专利名称：一种靶向golph3基因干扰小分子rna及其抗胶质瘤迁移的用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种靶向G0LPH3基因干扰小分子RNA、其制备方法及应用。
背景技术：
RNA干扰(RNA interference,RNAi)是指由双链RNA介导的细胞内与其序列同源的mRNA发生特异性降解，从而导致基因表达沉默的现象，这是一种转录后水平的基因沉默机制。本发明的目的之一在于提供一种靶向G0LPH3基因干扰小分子RNA。本发明的目的之二在于提供该干扰小分子RNA的制备方法。本发明的目的之三在于提供该干扰小分子RNA的应用。为达到上述目的，本发明采用如下技术方案
一种用于抗胶质瘤迁移的干扰小分子RNA，其特征在于该基因为SEQ NO. 1所示的碱基序列。—种制备上述的用于抗胶质瘤迁移的干扰小分子RNA的方法，其特征在于该方法的具体步骤为根据MAGic载体设计的具体要求，设计对应于G0LPH3基因757-775位，即 GGT GAG ACA TGG AAT CCA T的shRNA的寡核苷酸序列，各为57bp，送华大基因研究中心进行合成；所述的shRNA的寡核苷酸序列为
SEQ NO. 1
Sense: 5' -CCG GGG TGA GAC ATG GAA TCC ATC TCG AGA TGG ATT CCA TGT CTC ACC TTT TTT g -3'
Anti-sense:5，-MT TCA AAA AAG GTG AGA CAT GGA ATC CAT CTC GAG ATG GAT TCC ATG TCT CAC C -3，；
根据MAGic载体设计的具体要求，将设计的shRNA的寡核苷酸序列引物和MAGic质粒进行连接，得到用于抗胶质瘤迁移的干扰小分子RNA。一种上述的用于抗胶质瘤迁移的干扰小分子RNA在制备抗胶质瘤迁移的分泌药物中的应用。本发明设计对抗胶质瘤迁移有关联的基因的RNAi，并应用胶质瘤细胞模型研究其对抗胶质瘤增殖并促其凋亡的促进作用，为RNAi在胶质瘤的治疗应用提供了一种新方法。
图1为shRNA的寡核苷酸序列引物和P-k质粒的连接图。 图2 (A)为正常U251细胞的迁移。 图2 (B)转染过G0LPH3-RNAi细胞的迁移。
具体实施例方式
一、胶质瘤细胞的培养胶质瘤细胞U251细胞系培养于37°C，5%C02恒温培养箱。对数生长期的细胞用胰酶消化脱壁，之后加入适量培养液并反复吹打以混勻细胞；将得到的细胞悬液移入15ml离心管中，1500rpm离心3min ；去上清；用5ml无菌1 XPBS将细胞悬起，吹打混勻；加约Iml细胞悬液于装有5ml新鲜培养基的新培养瓶中，放入37°C，5%C02培养箱中培养，约2天左右传代1次(主要查看细胞有无铺满培养瓶)。二、人脑胶质瘤细胞的分离取人脑胶质瘤手术标本，浸入4°C的KRBB溶液中. 清洗二次，然后将标本剪成小块，转移至盛有5mL消化酶液的三角瓶中，于恒温摇床中 37 °C保温，摇床转速lOOr/min，每IOmin玻璃管反复吹打一次，放置30min。将该悬液离心500-1000rpm，5min，最后剩下为胶质瘤细胞.用细胞培养液悬起沉淀，在黑背景的显微镜下观察可发现到呈圆形的胶质瘤细胞。三、G0LPH3_RNAi质粒的设计和转染根据RNAi载体设计的具体要求，设计对应于 G0LPH3基因757-775位，即GGT GAG ACA TGG AAT CCA T的shRNA的寡核苷酸序列，各为 57bp，送华大基因研究中心进行合成；所述的shRNA的寡核苷酸序列为
SMADl-RNAi对应的序列为 SEQ NO. 1
Sense: 5' -CCG GGG TGA GAC ATG GAA TCC ATC TCG AGA TGG ATT CCA TGT CTC ACC TTT TTT g -3'
Anti-sense:5，-AAT TCA AM AAG GTG AGA CAT GGA ATC CAT CTC GAG ATG GAT TCC ATG TCT CAC C -3，；
根据MAGic中载体设计的具体要求，将设计的G0LPH3 -RNAi的干扰片段和MAGic质粒连接，参见图1，然后转染进胶质瘤细胞。G0LPH3-RNAi质粒的转染转染前一天，在含有5ml无抗生素的DMEM生长培养基的60-mm培养皿里种上2 X IO6个胶质瘤细胞。铺板后第二天准备转染首先用500 μ 1 无血清的培养基(DMEM)溶解8. 0 μ g的SMADl-RNAi表达载体，用500 μ 1培养基(DMEM或 RPMI1640)溶解Lipof ectamine 2000 (20 μ 1)，轻轻地混勻，室温孵育5分钟。孵育后，为促使shRNA表达载体与LipOfectamineTM2000充分结合，将它们轻轻混勻，室温孵育20分钟， 以形成 DNA-Lipofectamine 2000 的复合物。将 DNA-Lipofectamine 2000 复合物加入到 60mm培养皿，之后将含有DNA-Lipof ectamine 2000复合物的细胞培养皿放入37°C，5% CO2 培养箱内培养6小时，换上正常细胞培养液。四、实验分组与检测指标正常对照组胶质瘤细胞，培养液为胶质瘤细胞培养液；RNAi组转染过G0LPH3-RNAi的胶质瘤细胞，培养液为胶质瘤细胞培养液。胶质瘤细胞迁移的检测
将贴壁细胞培养皿的定点拍照部位做好标记，用ΙΟΟΟμΙ tip在底部轻轻划线(垂直 90度，用力均勻)，确保划线处无细胞。划线两侧间距为average gaps (AGs)。连续两天倒置显微镜下100X下拍照，记录各组细胞的AGs，即细胞的迁移情况。如图2(A)和图2(B)。图2 (A)正常U251细胞的迁移。实验结果表明，胶质瘤细胞U251的迁移的细胞数量和AVGs均呈时间依赖性。图2 (B)转染过G0LPH3-RNAi的U251细胞的迁移。实验结果表明，胶质瘤细胞 U251的迁移随时间的延长和对照相比细胞迁移的数量和细胞迁移的AVGs均有所下降。图中标尺的长度为500um。五、结果转染过G0LPH3_RNAi干扰质粒的胶质瘤的细胞迁移数量减少，细胞的
4AVGs减少。该实验结果表明，通过RNAi技术下调胶质瘤中的G0LPH3表达抑制了胶质瘤的迁移。
权利要求
1.一种靶向G0LPH3基因干扰小分子RNA及其抗胶质瘤迁移的用途，其特征在于该基因为SEQ NO. 1所示的碱基序列。
2.一种制备根据权利要求1所述的用于抗胶质瘤迁移的干扰小分子RNA的方法，其特征在于该方法的具体步骤为根据MAGic载体设计的具体要求，设计对应于G0LPH3基因 757-775位，S卩GGT GAG ACA TGG AAT CCA T的shRNA的寡核苷酸序列，各为57bp，送华大基因研究中心进行合成；所述的shRNA的寡核苷酸序列序列为SEQ NO. 1 Sense: 5' -CCG GGG TGA GAC ATG GAA TCC ATC TCG AGA TGG ATT CCA TGT CTC ACC TTT TTT g -3'Anti-sense:5，-AAT TCA AAA AAG GTG AGA CAT GGA ATC CAT CTC GAG ATG GAT TCC ATG TCT CAC C -3，；依据pMAGic载体设计的要求，将设计的shRNA序列和MAGic质粒进行连接，得到用于抗胶质瘤迁移的干扰小分子RNA。
3.根据权利要求1所述的用于抗胶质瘤迁移的干扰小分子RNA及其在制取抗胶质瘤迁移药物中的应用。
全文摘要
本发明涉及一种靶向GOLPH3基因干扰小分子RNA、其制备方法及应用。该干扰小分子RNA为SEQNO.1所示的碱基序列。本发明设计对抑制胶质瘤迁移有作用的基因的干扰小分子RNA，应用胶质瘤细胞模型研究其对胶质瘤迁移的抑制作用，为胶质瘤的基因治疗提供了一种新方法。
文档编号A61P35/04GK102465125SQ201010531309
公开日2012年5月23日 申请日期2010年11月4日 优先权日2010年11月4日
发明者叶思灵, 夏清梅, 殷姗, 潘讴东, 陈国泽 申请人:上海生博医学生物技术有限公司