一种靶向抑制ATP5A1基因表达的siRNA及其应用
【专利摘要】本发明涉及一种靶向抑制ATP5A1基因表达的siRNA，由正义链和反义链组成，其特征在于，所述正义链包含SEQ ID NO:1所示序列，所述反义链包含SEQ ID NO:1所示序列的互补序列，所述ATP5A1的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示，所述ATP5A1的基因编码序列如SEQ ID NO:3所示。所述siRNA可用于治疗癌症，例如胃癌。本发明还涉及包含所述siRNA的抗癌药物组合物。
【专利说明】
一种靶向抑制ATP5A1基因表达的s i RNA及其应用
技术领域
[0001 ] 本发明涉及癌症治疗领域，更特别地，涉及一种治疗癌症的siRNA。
【背景技术】
[0002]我国是胃癌高发国家，其发病率和致死率分别高居全部恶性肿瘤的第3位和第2 位。由于胃癌起病隐匿，早期多无明显症状，不易觉察，使得胃癌的早期发现非常困难。特别 是在我国，超过80%的胃癌在确诊时就已处于进展期，预后很差，严重威胁着人们的生命健 康。因此需要一种有效的药物治疗胃癌。
[0003] RNA干扰现象(RNA interference，RNAi)是细胞内自主产生的生物进化过程中一 项保守的防御机制。siRNA被认为是RNA干扰的主要效应物，已成为一种通过抑制目的基因 的表达来研究哺乳动物基因功能的有效工具。直接转染合成的siRNA能特异性抑制动物细 胞内同源基因的表达，但是细胞内siRNA很容易降解，因此这种方法不能实现稳定的RNA干 扰。慢病毒载体在动物细胞内感染效率高，免疫原性低，且既能感染分裂期的细胞又能感染 非分裂期的细胞。由于病毒载体的这些特性，慢病毒介导RNA干扰能在各类动物细胞内长期 稳定地表达siRNA，抑制基因表达，因此该方法具有高效、稳定、特异性强、适用范围广的特 定，已成为RNA干扰技术的主要研究工具。RNA干扰技术在生物医药上的应用为临床肿瘤的 应用基础研究增加了强有力的手段。
[0004] 本发明将线粒体功能障碍相关的ATP5A1基因及蛋白的表达检测引入胃癌诊断中 应用，并设计特异性siRNA针对ATP5A1进行靶向阻断，研究结果具有理论创新特点和较大的 现实意义，本发明将为胃癌的特异性、灵敏性的早期诊治提供帮助。同时也为靶向调节线粒 体功能相关蛋白的抗肿瘤治疗研究和病例筛选提供重要参考。
[0005] 氧化应激是指环境或细胞线粒体功能障碍等因素导致体内活性氧簇(reactive oxygen species，R0S)如超氧阴离子、轻自由基、过氧化氢产生过多，氧化系统和抗氧化系 统失衡，从而导致组织损伤。线粒体是体内细胞功能和代谢方面起重要作用的细胞器，它的 主要作用是产生ATP。线粒体的ATP合酶包含五个不同的亚基(α、β、γ 合酶广泛分 布于线粒体内膜，参与氧化磷酸化，在跨膜质子动力势的推动下合成ATP。其中，ATP5A1和 ATP5B基因分别负责编码533个氨基酸的α和529个氨基酸的β亚基。ATP5A1表达的增加可以 增强ΑΤΡ合酶的活性，ΑΤΡ合酶活性的增强能减少线粒体超氧阴粒子的产生和氧化损伤。
【发明内容】
[0006] 本发明提供了一种靶向抑制ΑΤΡ5Α1基因表达的siRNA，由正义链和反义链组成，所 述正义链包含SEQ ID NO: 1所示序列，所述反义链包含SEQ ID NO: 1所示序列的互补序列， 所述ATP5A1的氨基酸序列如SEQ ID N0:2所示，所述ATP5A1的基因编码序列如SEQ ID N0:3 所示。
[0007] 优选地，所述正义链由SEQ ID NO: 1所示序列3'端附接两个尿苷形成。
[0008] 优选地，所述两个尿苷经2 ' -Ο-Me修饰。
[0009]优选地，所述反义链由SEQ ID NO: 1所示序列的互补序列3'端附接两个尿苷形成。 [0010] 优选地，所述两个尿苷经2 ' -Ο-Me修饰。
[0011] 所述的siRNA可用于制备抗癌药物，优选地，所述抗癌药物用于治疗人或其他哺乳 动物的胃癌。
[0012] 本发明还提供了一种抗癌药物组合物，其所述siRNA，以及药学可接受的载剂、赋 形剂、稀释剂、佐剂中一种或多种的组合。所述抗癌药物组合物可用于治疗胃癌。
【附图说明】
[0013] 图 1 为检测ATP5Al-siRNA抑制ATP5A1 蛋白水平的Western blot图；
[0014] 图2为检测ATP5Al-siRNA抑制ATP5A1转录水平的Q-PCR的结果图；
[0015] 图3为ATP5Al-siRNA抑制癌细胞增殖的统计图。
【具体实施方式】
[0016] 以下结合具体实例和附图对本发明的原理和特征进行进一步描述，所举实例只用 于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。
[0017] 发明人在研究胃癌的过程中，通过线性轨道离子阱色谱-质谱技术分析胃癌患者 和健康者的组织样本，发现ATP5A1蛋白水平在胃癌患者的组织样本中升高6倍，因此预测 ATP5A1蛋白在胃癌肿瘤的发展过程中起重要作用。发明人根据ATP5A1蛋白的cDNA序列设计 siRNA，以研究该siRNA与ATP5A1的表达水平，以及对肿瘤的影响。出乎意料地，发明人发现 该s i RNA具有抗癌作用。
[0018] 实施例 lATP5Al-siRNA 的制备
[0019] 本实施例的靶向抑制ATP5A1表达水平的siRNA根据ATP5A1的cDNA序列设计，并通 过人工合成的方法分别合成该s iRNA的正义链5 ' -CCGGUAUCAUUCCUCGAAUUU-3 '和反义链5 ' -AUUCGAGGAAUGAUACCGGUU-3 '。将两条链等比例混合，退火后得到双链的ATP5A1-SiRNA:
[0021] 实施例2siRNA在胃癌细胞中对ATP5A1表达的抑制
[0022]通过脂质体转染法将上述siRNA转染至胃癌细胞SGC7901中，挑选转染子进行培 养，通过Western blot和Q-PCR分别从蛋白水平和转录水平来检测转染子中ATP5A1的表达 情况，以乱序的对照siRNA为阴性对照。
[0023] 结果如图1和图2所示，转染了 ATP5Al-siRNA的胃癌细胞SGC7901的ATP5A1无论是 在蛋白水平（图1)还是在转录水平（图2)都显著低于对照，这提示，ATP5Al-siRNA显著抑制 了癌细胞中ATP5A1的表达。
[0024]实施例3siRNA抑制胃癌细胞的增殖
[0025]在72小时内实时监测上述胃癌细胞转染子的细胞增殖状况，与对照siRNA进行对 比，得到图3。结果显示，ATP5Al-siRNA能够显著抑制癌细胞的增殖。
[0026] 实施例4siRNA对抑制肿瘤SGC7901的生长抑制作用
[0027] 选取体重为18-22g的雌性BALB/c裸鼠 2只以建立移植瘤模型，将人胃癌SGC7901细 胞接种于裸鼠腋窝皮下，每只接种2X106个细胞。待瘤块体积约100mm3大小时，将裸鼠按照 瘤块大小和体重进行分为3组，每组6只裸鼠。生理盐水组、阴性对照-siRNA(siNC)组和 ATP5Al-siRNA组，每周三次，瘤内注射，连续给药两周。实验第24天处死动物，分离肿瘤并称 重，计算抑瘤率(表1)。结果表明，与各对照组相比，ATP5Al-siRNA具有显著抗肿瘤活性。 [0028] 表1 s iRNA对裸鼠移植瘤SGC7901生长的抑制作用 [0029]
[0030] #与生理盐水组相比P<0 · 01，#与siNC组相比P<0 · 05。
[0031]以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和 原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
【主权项】
1. 一种靶向抑制ATP5A1基因表达的SiRNA，由正义链和反义链组成，其特征在于，所述 正义链包含SEQ ID N0:1所示序列，所述反义链包含SEQ ID N0:1所示序列的互补序列，所 述ATP5A1的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示，所述ATP5A1的基因编码序列如SEQ ID NO:3所 不。2. 根据权利要求1所述的SiRNA，其特征在于，所述正义链由SEQ ID NO: 1所示序列3'端 附接两个尿苷形成。3. 根据权利要求2所述的siRNA，其特征在于，所述两个尿苷经2 ' -O-Me修饰。4. 根据权利要求1所述的SiRNA，其特征在于，所述反义链由SEQ ID NO: 1所示序列的互 补序列3 '端附接两个尿苷形成。5. 根据权利要求4所述的siRNA，其特征在于，所述两个尿苷经2 ' -O-Me修饰。6. -种权利要求1-5中任一项所述的siRNA在制备抗癌药物中的应用。7. 根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述抗癌药物用于治疗人或其他哺乳动物 的胃癌。8. -种抗癌药物组合物，其特征在于，包含权利要求1至5中任一项所述的siRNA，以及 药学可接受的载剂、赋形剂、稀释剂、佐剂中一种或多种的组合。
【文档编号】A61P35/00GK105886508SQ201610387006
【公开日】2016年8月24日
【申请日】2016年6月2日
【发明人】姜文国, 田梗, 米佳, 李贺, 杨春华, 位晓丹, 刘芳
【申请人】滨州医学院