一个育性调控基因OsRPLP0及其应用
【专利摘要】本发明公开了一个育性调控基因OsRPLP0及其应用，属于植物生物技术领域，具体涉及一个水稻酸性核糖体磷酸化蛋白OsRPLP0，编码所述蛋白的基因突变后可以导致植株雄性不育。本发明提供的育性基因以及基于该基因突变所产生的雄性不育系，该不育系的育性稳定、不受环境条件影响、能够被野生型转基因恢复。该基因以及该基因突变产生的不育系为构建新型杂交育种体系提供了必要的元件，在生产实践中具有重要的意义。
【专利说明】
-个育性调控基因 OsRPLPO及其应用
技术领域
[0001]本发明属于植物生物技术领域，具体涉及一个水稻酸性核糖体磷酸化蛋白 OsRPLPO,编码所述蛋白的基因突变后可以导致植株雄性不育，本发明还公开了 OsRPLPO基 因及其突变体在杂交育种中的应用。 技术背景
[0002] 原核生物和真核生物的核糖体大亚基上都存在着一类与蛋白质翻译密切相关的 酸性核糖体磷酸化蛋白。在真核生物它们是酸性核糖体磷酸化蛋白P〇，P1，P2 (acidicribosomal phosphoproteins ΡΟ,ΡΙ and P2)，而在原核生物如Escherichia coli 体内，它们分别为L10和L7/L12蛋白，其中与P0蛋白相对应的蛋白为L10，与PI、P2蛋白相对 应的蛋白为L7/L12。原核生物和真核生物的酸性核糖体磷酸化蛋白在结构和功能上具有高 度的同源性，所不同的是在原核生物，L7/L12蛋白是由同一基因编码的，只是在翻译过程 中，相比于L12蛋白，L7蛋白的N末端被显著的乙酰化了，而在真核生物，这三种酸性核糖体 磷酸化蛋白则都是由独立基因编码的。目前，对于原核生物的L10和L7/L12蛋白研究得比较 广泛，但对真核生物的酸性核糖体磷酸化蛋白P0、P1、P2的研究则大多是基于在原核生物的 L10和L7/L12蛋白研究上同源推测，其参与翻译延伸的机制仍未完全明了。已有研究证实真 核生物的酸性核糖体磷酸化蛋白还与细胞凋亡、肿瘤的发生侵袭及免疫性疾病有关。
[0003] 本发明公开了一个水稻酸性核糖体磷酸化蛋白0sRPLP0(60S acidic ribosomal protein P0)基因，所述基因突变后植株出现无花粉型的雄性不育表型。为了解决目前水稻 杂交种育种方法中存在的缺陷，如不育系的稳定性、杂交品种资源的局限性、制种技术复 杂、制种成本高等技术瓶颈，人们正在尝试新的杂交育种技术，新型的杂交育种技术将充分 利用隐性纯合后导致雄性不育的核基因，构建育性稳定不受环境影响的不育系，解除环境 因素对杂交育种的制约，消除生产上的潜在风险；同时，所利用的隐性核不育基因应该适用 于绝大多数品种，使杂种优势资源利用大幅提高，解决杂种优势的资源利用问题;本发明即 提供了一种作物育性基因以及基于该基因突变所产生的雄性不育系，该不育系的育性稳 定、不受环境条件影响、能够被野生型转基因恢复。该基因以及该基因突变产生的不育系为 构建新型杂交育种体系提供了必要的元件。
[0004] 发明简述
[0005] 本发明提供了一个OsRPLPO基因及其DNA序列，所述OsRPLPO基因具有调控植物育 性的功能，其DNA序列如SEQ ID NO: 1或5所示，本发明所述的OsRPLPO基因的核苷酸序列也 包括在严格条件下能够与序列SEQ ID N0:1或5的DNA杂交的DNA序列，或与序列SEQ ID N0: 1或5互补的DNA序列。
[0006] 本发明还提供了一个育性调控基因 OsRPLPO的氨基酸序列，所述氨基酸序列如SEQ ID N0:2或6所示。
[0007] 本发明还提供了一种表达盒，其特征在于所述表达盒包含如SEQ ID NO: 1或5所示 的DNA序列。
[0008] 本发明还提供了 一种表达载体，其特征在于所述表达载体包含上述的表达盒。
[0009] 本发明还提供了一种工程菌，其特征在于所述工程菌包含上述的表达载体。
[0010] 本发明还提供了一种基因在植物育性调控中的应用，其特征在于，所述育性调控 基因的核苷酸序列如SEQ ID NO: 1或5所示。
[0011]本发明还包括一种通过突变育性调控基因 SEQ ID NO: 1或5获得雄性不育材料的 方法。
[0012] 本发明中所述的"突变"包括在育性调控基因的核苷酸序列上进行取代、插入或缺 失一个或多个核苷酸。
[0013] 本发明还提供了一种恢复由相应的SEQ ID NO: 1或5所示基因突变所导致的雄性 不育，使雄性不育突变体恢复成可育的方法。
[0014] 本发明还包括一种突变体材料的应用，其特征在于所述突变材料是由核苷酸序列 的突变所造成，所述核苷酸序列如SEQ ID NO: 1或5所示。
[0015] 上述"突变"可以是点突变，也可以是DNA缺失或插入突变。所述"突变"可以通过化 学诱变或基因定点突变的方式获得，化学诱变的方法包括用EMS等诱变剂处理所导致的诱 变；基因定点突变的方法包括但不限于ZFN定点突变方法、TALEN定点突变方法、和/或 CRISPR/Cas9等定点突变方法。
[0016] 本发明还提供了将上述材料和DNA序列应用于育种中的方法，更具体地所述应用 是指将突变体植株作为不育系母本，与恢复系杂交，生产杂交种子。
[0017] 本发明还包括上述DNA序列在以下(a)至(d)中任一项中的应用：
[0018] (a)培育植物品种或品系；
[0019] (b)培育授粉受精能力增强的植物品种或品系；
[0020] (c)培育授粉受精能力消弱的植物品种或品系；
[0021 ] (d)培育雄性不育植物品种或品系。
[0022]本发明还提供了一种用于保持雄性不育植株的纯合隐性状态的方法，所述方法包 括：
[0023] a)提供第一植株，其包含OsRPLPO基因的纯合隐性突变，并且其是雄性不育的； [0024] b)向第一植株中引入下述构建体，形成第二植株，所述第二植株包含OsRPLPO基因 的纯合隐性突变等位基因和所述构建体，且构建体在第二植株中为杂合状态，所述构建体 包含：
[0025] i)第一核苷酸序列，其包含正常OsRPLPO核苷酸序列，当在第一植株中表达时，其 将恢复该植株的雄性生育力；
[0026] ii)第二核苷酸序列，当其表达时，会抑制所述第二植株中可育雄性配子的形成或 功能，具体为花粉失活基因 ZM-PA;和
[0027] c)用所述第二植株的雄性配子使所述第一植株受精，以产生保持了所述第一植株 纯合隐性状态的后代。
【附图说明】
[0028]图1是植株形态，左为野生型HHZ，右为突变体osrplpO。
[0029]图2是花药形态，其中左为野生型HHZ(黄华占）的花药形态，右为突变体osrplpO的 花药形态。
[0030]图3是花粉I2-KI染色，其中左为野生型HHZ的花粉染色结果，右为突变体osrplpO 的花粉染色结果。
[0031 ] 图4是OsRPLPO基因的cDNA编码区在粳稻日本晴(Nip)、野生型黄华占（HHZ)和突变 体osrp ΙρΟ材料中的核苷酸比对结果。
[0032] 图5是粳稻日本晴(Nip)、野生型黄华占（HHZ)和突变体osrplpO材料中的OsRPLPO 蛋白的氨基酸序列比对结果。
[0033] 图6是OsRPLPO基因在水稻中的时空表达模式，其中Root为根，Stem为茎，Leaf为 叶，Glume为外稃，Lemma是内稃，Pal ea是颖片，Pistil是雌蕊，an_st6是幼穗颖花原基分化 期（stage6)，an_st7是幼穗花粉母细胞减数分裂时期（stage7)，an_st8是四分体形成阶段 (8七&868)，311_8七9是小孢子早期（8七3869)，311_81：10是小孢子中晚期（8七38610)，311_81：11是 二胞花粉期，an_stl2是成熟花粉期（stagel2)。
[0034]图7是OsRPLPO基因在野生型与突变体材料中的表达变化情况，其中st7是幼穗花 粉母细胞减数分裂时期（stage7)，st8是四分体形成阶段（stage8)，St9是小孢子早期 (stage9)，st 10是小孢子中晚期（stage 10)，st 11是二胞花粉期，st 12是成熟花粉期 (stagel2)〇
[0035] 发明详述
[0036] 本文提到的所有参考文献都通过引用并入本文。
[0037] 除非有相反指明，本文所用的所有技术和科学术语都具有与本发明所属领域普通 技术人员通常所理解的相同的含义。除非有相反指明，本文所使用的或提到的技术是本领 域普通技术人员公知的标准技术。材料、方法和例子仅作阐述用，而非加以限制。
[0038] 本发明包括一种育性相关基因及其核苷酸和蛋白序列，还包括通过操作该基因在 调控植株雄性生育力中的应用。非限制性地举例而言，下文描述的任何方法都可与本发明 所提供的相应核苷酸序列一起使用，例如，将所述育性基因的突变体序列引入植株以导致 植株雄性不育、使植株内源序列突变、向植株中引入该序列的反义序列、使用发卡形式、或 将其与其它核苷酸序列连接起来调控植株的表型，或者是本领域技术人员已知的可用于影 响植株的雄性生育力的多种方法中的任一方法。
[0039]本发明所提供的育性基因 OsRPLPO,是一个花粉发育相关的基因。在水稻中该育性 基因位于第8号染色体上，其在籼稻中的核苷酸编码序列如SEQ ID N0:1或7所示，氨基酸序 列如SEQ ID N0: 2所示；在粳稻中其核苷酸序列如SEQ ID N0: 5所示，其氨基酸序列如SEQ ID N0:6所示。
[0040] 本发明还包括下列组的序列之一:a)与上述OsRPLPO基因序列具有至少90% (优选 为至少95%)序列相似性，且具有相同功能的DNA序列;b)在严格条件下能够与(a)所述序列 的DNA杂交的DNA序列；c)与上述任一所述序列互补的DNA序列。
[0041] 上述所述育性基因，可从各种植物中分离获得。本领域技术人员应该知晓，本发明 所述的育性恢复基因包括与OsRPLPO基因高度同源，并且具有同样的育性调控功能的高度 同源的功能等价体序列。所述高度同源的功能等价体序列包括在严谨条件下能够与本发明 所公开的RPLP0基因的核苷酸序列杂交的DNA序列。本发明中所使用的"严谨条件"是公知 的，包括诸如在含400mM NaCl、40mM PIPES(pH6.4)和ImM EDTA的杂交液中于60°C杂交12- 16小时，然后在65°C下用含0.1SDS、和0.1 % SSC的洗涤液洗涤15-60分钟。
[0042] 功能等价体序列还包括与本发明所公开的OsRPLPO基因所示的序列有至少90%、 95%、96%、97%、98%、或99%序列相似性，且具有育性调控功能的0祖序列，可以从任何植 物中分离获得。其中，序列相似性的百分比可以通过公知的生物信息学算法来获得，包括 Myers和Miller算法（Bioinformatics，4( 1): 11-17，1988)、Needleman_Wunsch全局比对法 (了.]?〇1.81〇1.，48(3):443-53，1970)、511^让-?^^6^^11局部比对法（了.]\1〇1.81〇1.，147 :195-197，1981)、Pearson和Lipman相似性搜索法（PNAS，85(8) :2444-2448，1988)、Karl in和 Altschul的算法（Altschul等，J.Mol.Biol.，215(3) :403-410，1990;PNAS，90:5873-5877， 1993)。这对于本领域技术人员来说是熟悉的。
[0043]本发明所述的基因序列可以从任何植物中分离获得，包括但不限于芸苔属、玉米、 小麦、高粱、两节#属、白芥、蓖麻子、芝麻、棉籽、亚麻子、大豆、拟南芥属、菜豆属、花生、苜 蓿、燕麦、油菜籽、大麦、燕麦、黑麦（Rye)、粟、蜀黍、小黑麦、单粒小麦、斯佩尔特小麦 (Spelt)、双粒小麦、亚麻、格兰马草(Gramma grass)、摩擦禾、假蜀黍、羊茅、多年生麦草、甘 蔗、红莓苔子、番木瓜、香蕉、红花、油棕、香瓜、苹果、黄瓜、石斛、剑兰、菊花、百合科、棉花、 桉、向日葵、芸苔、甜菜、咖啡、观赏植物和松类等。优选地，植物包括玉米、大豆、红花、芥菜、 小麦、大麦、黑麦、稻、棉花和高粱。
[0044] 本发明还提供了通过影响OsRPLPO的核苷酸序列或者通过调控OsRPLPO基因的转 录表达从而影响植株育性的方法。所述影响植株育性是指通过调控OsRPLPO基因的表达，从 而使所述植株的育性发生改变，如导致植株雄性不育。具体地，取决于具体应用需求，可以 通过多种方法来影响OsRPLPO基因在植物体内的表达，从而达到调控植株雄性育性的效果。 更具体地，调控OsRPLPO基因的表达可以使用许多本领域普通技术人员可获得的工具进行， 例如，通过突变、诱变、反义基因的转入、共抑制或发夹结构的引入等，都可以用于破坏 OsRPLPO基因的正常表达，从而获得雄性不育的植株。另一方面，本发明还包括通过将野生 型OsRPLPO的核苷酸序列引入植株来恢复OsRPLPO表达被破坏的植株的雄性生育力。
[0045]本发明还提供了一种OsRPLPO基因的不育突变体序列及其雄性不育突变体材料。 更具体地，所述雄性不育突变体材料是通过突变水稻内源的OsRPLPO基因，或突变与其高度 同源的基因的核苷酸序列，使该植物体丧失雄性育性的过程。所述"突变"包括但不限于以 下方法，如用物理或化学的方法导致的基因突变，化学方法包括用EMS等诱变剂处理所导致 的诱变，所述突变还可以是点突变，也可以是DNA缺失或插入突变，还可以是通过RNAi、基因 定点突变等基因沉默手段产生。基因定点突变的方法包括但不限于ZFN定点突变方法、 TALEN定点突变方法、和/或CRISPR/Cas9等定点突变方法。
[0046]具体地，本发明还提供了一种水稻雄性不育突变体，其控制雄性育性的基因发生 突变，所述基因突变后的核苷酸序列如SEQ ID N0:3所示，氨基酸序列如SEQ ID N0:4所示。 与野生型相比，该基因 cDNA第379个碱基C突变为T，导致基因编码的氨基酸发生替换，由脯 氨酸Pro(CCC)突变为丝氨酸Ser(TCC)。本领域技术人员应该知晓，可以将所述核苷酸序列 SEQ ID N0:3构建到植物表达载体，进行植物转化，从而获得新的转基因的雄性不育突变体 材料。或者通过构建OsRPLPO基因的TALLEN或CRISPR/Cas9体系，转化植株，从而获得该植株 中OsRPLPO基因发生突变的雄性不育突变体。
[0047]本发明还包括含有OsRPLPO基因的构建体，所述构建体包括通常所说的载体或表 达盒。所述构建体中的启动子可以是天然启动子或被取代的启动子，其将驱动所连核苷酸 序列在植株中的表达。构建体中的启动子可以是诱导型启动子。当将OsRPLPO基因的核苷酸 序列与另一个启动子相连，优选的是，该启动子在花粉发育早期充分驱动该序列的表达，例 如可以在花粉发育的P9期特异性表达。具体地，可使用的启动子的种类包括组成型病毒启 动子，例如花椰菜花叶病毒(CaMV)19S和35S启动子，或玄参花叶病毒35S启动子，或泛素启 动子。
[0048] 组织特异表达启动子可用于靶向特定的植物组织中增强转录和/或表达。启动子 可在目标组织中表达也在其它植物组织中表达，可在目标组织中强烈表达以及比其它组织 程度低得多的表达，或者可高度优选在目标组织中表达。在一种实施方式中，启动子是偏好 在植物的雄性或雌性组织中特异表达的类型。本发明不必须在方法中使用任何特定的雄性 组织优先型启动子，本领域技术人员已知的很多此类启动子中的任何都可以使用。本文描 述的天然的RPLP0启动子是可使用的启动子的一个例子。另一种此类启动子是5126启动子、 MS45启动子、MS26启动子、BS92-7启动子、SGB6调控元件和TA29启动子等，其偏好于指导其 连接的基因在植物雄性组织中的表达。某些构建体中还可以包括配子组织优先表达启动 子。雄性配子优先表达启动子包括PG47启动子以及ZM13启动子。
[0049] 上述构建体中还可包括其它组分，这主要取决于载体构建的目的和用途，例如可 进一步包括选择标记基因、靶向或调控序列、稳定序列或引导序列、内含子等。表达盒还将 在目标异源核苷酸序列的3'端包括在植物中具有功能的转录和翻译终止子。终止子可以是 本发明所提供基因的终止子，也可以是来自外源的终止子。更具体地，上述终止子可以是胭 脂氨酸合酶或章鱼碱合酶终止区域。
[0050] 在希望将异源核苷酸序列的表达产物引向特定细胞器，例如质体、造粉体，或者引 向内质网，或在细胞表面或细胞外分泌的情况下，表达盒还可包含用于编码转运肽的核苷 酸序列。此类转运肽是本领域所公知的，其包括但不限于Rubisco的小亚基、植物EPSP合酶、 玉米Britt le-Ι叶绿体转运肽等。
[0051] 在制备表达盒的过程中，可对多种DNA片段加以操作，以提供处于合适方向，或是 处于正确读码框中的DNA序列。为达到此目的，可使用衔接子或接头，将DNA片段连起来，或 者进一步包括其它操作，以提供方便的限制性酶切位点等。
[0052] 进一步地，本发明所提供的构建体中还可包括选择标记基因，用于选择经转化的 细胞或组织。所述选择标记基因包括赋予抗生素抗性或对除草剂抗性的基因。合适的选择 标记基因包括但不限于:氯霉素抗性基因，潮霉素抗性基因，链霉素抗性基因，奇霉素抗性 基因，磺胺类抗性基因，草甘磷抗性基因，草丁嶙抗性基因。所述选择标记基因还可以是红 色荧光基因、青色荧光蛋白基因、黄色荧光蛋白基因、荧光素酶基因、绿色荧光蛋白基因、花 青甙pl等基因。
[0053] 本发明所提供的表达盒或载体可被插入质粒、粘粒、酵母人工染色体、细菌人工染 色体或其他适合转化进宿主细胞中的任何载体中。优选的宿主细胞是细菌细胞，尤其是用 于克隆或储存多核苷酸、或用于转化植物细胞的细菌细胞，例如大肠杆菌、根瘤土壤杆菌和 毛根土壤杆菌。当宿主细胞是植物细胞时，表达盒或载体可被插入被转化的植物细胞的基 因组中。插入可以是定位的或随机的插入。优选地，插入通过诸如同源重组来实现。另外，表 达盒或载体可保持在染色体外。本发明的表达盒或载体可存在于植物细胞的核、叶绿体、线 粒体和/或质体中。优选地，本发明的表达盒或载体被插入植物细胞核的染色体DNA中。 [0054]本发明还包括所公开的OsRPLPO基因及其启动子的应用，在某些应用的实施方式 中，可以应用本发明所提供的OsRPLPO基因或其启动子来实现RPLP0或其他类似育性相关基 因突变所获得的雄性不育系的繁殖和保持。
[0055]具体地，上述雄性不育系的繁殖和保持，是指以纯合隐性核雄性不育突变体为转 化受体材料，将紧密连锁的3个目标基因转化至该不育突变体受体植株中。所述3个目标基 因分别是育性恢复基因、花粉失活基因和颜色标记筛选基因。其中，育性恢复基因可使不育 的转化受体育性恢复，花粉失活基因可使含有转化的外源基因的花粉失活，即失去授精能 力，筛选基因可以用于转基因种子和非转基因种子的分拣，分拣出的非转基因种子用作不 育系生产杂交种，转基因种子用作保持系来源源不断地、稳定地生产不育系。
[0056]更具体地，根据本发明的一个实施例，可以以水稻核隐性不育osrplpO/osrplpO突 变体为转化受体材料，将紧密连锁的3个目标基因转化至该不育系：其中，育性恢复基因 OsRPLPO可使转化受体育性恢复;花粉失活基因 Zm-PA可使含有外源基因的花粉失活，即失 去授精能力；荧光色选基因 RFP(r)用于转基因种子和非转基因种子的分拣，分拣出的非转 基因种子用作不育系生产杂交种，转基因种子用作保持系来源源不断地稳定地生产不育 系。由于该技术利用生物技术生产非转基因产品，解决了水稻杂交制种过程中面临的瓶颈 问题，即三系法资源利用率低而两系法中不育系育性不稳定的问题(详细方法可参阅PCT专 利PCT/CN2013/086657)。
[0057] 本发明的所提供的花粉特异表达启动子可用于外源基因在花粉中的特异性表达， 从而避免该外源基因在植物其他组织中持续表达所带来的不利影响，还可以用于植物花粉 生长发育相关基因的功能分析和鉴定；可用于雄性不育系和恢复系的创建;并可应用于花 粉败育实验中，从而避免由植物转基因漂移或花粉逃逸所带来的生物安全问题，对植物雄 性不育系和恢复系的创造具有重要意义。
[0058] 本发明还提供了 一种植物的生产方法，其包括：
[0059] (1)构建本发明第二方面或第五方面所提供的表达盒；
[0060] (2)将步骤(1)获得的表达盒导入植物细胞；
[0061] (3)再生出转基因植物;和
[0062] (4)选择出转基因植物;并且
[0063] (5)任选地，增殖步骤(4)获得的植物以获得后代。
[0064] 本发明的转基因植物使用植物生物技术领域技术人员已知的转化方法制备。任何 方法可被用于将重组表达载体转化进植物细胞中，以产生本发明的转基因植物。转化方法 可包括直接和间接的转化方法。合适的直接方法包括聚乙二醇诱导的DNA摄入、脂质体介导 的转化、使用基因枪导入、电穿孔、以及显微注射等。在本发明的【具体实施方式】中，本发明使 用了基于土壤杆菌的转化技术(可参见Horsch RB等（1985)Science 225:1229;White FF， Vectors for Gene Transfer in Higher PI ants,Transgenic Plants，第1卷， Engineering and Utilization,Academic Press，1993，pp·15-38;Jenes B等.Techniques for Gene Transfer,Transgenic Plants，第1卷，Engineering and Utilization , Academic Press，1993，pp. 128-143,等）。土壤杆菌菌株(例如根瘤土壤杆菌或毛根土壤杆 菌)包含质粒(Ti或Ri质粒)和T-DNA元件，所述质粒和元件在用土壤杆菌转染后被转移至植 物，而T-DNA被整合进植物细胞的基因组中。T-DNA可位于Ri-质粒或Ti-质粒上，或独立地包 含在所谓的双元载体中。土壤杆菌介导的转化方法描述于例如中。土壤杆菌介导的转化最 适合双子叶植物，但是也适合单子叶植物。土壤杆菌对植物的转化描述于例如中。转化可导 致瞬时或稳定的转化和表达。尽管本发明的核苷酸序列可被插入落入这些广泛种类中的任 何植物和植物细胞中，但是其尤其适用于作物植物细胞。
[0065] 与现有技术相比，本发明具有如下的有益效果:本发明提供了一种水稻花粉发育 基因以及基于该基因突变所产生的雄性不育系，该不育系的育性稳定、不受环境条件影响、 能够被野生型转基因恢复。该基因以及该基因突变产生的不育系为构建第三代杂交育种体 系提供了必要的元件，该基因突变产生的雄性不育系，用来生产杂交种子，对于突破并改良 现有的"三系"和"两系"杂交技术有重要意义。
【具体实施方式】
[0066] 下面对本发明的实施例作详细说明，本实施例在以本发明技术方案为前提下进行 实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施 例。
[0067] 实施例1、水稻雄性不育突变体(osrplpO)筛选
[0068] 该突变体的获得是通过EMS诱变籼稻黄华占种子（M0)，EMS诱变浓度和时间是 0.7 %，12小时，来自M0代种子植株结实后混收，获得突变体库(Ml)。来自Ml代种子的植株在 种子成熟期用于筛选，通过表型观察，获得不育株。不育株割稻粧再生，再生株在生殖期用 I2-KI染色检测花粉发育和染色反应。其中一个突变体表现为无花粉型不育(no pollen)， 命名为osrplpO。
[0069]实施例2、水稻雄性不育突变体(osrplpO)遗传分析
[0070] osrplpO突变体不育株与野生型黄华占杂交，三个杂交群体F1代植株全部表现为 可育。再将F1代进行自交，F2代植株中不育与可育植株的分离比接近1:3(表1)，显示该突变 是由隐性单基因控制。
[0071] 表1:水稻雄性不育突变体(osrplpO)杂交F2代分离比
[0072]
[0073] 实施例3、水稻雄性不育突变体(osrplpO)生殖器官表型分析
[0074] 与野生型相比，突变体植株生长发育正常，不育株比可育株开花晚2-3天（图1)。突 变体花药瘦小，呈白色（图2 )，花药不开裂，没有花粉，进一步用12-KI溶液对突变体的花粉 进行染色检测，结果如图3所示，野生型的花粉染色正常，而突变体没有花粉。突变体柱头外 露率达61 %以上，而野生型黄华占柱头很少外露。
[0075] 实施例4、水稻雄性不育突变体基因的克隆
[0076] 突变体基因克隆采取Mutmap方法，即利用突变体与原野生亲本杂交构建F2群体， 通过重测序进行基因定位的方法。将不育株与野生型黄华占杂交，选取30棵F2代不育植株， 取叶片提取基因组DNA，等量混合后用于高通量基因组测序，共获得约18.5Gb基因组序列数 据，相当于43x水稻基因组(表2)。与野生型黄华占基因组序列比较显示突变基因可能是第8 染色体上的0s08g03640等位基因，命名为OsRPLPO。
[0077] 表2水稻雄性不育突变体重测序数据
[0078]
[0079] 在野生型黄华占中该基因的编码区全长960bp，其核苷酸序列如SEQ ID NO: 1所 示。SEQ ID NO: 1所编码的蛋白含319个氨基酸，其氨基酸序列如SEQ ID NO: 2所示。在不育 突变体中，该基因 cDNA第379个碱基C突变为T，导致基因编码的氨基酸发生替换，由脯氨酸 Pro(CCC)突变为丝氨酸Ser(TCC)。采用最新的SNP(单核苷酸多态性）研究工具HRM(High Resolution Melt，即高分辨率恪解)分析，进一步验证所有的无花粉植株均携带纯合突变 型位点，而可育植株携带纯合野生型或杂合型位点（表3)。该位点为纯和野生型的植株自交 后代全部可育，该位点为杂合型的植株自交后代表现不育:可育1:3分离。
[0080] 表3突变基因（0s08g03640)HRM分型结果
[0081]
[0082] OsRPLPO基因 cDNA编码区在粳稻日本晴和野生型黄华占之间存在核苷酸序列多态 性（图4)，与黄华占相比，具体为粳稻日本晴在该基因的核苷酸序列的第770位的A突变为G， 并导致氨基酸发生替换，具体由谷氨酸(Glu)替换为甘氨酸(Gly);第819位的A突变为G，氨 基酸无变化（图5)，具体的在粳稻日本晴中，该基因的核苷酸序列如SEQ ID N0:5所示，其编 码的氨基酸序列如SEQ ID N0:6所示。进一步分析，该基因在籼稻品种9311和野生型黄华占 之间没有多态性。
[0083]进一步进行互补实验分析，发现转入OsRPLPO基因的突变体植株均表现为可育。这 些分析进一步证明基因 OsRPLPO参与花粉发育调控，该基因突变导致水稻雄性不育。
[0084]实施例5、0sRPLP0基因在水稻各器官中的表达分析
[0085]根据OsRPLPO的cDNA序列设计引物，上游引物为F15 ' CCTGCTCGTGTTGGTCTTG 3 ' (SEQIDN0:24)，下游引物为R15'GGAGGAGCCCACCTTGTCA3'（SEQIDN0:25)，同时以水稻 Actin基因作为内参对照设计引物，上游引物为5'GCTATGTACGTCGCCATCCA'（SEQ ID N0: 26)，下游引物为5 ' GGACAGTGTGGCTGACACCAT '（SEQ ID NO: 27)。用黄华占水稻材料提取总 RNA并合成cDNA模板。采取实时定量PCR方法，分析OsRPLPO基因在水稻根、茎、叶、外稃、内 稃、颖片、雌蕊和幼穗颖花原基分化期（stage6)、幼穗花粉母细胞减数分裂时期（stage7)及 四分体形成阶段（8七3868)、小孢子早期（8七3869)、小孢子中晚期（8七38610)及成熟花粉期 (stagel2)的表达谱，其结果如图6所示，该基因在小孢子早期（stage9)特异表达且表达量 很高，在小孢子中晚期（stagelO)表达量开始降低，而在根、茎、叶、种子及其它幼穗发育时 期表达水平相对较低。该基因在突变体中幼穗花粉母细胞减数分裂时期(stage7)及四分体 形成阶段(stage8)、小孢子早期（stage9)及小孢子中晚期（stagelO)的表达与野生型表达 水平较为一致，从小孢子中晚期（stagelO)开始至成熟花粉期（stage 12)突变体中OsRPLPO 表达水平较明显高于野生型（图7)。
【主权项】
1. 一种DNA序列，具有调控植物育性的功能，其特征在于，所述DNA序列选自下列组的序 列之一： a) 具有SEQ ID NO: 1、5或7所示的核苷酸序列； b) 在严格条件下能够与(a)之任一所述序列的DNA杂交的DNA序列;或 c) 与(a)-(b)之任一所述序列互补的DNA序列。2. 权利要求1所述的DNA序列，其特征在于所述DNA序列编码的氨基酸序列如SEQ ID NO: 2或6所示。3. -种表达盒，其特征在于所述表达盒包含权利要求1所述的DNA序列。4. 一种表达载体，其特征在于所述表达载体包含权利要求3所述的表达盒。5. -种工程菌，其特征在于所述工程菌含有权利要求4所述的表达载体。6. -种基因在植物育性调控中的应用，其特征在于，所述育性调控基因的核苷酸序列 选自下列组的序列之一： a) 具有SEQ ID NO: 1、5或7所示的核苷酸序列； b) 在严格条件下能够与(a)之任一所述序列的DNA杂交的DNA序列;或 c) 与(a)-(b)之任一所述序列互补的DNA序列。7. 权利要求6所述的应用，其中所述的核苷酸序列其编码的氨基酸序列如SEQ ID N0:2 或6所示。8. 权利要求6或7所述的应用，其特征在于，通过突变育性调控基因 SEQ ID NO: 1、5、或7 获得雄性不育材料。9. 权利要求8所述的应用，其中所述的突变包括在育性调控基因的核苷酸序列上进行 取代、插入或缺失一个或多个核苷酸。10. 权利要求6或7所述的应用，其特征在于用权利要求1所述的DNA序列恢复由相应的 SEQ ID NO: 1、5或7所示基因突变所导致的雄性不育，使雄性不育突变体恢复成可育。11. 一种突变体材料的应用，其特征在于所述突变材料是由核苷酸序列的突变所造成， 具有雄性不育的表现，其特征在于所述核苷酸序列如SEQ ID NO: 1、5或7所示。12. 权利要求11所述的应用，其中所述的突变可以是点突变，也可以是DNA缺失或插入 突变，也可以是通过RNAi、基因定点突变等基因沉默手段产生，所述基因定点突变的方法包 括但不限于ZFN定点突变方法、TALEN定点突变方法、和/或CRISPR/Cas9等定点突变方法。13. 权利要求11或12所述的应用，包括在育种中的应用。14. 权利要求13所述的应用，其中所述的育种是指将突变体植株作为不育系母本，与恢 复系杂交，生产杂交种子。15. -种方法，用于保持雄性不育植株的纯合隐性状态，所述方法包括： (a) 提供第一植株，其包含OsRPLPO基因的纯合隐性等位基因，并且其是雄性不育的； (b) 向第一植株中引入下述构建体，形成第二植株，所述第二植株包含OsRPLPO基因的 纯合隐性等位基因和所述构建体，且构建体在第二植株中为杂合状态，所述构建体包含： i) 第一核苷酸序列，其包含OsRPLPO基因的核苷酸序列，当在第一植株中表达时其将恢 复雄性生育力； ii) 第二核苷酸序列，当其表达时，会抑制所述第二植株中可育雄性配子的形成或功 能，具体为花粉失活基因 ZM-PA;以及 (C)用所述第二植株的雄性配子使所述第一植株受精，以产生保持了所述第一植株纯 合隐性状态的后代。
【文档编号】C12N15/29GK105886516SQ201610066392
【公开日】2016年8月24日
【申请日】2016年1月29日
【发明人】魏宁, 陈浩东, 梁中成
【申请人】北京思创达科技有限公司