的顺式作用调节序列（例如异源序列）。本文所用术语"异源的"是指外 源的、非天然存在于天然植物细胞内的（例如通过整合的位置或是非天然存在于植物细胞 内的）。因此分离种子在驱动dsRNA在植物中表达的异源启动子序列不存在时，包含植物不 能转录的dsRNA的同基因（在扩增前）或异基因（第二siRNA，在扩增后）群。
[0241] 本发明方法可用于例如在植物中调节基因表达，所述方法包括： (a) 在允许dsRNA渗入种子的条件下使植物的种子与裸dsRNA接触，从而将dsRNA引 入种子中；和任选 (b) 产生种子的植物。
[0242] 当用于减量调节植物基因时，应用本领域众所周知的生物信息工具（例如 BLAST)，设计所需特异性的裸dsRNA。
[0243] 该方法可用于自基本研究（例如为了评价基因功能）开始直到产生具有有价值的 商业用途的性状改变的植物为止的各种应用。
[0244] 所述植物可显示农业有益性状，包括形态学改变、开花改变、胁迫耐受性（即病毒 生物性胁迫和/或非生物胁迫）改变、生物量生长势和/或产量改变等。
[0245] 本文所用的短语"非生物胁迫"是指对植物的代谢、生长、生存力和/或生殖的任 何不良作用。非生物胁迫可通过以下任何亚最适环境生长条件诱导：例如水分不足或干旱、 洪涝、冰冻、低温和高温、大风、重金属毒性、缺氧生活、高或低养分水平（例如养分缺乏）、 高或低盐水平（例如盐分）、大气污染、高或低光强度（例如光线不足）或UV照射。非生物 胁迫可以是短期作用（例如急性作用，例如持续约一周），或者可以是持续的（例如慢性作 用，例如持续例如10天以上）。本发明考虑其中存在单一非生物胁迫条件的情况，或者出现 两种或更多种非生物胁迫的情况。
[0246] 按照示例性的实施方案，非生物胁迫是指盐分。
[0247] 按照另一个示例性的实施方案，非生物胁迫是指干旱。
[0248] 按照另一个示例性的实施方案，非生物胁迫是指温度胁迫。
[0249] 本文所用短语"非生物胁迫耐受性"是指植物耐受非生物胁迫而不显示可观的生 理或物理损害（例如植物代谢、生长、生存力和/或繁殖力的改变）的能力。
[0250] 本文所用短语"氮利用效率（NUE) "是指每单位氮肥输入的作物产量的度量。肥料 使用效率（FUE)是NUE的度量。作物产量可通过生物量、生长势或产量测量。植物的氮利 用效率通常是被植物吸收的氮的吸收、扩散、吸收率、蓄积、再分配（在植物中）和利用的至 少一种改变的结果。改进的NUE是就相同种和相同发育阶段并生长在相同条件下的非转基 因植物（即缺乏转基因植物的转基因）而言。
[0251] 本文所用短语"氮限制条件"是指包括所施加的低于最适植物代谢、生长、繁殖和 /或生存力所需水平的氮（例如铵或硝酸盐）的水平（例如浓度）的生长条件。
[0252] 本文所用的术语/短语"生物量"、"植物的生物量"或"植物生物量"是指从生长 季节中的植物产生组织的量（例如以风干组织的克数测量）。植物生物量的增加可以是整 株植物或其部分例如地上（例如可收获）部分、营养生物量、根和/或种子或其内容物（例 如油、淀粉等）的增加。
[0253] 本文所用的术语/短语"生长势"、"植物的生长势"或"植物生长势"是指在规定 时间内由植物产生的组织的量（例如通过重量测量）。生长势提高可决定或影响植物产量 或每生长时间或生长面积的产量。另外，早期生长势（例如种子和/或幼苗）导致场林分 (field stand)改进。
[0254] 本文所用的术语/短语"产量"、"植物的产量"或"植物产量"是指每株植物或每 个生长季节所产生的组织或器官量（例如通过重量或大小测量）或数量（例如数目）。植 物的高产量可能影响在某一生长面积和/或生长时间内可从植物中获得的经济利益。
[0255] 按照示例性的实施方案，产量通过纤维素含量、含油量、淀粉含量等测量。
[0256] 按照另一个示例性的实施方案，产量通过含油量测量。
[0257] 按照另一个示例性的实施方案，产量通过蛋白质含量测量。
[0258] 按照另一个示例性实施方案，产量通过每株植物或其部分（例如种仁、豆）的种子 数、种子重量、果实数或果实重量测量。
[0259] 植物产量可受不同参数的影响，包括但不限于植物生物量；植物生长势；植物生 长速率；种子产量；种子或谷粒数量；种子或谷粒品质；油产量；收获器官（例如植物的种 子或营养部分）的油、淀粉和/或蛋白质含量；每个圆锥花序的花（例如小花）的数目（例 如表示为饱满种子的数目相对于主要圆锥花序的数目的比率）；收获指数；每面积生长的 植物的数目；每株植物和每面积收获器官的数目和大小；每生长面积的植物数目（例如密 度）；田间收获器官的数目；总的叶面积；碳同化和碳分配（例如植物内碳的分布/配置）； 耐荫性；每个豆荚的可收获器官（例如种子）、种子的数目、每个种子的重量；和改进的体系 结构[例如增加茎直径、厚度或改进物理性质（例如弹性）]。
[0260] 改进的植物NUE在田间被解释成在施用较少肥料的同时收获类似产量的数量，或 施用相同水平的肥料获得高的产量。因此，改进的NUE或FUE对田间的植物产量有直接作 用。
[0261] 本文所用术语"改进"或"提高"是指与天然或野生型植物[即本发明的同基因植 物（未经修饰以包含dsRNA)]相比，植物的NUE、胁迫耐受性、产量、生物量或生长势提高至 少约2%、至少约3%、至少约4%、至少约5%、至少约10%、至少约15%、至少约20%、至少约25%、 至少约30%、至少约35%、至少约40%、至少约45%、至少约50%、至少约60%、至少约70%、至少 约80%、至少约90%或更高。
[0262] 按照所述，dsRNA的目标基因可以不是内源植物基因而是植物的外源基因，例如以 植物为食或依赖于植物而生长、复制和/或存活的植物病毒或细菌的外源基因。
[0263] 因此，按照本发明的一方面，提供抑制植物病毒的目标基因的表达的方法，所述方 法包括将本文所述植物（其至少部分包括裸dsRNA)提供（在感染条件下接触）给植物病 毒，从而抑制植物病毒的目标基因的表达。
[0264] 许多病毒属被土壤传播的游动孢子原生动物持续和非持续的传播。这些原生动物 不是病毒病原体本身，而是寄生性的。当病毒与植物根结合时，便发生病毒的传播。实例包 括显示在谷类作物中传播植物病毒病的禾谷多粘菌和传播甜菜坏死 黄脉病毒的甜菜多粘菌。原生质动物（Plasmodiophorid)还在植物根中 造成其它病毒可通过其进入的创伤。
[0265] 可按照本发明的教导靶向的病毒的具体实例包括但不限于： (1)感染植物、尤其烟草和茄科（Solanaceae)的其它成员的烟草花叶病毒（TMV，RNA 病毒）。
[0266] (2)引起代表35个植物科的许多经济上重要的植物（包括双子叶植物和单子叶 植物）的严重病害的番茄斑萎病毒（TSWV，RNA病毒）。观赏植物、蔬菜和大田作物的这种 广泛的宿主范围是在植物感染性病毒中独有的。属于地中海地区的番茄斑萎病毒影响蔬菜 作物，尤其是番茄、胡椒和莴苣（Turina等，2012，A/r Tfes 84;403-437)。
[0267] (3)被粉虱传播的番茄黄曲叶病毒（TYLCV)主要影响番茄植物。菜豆金色花叶 病毒属（Begomovirus)(包括 sweepoviruses 和 Iegumoviruses)中的双粒病毒组（DNA 病毒）一影响多种栽植作物（包括木薯、甘薯、菜豆、番茄、棉和籽用豆类）的最具破坏性的 病原体（Rey等，2012，Viruses 4;1753-1791)。成员包括上述TYLCV和番茄曲叶病毒 (ToLCV)。
[0268] (4)黄瓜花叶病毒（CMV) - CMV具有广泛的宿主，并侵染种类繁多的蔬菜、观赏植 物和其它植物（多至40个科中的191个宿主种）。被受黄瓜花叶病影响的最重要的蔬菜为 辣椒a/wm/? Z.)、葫芦、番爺Mill.)和香蕉（ifesa L. spp.) 〇
[0269] 其它蔬菜宿主包括：黄瓜、香瓜、南瓜、番茄、菠菜、芹菜、胡椒、水田芥、甜菜、甘薯、 芜菁、佛手瓜、小黄瓜、西瓜、南瓜、枸橼、葫芦、利马豆、蚕豆、洋葱、灌木樱、茄子、马铃薯、大 黄、胡萝卜、莳萝、茴香、欧洲防风、香芹菜、丝瓜和洋蓟（Chabbouh和Cherif, 1990，FAO Plant Prot. Bull. 38:52-53)〇
[0270] 观赏植物宿主包括：翠菊、菊花、翠雀花、鼠尾草、天竺葵、吉莉草、唐菖蒲、天芥菜、 风信子、飞燕草、百合、金盏花、牵牛花、旱金莲、长春花、矮牵牛、天蓝绣球、金鱼草、郁金香 和百日草（Chupp 和 Sherf，1960 ;Agrios，1978)。
[0271] (5)马铃薯病毒Y (PVY)-影响马铃薯产量的最重要的植物病毒之一。
[0272] (6)花椰菜花叶病毒（CaMV，DNA 病毒（Rothnie 等，1994))。
[0273] (7)非洲木薯花叶病毒（ACMV)。
[0274] (8)李痘病毒（PPV)是来自李属的核果的最具破坏性的病毒病。
[0275] (9)雀麦花叶病毒（BMV) -通常感染无芒雀麦（i?ro皿51 和其它草，可存 在于小麦生长的几乎任何地方。
[0276] (10)马铃薯病毒X (PVX) -这个病毒没有昆虫或真菌传播媒介。该病毒在大多数 马铃薯变种引起轻微症状或无症状，但是当马铃薯病毒Y存在时，这些两种病毒间的协同 作用引起马铃薯的严重症状。
[0277] 其它病毒： 柑桔速衰病毒（CTV)-对柑桔造成最大经济损害的病害，包括酸橙（GirM 和嫁接到酸橙根莖上的任何柑桔属种、甜橙（C 葡萄柚（C parat/isi)、来樣和塞维利亚柑橘（C a?ra/?ii/b7ia)和桔（C 还已知 CTV Aeglopsis chevalieri、Afraegle paniculata、Pamburus missionis热级番签 graci/is)。CTV分布在全世界，柑桔树生长的任何地方都可发现。
[0278] 大麦黄矮病毒（BYDV)-最广泛分布的谷类病毒病。它影响经济上重要的作物种大 麦、燕麦、小麦、玉米、小黑麦和水稻。
[0279] 马铃薯卷叶病毒（PLRV)感染马铃薯和茄科的其它成员。
[0280] 番爺丛矮病毒（TBSV), RNA病毒，番爺丛矮病毒属（Tombusvirus)的成员，主要影 响番爺和爺子。
[0281] 其它综述： Hamilton 等，1981，J Gen Virol 54 ;223-241-提及 TMV、PVX、PVY、CMV、CaMV。
[0282] 其它科学著作： Makkouk等，2012，JoV Kirw1S Tfes 84; 367-402-影响豌豆和菜豆的具有狭窄（蚕豆 坏死黄化病毒（FBNYN))和宽泛（苜蓿花叶病毒（AMV)和CMV)宿主范围的病毒。
[0283] 植物病毒的目标基因编码对病毒病原体的生存力和/或感染性必不可少的产物， 因此其减量调节（通过裸dsRNA)导致病原体存活和感染宿主细胞的能力下降。因此，这种 减量调节导致对维持病毒病原体的生存力和/或感染性的"有害作用"，因为妨碍或降低病 原体从来源于宿主细胞的养分摄食和从中存活的能力。由于病毒病原体生存力和/或感染 性的这种降低，因此促进植物细胞中对被病原体感染的抗性和/或高的耐受性。可在成熟 (成体）期、未成熟（幼小）期或胚期靶向病原体中的基因。
[0284] 本文所用的"植物病毒抗性"性状是植物所特有的，引起植物宿主抵抗来自通常能 够使植物遭受损害或损失的病毒病