原体的攻击。一旦向病毒病原体提供包含裸dsRNA的植 物物质，目标病毒内基因的表达被dsRNA抑制，且目标病毒中基因表达的抑制引起植物对 病毒的抗性。
[0285] 为了证实抗病毒活性，本文的教导还考虑了观察在所述提供后可感染性或可复制 性和宿主症状程度的降低。
[0286] 为了提高抗病毒活性，本发明的实施方案还提供含有两种或更多种分别对同一植 物病毒有毒的不同作用剂的组合物，其至少一种包含本文所述dsRNA。在某些实施方案中， 第二作用剂可为选自以下的作用剂：参与氨基酸或碳水化合物合成的代谢酶的抑制剂；细 胞分裂的抑制剂；细胞壁合成抑制剂；DNA或RNA合成抑制剂、促旋酶抑制剂、微管蛋白装配 抑制剂、ATP合成抑制剂；氧化磷酸化解偶联剂；蛋白质合成抑制剂；MP激酶抑制剂；脂质 合成或氧化抑制剂；留醇合成抑制剂和黑色素合成抑制剂。
[0287] 另外，按照本发明的教导产生的植物或其部分可显示营养或治疗效能改变，因此 可应用于食物或饲料和药物工业。同样地，按照本发明的教导产生的植物或其部分可显示 油或纤维素含量改变，因此可在建造业或油工业中实施。
[0288] 可将本发明的种子包装在包含大量种子的含种子装置中，其中至少一些（例如 5%、10%或更高）含有外源裸dsRNA，其中种子缺乏驱动dsRNA表达的异源启动子。
[0289] 含种子装置可以是袋、塑料袋、纸袋、软壳容器或硬壳容器。
[0290] 可将本发明的试剂包装在试剂盒中，所述试剂盒包括裸dsRNA、将dsRNA引入种子 中的说明书和任选引发溶液。
[0291] 如有需要，本发明一些实施方案的组合物可以包装或分配装置提供，所述装置可 装有含有活性成分的一种或多种剂型。例如，包装可包含金属箔或塑料箔，例如泡罩包装。 包装或分配装置可附有用于引入到种子中的说明书。
[0292] 按照示例性的实施方案，裸dsRNA和引发溶液装在单独的容器中。
[0293] 本文所用术语"约"是指± 10%。
[0294] 术语"包含"、"含"、"包括"、"装有"、"具有"及其变化形式意指"包括但不限于"。
[0295] 术语"由……组成"意指"包括并限于"。
[0296] 术语"基本由……组成"意指组合物、方法或结构可包括额外的成分、步骤和/或 部分，但只要该额外的成分、步骤和/或部分不实质性地改变所要求保护的组合物、方法或 结构的基本的和新的特性。
[0297] 本文所用的单数形式"a"、"an"和"the"包括复数对象，除非文中另有明确规定。 例如，术语"一种化合物"或"至少一种化合物"可包括多种化合物，包括其混合物。
[0298] 在整个申请书中，本发明的不同实施方案以范围格式提供。应理解，范围格式中的 描述只是出于方便和简明，不应解释为对本发明范围的不可变更的限制。因此，范围的描述 就视为明确公开了所有可能的亚范围以及该范围内的各个数值。例如，范围的描述例如1-6 应视为明确公开了亚范围，例如1-3、1_4、1-5、2-4、2-6、3-6等，以及该范围的各个数字，例 如1、2、3、4、5和6。不论范围宽度都适用。
[0299] 每当本文规定数字范围时，是指包括规定范围内的任何引用的数字（分数或整 数）。短语"介于"第一标示数值和第二标示数值"之间的范围"和"从"第一标示数值"到" 第二标示数值"之间的范围"在本文中可互换使用，意指包括第一和第二标示的数值和其间 的所有分数和整数。
[0300] 本文所用术语"方法"是指完成指定任务的方式、手段、技术和程序，包括但不限于 化学、药理学、生物学、生物化学和医学领域从业人员已知的或化学、药理学、生物学、生物 化学和医学领域从业人员自已知的方式、手段、技术和程序容易开发的方式、手段、技术和 程序。
[0301] 要认识到，为清楚起见，在单独的实施方案的情况下描述的本发明的某些特征，也 可在单一实施方案中组合提供。相反，为简明起见，在单一实施方案的情况下描述的本发明 的各种特征，也可单独或以任何合适的亚组合或合适时以本发明的任何其它所述实施方案 提供。在不同实施方案的情况下描述的某些特征不应视为所述实施方案的必需特征，除非 没有所述要素时实施方案无法实施。
[0302] 在下面的实施例中提供对上文描述的和随附权利要求书中所要求保护的本发明 的不同实施方案和方面的实验支持。 实施例
[0303] 下面参照以下实施例，连同上文描述，以非限制性方式对本发明进行说明。
[0304] 通常，本文所用命名法和用于本发明的实验室程序包括分子、生物化学、微生物 学和重组DNA技术。在文献中详尽解释了所述技术。参见例如"Molecular Cloning: A laboratory Manual" Sambrook 等， (1989) ；uCurrent Protocols in Molecular Biology" 第 I-III 卷，Ausubel，R. M.编辑（1994) ;Ausubel 等，"Current Protocols in Molecular Biology"， John Wiley 和 Sons， Baltimore, Maryland (1989) ;Perbal， "A Practical Guide to Molecular Cloning"， John Wiley 和 Sons， New York (1988); Watson等，"Recombinant DNA"，Scientific American Books, New York ;Birren等（编 辑）"Genome Analysis: A Laboratory Manual Series"，第 1-4卷，Cold Spring Harbor Laboratory Press，New York (1998);美国专利号 4,666,828、4,683,202、4,801，531、 5, 192, 659 和 5, 272, 057 提供的方法；"Cell Biology: A Laboratory Handbook"，第 I-III 卷，Cellis，J. Ε·编辑（1994) ;Freshney 的"Culture of Animal Cells - A Manual of Basic Technique"，Wiley-Liss，N. Y. (1994)，第3版；"Current Protocols in Immunology" 第 I-III 卷，Coligan J. E.编辑（1994) ;Stites 等（编辑），"Basic and Clinical Immunology"（第 8 片反），Appleton & Lange, Norwalk, CT (1994)； Mishell 和 Shiigi (编辑），"Selected Methods in Cellular Immunology"，W. H. Freeman and Co.，New York (1980);可获得的免疫测定广泛描述于专利和科技文献，参 见例如美国专利号 3, 791，932、3, 839, 153、3, 850, 752、3, 850, 578、3, 853, 987、3, 867, 517、 3, 879, 262、3, 901，654、3, 935, 074、3, 984, 533、3, 996, 345、4, 034, 074、4, 098, 876、 4,879,219、5,011，771 和 5, 281，521 ;"01igonucleotide Synthesis" Gait，M. J.编 辑（1984) ;"Nucleic Acid Hybridization" Hames，Β· D.和 Higgins S. J·，编辑. (1985) ,Transcription and Translation" Hames，Β· D.和 Higgins S. J·，编辑. (1984) ;"Animal Cell Culture" Freshney，R. I.编辑（1986) ^'Immobilized Cells and Enzymes" IRL Press，（1986) ;"A Practical Guide to Molecular Cloning" Perbal，B.， (1984)和 "Methods in Enzymology" 第 1-317 卷，Academic Press ;"PCR Protocols: A Guide To Methods and Applications"， Academic Press, San Diego, CA (1990)； Marshak 等，"Strategies for Protein Purification and Characterization - A Laboratory Course Manual" CSHL Press (1996);所有文献都通过引入并入就像在本文全 部提供一样。本文件全文中提供了其它通用参考文献。其中的程序被认为是本领域众所周 知的，出于读者方便而提供。其中所含全部信息通过引用结合到本文中。
[0305] 实施例1 用于dsRNA产生和种子处理的方案 产生dsRNA/siRNA序列 采用PCR产物的体外转录，定制各基因的dsRNA序列。使用在任一侧含有T7启动子 序列的基因特异性引物，PCR扩增mRNA的部分，包括用于dsRNA产生的0RF、3' UTR或5' UTR。使用商用试剂盒例如MaxiScript dsRNA试剂盒（Life Technologies)或T7高产量 RNA合成试剂盒（NEB)，将该产物用作dsRNA产生的模板。接下来，在37 °C下将样品用DNase Turbo处理15-30分钟，接着苯酚处理和核酸沉淀。接下来，进行了两个不同的反应之一： (I) dsRNA 备好待用，（2) dsRNA 用 Dicer (Shortcut RNA 酶 III (NEB))加工以产生小干 扰 RNA (siRNA)。
[0306] 如下所述将任一种dsRNA或dsRNA和siRNA的组合用于种子处理。本文提供的所 有dsRNA序列作为DNA列出（通过转化T>U来进行简单转化）。
[0307] 使用dsRNA/siRNA混合物的基因沉默的通用种子处理方案 无涂层的有机玉米种子来自变种"popcorn"，无涂层的有机整粒水稻种子和有机大豆 购自 Nitsat Haduvdevan (Israel)。小麦种子来自 A.B. Seeds (Israel)。莴苣种子来自 变种Sun Valley。新鲜番茄种子采自内部繁殖的M82番茄果实。在处理之前，将无涂层的 或新鲜植物种子用重蒸水（DDW)洗涤4小时。接下来，将种子在20-30°C下干燥直到24小 时。在干燥步骤后，种子用含有dsRNA制剂的溶液处理，该溶液由含终浓度为1-261 Pg/ml 的dsRNA的0,1mM EDTA制成。在无光生长室中在15-25°C下，通过在溶液中轻轻振荡种子 直到60小时，来进行处理。最后，短暂洗涤种子达到3次，种植在土壤中，或在无光生长室 中在25°C下萌发并种植在土壤中，或干燥0-30小时和在无光生长室中在25°C下萌发并种 植在土壤中，或直接种植在土壤中。以类似方式，用没有dsRNA或具有非特异性dsRNA的制 剂处理对照种子。
[0308] 实施例2 水稻、番茄和高粱苗中DSRNA的稳定性 作为植物中不存在/不表达的外源基因的实例，采用实施例1所述方案，将编码复制酶 和CGMMV (黄瓜绿斑花叶病毒，登记号AF417242)的外被蛋白的ORF用作植物种子dsRNA 处理的靶标。将水稻、番茄和高粱种子在20°C下洗涤4小时，将番茄和高粱在30°C下干燥， 水稻在20°C下干燥过夜。对于水稻，将种子在15°C下用132.7 Pg/ml dsRNA (终浓度）直 接处理39小时，如图1所示；对于番茄用93. 8 Pg/ml dsRNA (终浓度）处理48小时，如图 2A所示，对于高粱用75 Pg/ml dsRNA (终浓度）处理40小时，如图2B所示。简单地说，用 在其5'含有T7序列（5'-TAATACGACTCACTATAGGG-3'，SEQ ID NO: 1)的特别设计的正向和 反向引物，通过PCR扩增病毒来源的ORF (参见下表1)。PCR产物用琼脂糖凝胶纯化，因为 它们在两端携带T7启动子，因此用作T7依赖性体外转录的模板，产生CGMMV基因的dsRNA 产物。对持家基因微管蛋白的PCR用作阳性对照（正向引物5'-GGTGCTCTGAACGTGGATG-3' (SEQ ID NO: 2)和反向引物 5, -CATCATCGCCATCCTCATTCTC-3,（SEQ ID NO: 3))。
[0309] 表1:PCR引物用作体外转录的模板和CGMMV和CGMMV dsRNA产物的检测。
【主权项】
1. 一种将裸dsRNA引入种子的方法，所述方法包括在允许dsRNA渗透入种子的条件下 使种子与裸dsRNA接触，从而将dsRNA引入种子中。
2. -种包含外源裸dsRNA的分离种子，其中所述种子缺乏驱动所述dsRNA在植物中表 达的异源启动子。
3. -种包含外源裸dsRNA的分离种子。
4. 一种分离种子，其包含以相似浓度存在于种子的胚和胚乳中的外源dsRNA。
5. -种分离种子，其包含空间上分布在植物种子的胚和胚乳中的外源dsRNA，所述空 间分布不同于来源于重组表达所述外源dsRNA的转基因植物的种子中所述外源dsRNA的空 间分布。
6. -种包含外源dsRNA的分离种子，其中在所述种子中所述外源dsRNA与由其成熟的 siRNA的浓度比例与重组表达所述外源dsRNA的转基因种子相比较高。
7. -种包含外源dsRNA的分离种子，其中所述植物种子缺乏用于驱动所述外源dsRNA 表达的异源启动子，其中所述外源dsRNA和/或由其成熟的siRNA在所述种子中的空间分 布与重组表达所述外源dsRNA的转基因种子相比发生改变。
8. -种植物或植物部分，其包含外源裸dsRNA和缺乏驱动所述dsRNA在所述植物中表 达的异源启动子。
9. 一种含种子的装置，其包含大量的权利要求2-7中任一项的种子。
10. -块播种田，其包含大量的权利要求2-7中任一项的种子。
11. 一种产生植物的方法，所述方法包括： (a) 提供权利要求2-7中任一项的种子；和 (b) 使种子萌发以产生植物。
12. -种调节基因表达的方法，所述方法包括： (a) 在允许dsRNA渗透入种子的条件下使植物的种子与裸dsRNA接触，从而将dsRNA 引入种子中；和任选 (b) 产生种子的植物。
13. 权利要求12的方法，其中所述基因表达与植物对非生物胁迫或生物威迫的耐受 性有关。
14. 权利要求12的方法，所述方法还包括在所述接触后将所述种子干燥。
15. 权利要求13的方法，所述方法还包括在所述产生后使所述植物在非生物胁迫或 生物胁迫下生长。
16. 权利要求1或12的方法，其中设计所述裸dsRNA用于减量调节植物基因的表达。
17. 权利要求16的方法，其中所述植物基因是内源基因。
18. 权利要求1或12的方法，其中设计所述裸dsRNA用于减量调节病毒病原体基因的 表达。
19. 权利要求1或12的方法，其中所述渗透是进入所述种子的胚乳中并且备选地或另 外地进入所述种子的胚中。
20. 权利要求1或12的方法，其中所述裸dsRNA不整合至所述种子的基因组中。
21. 权利要求1或12的方法，其中所述条件导致在萌发后所述dsRNA在植物中存在至 少10天。
22. -种抑制植物病毒中目标基因的表达的方法，所述方法包括向植物病毒提供权利 要求8的植物或植物部分，从而抑制植物病毒中目标基因的表达。
23. 权利要求22的方法，所述方法还包括观察在所述提供后所述病毒病原体可感染 性或可复制性的降低。
24. -种将裸dsRNA引入种子中的试剂盒，其包括； ⑴裸dsRNA;和 (ii)引发溶液。
25. 权利要求24的试剂盒，其中所述裸dsRNA和所述引发溶液装在分开的容器中。
26. 权利要求1或12的方法、权利要求2或3的种子、权利要求8的植物或植物部分， 其中所述dsRNA包含siRNA。
27. 权利要求1或12的方法、权利要求2或3的种子、权利要求8的植物或植物部分， 其中所述dsRNA包含siRNA和dsRNA。
28. 权利要求1的方法，其中所述接触通过用所述dsRNA接种种子来实行。
29. 权利要求1的方法，所述方法还包括在所述接触前引发种子。
30. 权利要求29的方法，其中所述引发如下实行： (i) 在所述接触前洗涤种子；和 (ii) 在步骤（i)后将种子干燥。
31. 权利要求30的方法，其中所述洗涤在双重去离子水存在下实行。
32. 权利要求30的方法，其中所述洗涤实行2-6小时。
33. 权利要求30的方法，其中所述洗涤在4-28°C下实行。
34. 权利要求30的方法，其中所述干燥在25-30°C下实行10-16小时。
35. 权利要求1的方法，其中所述接触在终浓度为0. 001-100呢/沿的裸dsRNA存在 下实行。
36. 权利要求的35方法，其中所述接触在终浓度为0. 001-0. 5呢/沿的裸dsRNA存在 下实行。
37. 权利要求1的方法，所述方法还包括在所述接触后用选自杀虫剂、杀真菌剂、杀昆 虫剂、肥料、涂布剂和着色剂的作用剂处理种子。
38. 权利要求37的方法，其中所述处理包括用所述作用剂涂布种子。
39. 权利要求2或9的种子，其不含选自杀虫剂、杀真菌剂、杀昆虫剂、肥料、涂布剂和 着色剂的作用剂。
40. 权利要求1的方法、权利要求2或3的种子、权利要求8的植物或植物部分，其中 所述dsRNA用于减量调节编码基因的表达。
41. 权利要求1的方法、权利要求2-7中任一项的种子、权利要求8的植物或植物部 分，其中所述dsRNA用于减量调节非编码基因的表达。
42. 权利要求1的方法、权利要求2-7中任一项的种子、权利要求8的植物或植物部 分，其中所述种子是绿色植物界总科的。
43. 权利要求1或12的方法，其中所述条件允许所述dsRNA在种子的胚乳中蓄积以及 备选地或另外地在种子的胚中蓄积。
44. 权利要求1或12的方法，其中按照选自以下的参数调节裸dsRNA的浓度：种子大 小、种子重量、种子体积、种子表面积、种子密度和种子透性。
45. 权利要求1的方法，其中所述接触在打破种子休眠和胚出现之前实行。
46. 权利要求1的方法，其中所述种子是经引发的种子。
47. 权利要求2-7中任一项的种子或权利要求8的植物，其包含扩大dsRNA表达的依 赖于RNA的RNA聚合酶活性。
48. 权利要求2-10的种子，其是杂种种子。
49. 一种按照本文所述方法可获得的种子。
【专利摘要】提供一种将裸dsRNA引入种子中的方法。所述方法包括在允许dsRNA渗透入种子的条件下使种子与裸dsRNA接触，从而将dsRNA引入种子中。
【IPC分类】C12N15-113
【公开号】CN104619843
【申请号】CN201380039346
【发明人】A.阿夫尼伊, E.里多尔-尼里, R.茂尔, O.梅尔, O.奈维特-布里克, O.亚奈-阿祖拉
【申请人】A.B.种子有限公司
【公开日】2015年5月13日
【申请日】2013年5月23日
【公告号】CA2873828A1, EP2855680A1, US20130318657, US20150096079, WO2013175480A1