专利名称：miRNA-140抑制剂及其用途的制作方法
技术领域：
本发明属于生物医药工程领域及心脏疾病的诊断、预防和治疗领域，涉及一种内源性的非编码小RNA抑制剂的新用途，具体涉及一种miRNA-140抑制剂及其用途，具体为其在诊断、预防和/或治疗心脏疾病中的用途。
背景技术：
目前，心血管疾病是人类健康和生命的主要威胁，是人类健康的头号杀手，全世界范围内每年有一千七百万人死于心血管疾病，其死亡率已接近所有癌症死亡率的总和。在我国，随着人民生活水平日益提高和饮食结构的改变，心血管疾病死亡率呈明显上升趋势，已超过癌症成为第一大致死原因。根据国家卫生部2004年底公布的最新统计结果表明，我国18岁及以上居民高血压患病率为18.8%，估计全国患病人数超过1.6亿，由此造成的心肌肥厚、心肌梗死、冠心病以及心力衰竭等凋亡相关心脏疾病的病人达几千万。目前关于心脏疾病发病机理尚不完全清楚，心脏疾病的预防、诊断和治疗尚不能达到让人满意的效果，急需开发新的技术、方法用于心脏病的诊断、预防和治疗。miRNA是新近研究发现的一类内源性非编码小RNA分子。许多研究表明，miRNA对于维持心脏正常生理功能具有重要作用，心脏中的miRNA异常表达与许多心脏疾病的发生相关。因此，将miRNA作为心脏疾病治疗的靶点，开发相关药物具有潜在的临床应用价值。单一的miRNA可以同时作用于多个祀基因的mRNA的表达,这样药物作用于一个miRNA可以调节多个参与心脏发病基因的表达，影响多个信号通路，从整体上达到治疗疾病的目的。由于miRNA在心脏病理状态下表达水平不同，因此可以通过检测miRNA的表达水平来预测和诊断疾病。细胞凋亡(apoptosis)，又称程序性细胞死亡，是指细胞在一定的生理或病理条件下，遵循自身的程序，自·己结束生命的过程。它是一个主动的、高度有序的、由基因控制及一系列酶参与的过程，对正常胚胎发育，维持细胞群体及恶性病变过程中均起重要作用，在保证多细胞生物的健康生存过程中扮演着关键的角色。在许多心肌损伤或心脏病理状态下，如心肌缺血再灌注损伤、心脏肥厚、心力衰竭等，心肌细胞都会发生凋亡。由于成熟的心肌细胞不能分裂增殖，心肌细胞过度凋亡必然会使心肌细胞数目减少，这一点可能是一些心脏疾病发病的机理。目前研究发现许多miRNA通过调控凋亡相关靶蛋白的表达而参与细胞凋亡的发生，这些miRNA有促凋亡的，也有抑凋亡的。寻找心脏中特异表达的、参与心肌细胞凋亡的miRNA,阐明其作用机理，对于开发以miRNA为策略的心脏疾病的诊断、预防和治疗具有极其重要的意义和应用前景。
发明内容
因此，本发明的目的是确定或发现调控心肌细胞凋亡的miRNA-140及其抑制剂，并且进一步确定其在心肌缺血再灌注、心肌梗死、冠心病等心脏疾病中的关键作用，将其应用到这些心脏疾病的诊断、预防、治疗和/或预后评估中。本文定义的术语具有本发明相关领域的普通技术人员通常所理解的含义。除非另外说明，本文中的miR-140是指miRNA-140 ；miR-140抑制剂是指miRNA-140 抑制剂。除非另夕卜说明，本文中的miRNA-140的序列为SEQ ID NO:2(5' -CAGUGGUUUUACCCUAUGGUAG-3')所示的核苷酸序列。除非另外说明，本文中的“伪手术”是指除了不结扎穿过左前降支的结扎线外剩下的所有手术步骤都与缺血/再灌注组相同。除非另外说明，本文中的“缺血/再灌注”是指结扎小鼠冠状动脉左前降支造成心肌缺血一段时间之后，松开结扎线使心肌达到再灌注。除非另外说明，本文中的“危险区/左心室”是指“危险区总面积/左心室面积”。除非另外说明，本文中的“梗死区/危险区”是指“梗死区面积/危险区总面积”。除非另外说明，本文中的“梗死区/左心室”是指“梗死区面积/左心室面积”。针对上述目的，本发明的目的是采用以下技术方案来实现的。一方面，本发明提供一种miRNA-140抑制剂，所述抑制剂的序列为与下述SEQ IDNO:1所示的核苷酸序列至少有90%同源性的序列:5' -CUACCAUAGGGUAAAACCACUG-3'，其中每一个碱基均进行了 2' -O-甲基修饰。优选地，所述抑制剂的序列为SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列，其中每一个碱基均进行了 2' -O-甲基修饰，甲氧基修饰能够增加抑制剂的稳定性(GenePharma C0.Ltd))。再一方面，本发明提供一种miRNA-140抑制剂在制备用于诊断、预防、治疗和/或预后评估心脏疾病的药物或试剂盒的用途。优选地，所述心脏疾病选自心肌梗死、心肌缺血损伤、冠心病、心脏肥厚和心肌纤维化中的一种或多种。又一方面，本发明提供一种用于预防和/或治疗心脏疾病的药物组合物，所述药物组合物含有有效量的本发明上述所述的miRNA-140抑制剂和药学上可接受的病毒、载体或辅料。优选地，所述有效量的miRNA-140抑制剂为20_200mg/kg。优选地，所述药学上可接受的载体或辅料选自壳聚糖、胆固醇、脂质体和纳米颗粒中的一种或多种。优选地，所述药物组合物为口服制剂或注射制剂。还一方面，本发明提供一种用于诊断和/或预后评估心脏疾病的试剂盒，所述试剂盒包含本发明上述所述的miRNA-140抑制剂或用于特异性检测miRNA-140的探针或引物，所述引物为SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6所示的核苷酸序列。综上所述，本发明人通过大量的实验证明miRNA-140抑制剂在心肌缺血损伤及心肌细胞凋亡中的变化及其心肌保护作用。具体地，本发明人通过研究发现，miRNA-140在心肌缺血损伤及缺氧诱导的心肌细胞凋亡过程中miRNA-140表达显著上调。通过合成miRNA-140特异性抑制剂降低其内源性表达可以抑制心肌细胞凋亡及心肌缺血损伤，心肌梗死面积减少。心肌缺血/再灌注损伤后，抑制miRNA-140内源性表达可以减轻缺血/再灌注损伤所致 的凋亡，减小心肌梗死面积，可改善缺血/再灌注损伤所致的心功能失调，检测指标包括LVEDP(左室舒张末压)，±dp/dt max(左室压力上升和下降最大变化速率)和LVEF(左室射血分数)。miRNA-140抑制剂通过抑制心肌细胞凋亡对心脏具有保护作用，miRNA-140抑制剂对许多心脏疾病具有潜在的预防和治疗价值。而给予miRNA-140腺病毒增加miRNA-140表达则可以诱导心肌细胞凋亡，心肌缺血损伤会更加严重。由此可见，本发明人通过实验研究发现，miRNA-140抑制剂(SEQ ID NO:1:5丨-CUACCAUAGGGUAAAACCACUG-3丨，其中所有的碱基都进行了 2' -O-甲基修饰)通过抑制心肌细胞凋亡对心脏具有保护作用。心肌细胞缺氧或心肌缺血损伤过程miRNA-140表达显著上调，miRNA-140的上调可能诱导了心肌细胞凋亡的发生。miRNA-140在缺血/再灌注动物模型的心肌组织中表达上调，注射miRNA-140抑制剂降低其内源性表达，可以抵抗心肌缺血/再灌注损伤，心肌梗死面积减少，心功能显著改善、心肌纤维化及心脏结构重塑均在一定程度上被抑制。将miRNA-140抑制剂与适当的载体结合形成药物，导入心脏或体内，对许多心脏疾病将具有预防及治疗作用。发明人通过化学合成miRNA-140抑制剂从冠状动脉注射入小鼠心脏，发现心肌缺血损伤程度明显被抑制，在动物模型证明了 miRNA-140抑制剂对缺血性心脏病的治疗作用。因此，本发明提供了将miRNA-140抑制剂与适当载体或辅料如壳聚糖、胆固醇、月旨质体、纳米颗粒等包装形成药物，通过口服、静脉注射、肌肉注射、冠状动脉内注射或直接心肌注射的方式，用于预防和/或治疗心脏疾病、改善心脏功能、阻止心肌纤维化及心肌重构的发生。此外，本发明还提供了采用包含特异性检测微小RNA的探针或引物的试剂盒，通过实时荧光定量PCR、纳米微球技术检测患者外周血血浆中miRNA-140的表达水平，用于对心肌梗死、冠心病、心肌纤维化等心脏疾病的诊断和/或预后评估。
以下，结合附图来详细说明本发明的实施方案，其中:图1A为过氧化氢处理诱导的心肌细胞凋亡情况；图1B为过氧化氢处理诱导的心肌细胞凋亡过程中miRNA-140表达水平的变化；图2A为miRNA-140抑制剂处理对过氧化氢诱导的miRNA-140水平的表达变化情况；图2B为miRNA-140抑制剂处理对过氧化氢诱导的心肌细胞凋亡的情况；图3为转染miRNA-140过表达腺病毒对过氧化氢诱导的心肌细胞凋亡情况的影响；图4为缺血/再灌注损伤及miRNA-140抑制剂处理对miRNA-140表达水平的变化情况；图5A为miRNA-140抑制剂对缺血/再灌注损伤诱导的心肌细胞凋亡的影响的免疫荧光结果，其中的TUNEL为通过原位末端缺口标记法检测心肌细胞凋亡的试验组，DAPI为将该试验组的细胞进行DAPI染核作为对照的试验组；图5B为miRNA-140抑制剂对缺血/再灌注损伤诱导的心肌细胞凋亡的影响的柱状统计图；图6为小鼠静脉注射miRNA-140抑制剂抑制内源性miRNA-140后缺血/再灌注24时心肌梗死面积的情况，图中的心脏横截面切片依次为伪手术、PBS+缺血/再灌注、阴性对照+缺血/再灌注、miRNA-140抑制剂+缺 血/再灌注处理后的小鼠心脏的中乳头肌水平的横截面切片；
图7为小鼠静脉注射miRNA-140抑制剂抑制内源性miRNA-140后缺血/再灌注一周时心功能状况，其中图7A为左室收缩内径(LVIDs)结果，图7B为左室舒张内径(LVIDd)结果，图7C为短轴缩短率(FS)结果。
具体实施例方式以下参照具体的实施例来说明本发明。本领域技术人员能够理解，这些实施例仅用于说明本发明，其不以任何方式限制本发明的范围。除非特别说明，以下各实施例中使用的实验动物S-D大鼠、小鼠(其品种为C57BL/6小鼠)均购自北京维通利华实验动物技术有限公司；提取总RNA使用Trizol试剂盒(Invitrogen公司)，逆转录反应使用逆转录试剂盒(Takara公司)，实时突光定量PCR技术检测miRNA-140的表达水平的方法参见Chen, C.,等.Real-time quantification ofmicroRNAs bystem-loop RT-PCR.Nucleic Acids Res 33，el79，2005。除非特别说明， 以下各实施例中所用的TUNEL法参见:Anti_apoptoticeffects ofrosiglitazone in hypercholesterolemic rabbits subjected tomyocardial ischemiaand reperfusion.Cardiovasc Res.2004 ；62:135-144。除非特别说明，以下各实施例中所用的阴性对照为下述SEQ ID NO:4所示的核苷酸:5, -CAGUACUUUUGUGUAGUACAA-3,。实施例1.心肌细朐凋亡实骀樽型中miRNA-140表汰情况对于心肌细胞凋亡实验模型，参照文献von Harsdorf R, Li PF,Dietz R.Signaling pathways in reactive oxygen species-1nducedcardiomyocyteapoptosis.Circulation.99, 2934-2941 (1999)中记载的方法培养大鼠乳鼠原代心肌细胞，100 μ mo I/L过氧化氢加0.1mM硫酸亚铁处理心肌细胞的不同时间点，提取RNA，进行逆转录反应后，通过实时荧光定量PCR技术检测miRNA-140的表达水平。如图1A所示加入过氧化氢后，心肌细胞随着处理时间的增加凋亡加剧；如图1B所示，miRNA-140表达水平在过氧化氢处理0.5 2h内显著上调。实施例2.miRNA-140抑制剂抑制心肌细朐凋亡的实骀本实施例中以原代培养的心肌细胞为模型，检测miRNA-140抑制剂(antagomir)(即miRNA-140反义核苷酸序列:5^ -CUACCAUAGGGUMAACCACUG-3'，其中所有的碱基都进行了 2' -O-甲基修饰(SEQ ID NO:1)，其由GenePharma有限公司合成)或阴性对照(序列为 5' -CAGUACUUUUGUGUAGUACAA-3' (SEQ ID NO:4)，其由 GenePharma 有限公司合成)是否能够抑制心肌细胞的凋亡。转染以上所述的化学修饰的miRNA-140抑制剂于心肌细胞，以抑制内源性的miRNA-140, 24小时后，100 μ mo I/L过氧化氢加0.1mM硫酸亚铁处理心肌细胞I小时后换成不含过氧化氢及硫酸亚铁的正常培养液，使用TUNEL法检测心肌细胞凋亡情况。如图2A所示加入miRNA-140抑制剂后，过氧化氢处理后的心肌细胞的miRNA-140表达水平明显下降；如图2B所述，显示miRNA-140抑制剂可以显著抑制过氧化氢诱导的心肌细胞凋亡。实施例3.miRNA-140腺病毒的构律本实施例构建了 miRNA-140腺病毒，并用该腺病毒感染原代心肌细胞，研究过表达miRNA-140对过氧化氢诱导的心肌细胞凋亡的影响。1.miRNA-140腺病毒的构建采用Ambion公司的pSilencer Adeno 1.0-CMV系统构建miRNA-140过表达载体或腺病毒。按照公司说明书构建相应载体及腺病毒，具体方法如下。使用组织基因组提取试剂盒(购自天根生化科技(北京)有限公司)，提取大鼠心脏组织基因组DNA，以大鼠基因组为模板，PCR扩增miRNA-140的全长编码序列(SEQ IDNO:3:GTGTCTCTCTCTGTGTCCTGCCAGTGGTTTTACCCTATGGTAGGTTACATCATGCTGTTCTACCACAGGGTAGAACCACGGACAGGATACTGGAGCACC)及其上下游两端各将近200个bp的序列，PCR引物设计如下:上游引物5' -TGAAAGAACCCAGAGCAATG-3' (SEQ ID NO:5)，下游引物5' -TCAACTGTCACCCACCCAAC-3' (SEQ ID NO:6)扩增片段约600bp(SEQ ID NO:7:TGAAAGAACCCAGAGCAATGTGCTGCCCTCACCCTATACAAGTTAACAGCTCTGTGGGAAAGCATCACCTCGTACAACAGTCAGAGGGTTCTAGCAGTGGGAAGGAGCTTGTTGGCTGTGATAACCTCTTATCCTGCTGACCTTGTGGTGCGGGGATATCTTCTGGCTTGGTGTTGGGCTCCCCCGCCTCTGATCCTATTTGCGGTGGTGTAGTCTTCTGTGTTGATCCCATCCTGCAGATGAATTGTTCTTTTTTCCGTGGTGACCTCTCCAGGCTGTGCTTGGTGGGCATCTGGTGTGGCTCCCGCCCTGTGTGTCTCTCTCTGTGTCCTGCCAGTGGTTTTACCCTATGGTAGGTTACATCATGCTGTTCTACCACAGGGTAGAACCACGGACAGGATACTGGAGCACCCTCTGCATCGAAGGACTCCATCTACACAGCCACACACAGCCCAGCAGCCAGGGGCCGGCTCCCTTGACCTCTGTTCCCTGACTGTTTAGCTCAAACTCTGAAGGACTCTGGATTCTGGCTTGAGGATTCTATGTAGGATGCAGATAGATGCTAAGGCGTCTGTTGGGTGGGTGACAGTTGA，其中标下划线的部分为上下游引物，下游引物与该序列的C末端序列反向互补，加黑标下划线的部分为SEQ ID NO: 3的序列，其余为上下游各近200bp的序列)。PCR 反应体系如下:10 X buffer (加有 Mg2+) 5 μ L，dNTP (2.5mM) 8 μ L，上游引物(IOMm) 2 μ L，下游引物(10 μ Μ) 2 μ L，Taq (5U/μ L) 0.5 μ L，模板 I μ L，双蒸水补齐至 50 μ L0PCR反应条件如下:95°C预变性5min，95°C变性lmin，58°C退火50s，72 °C延伸lmin, 25个循环，72°C总延伸IOmin0将该片段克隆入T载体,亚克隆入pSilencer Adeno CMV1.0穿梭载体(pSilencerAdeno CMV1.0 shuttle vector载体)Xho I和Spe I双酶切位点间。Pac I酶切线性化该载体及腺病毒骨架(Adenovirus LacZ Backbone),共转染HEK-293细胞(购自美国标准生物品收藏中心(ATCC))包装腺病毒，扩增收集病毒，测定病毒滴度。Real-time PCR鉴定miRNA-140 有表达。2.感染原代心肌细胞参照Tan, ff.Q., Wang, K., Lv, D.Y.& Li, P.F.Foxo3a InhibitsCardiomyocyteHypertrophy through Transactivating Catalase.J Biol Chem283,29730-29739(2008),用miRNA-140腺病毒感染原代心肌细胞24小时后，过氧化氢处理心肌细胞后，TUNEL法检测心肌细胞凋亡情况。如图3显示，感染miRNA-140腺病毒的心肌细胞，凋亡比例显著升高。实施例4.抑制内源件miRNA-140可改善缺血再灌沣所致的心肌细朐凋亡、心肌棰死面积的实验验证小鼠尾静脉20mg/kg注射miRNA-140抑制剂(即miRNA-140反义核苷酸序列，即5' -CUACCAUAGGGUAAAACCACUG-3'，其中所有的碱基都进行了 2' -O-甲基修饰(SEQ IDNO:1))或阴性对照(序列为 5' -CAGUACUUUUGUGUAGUACAA-3' (SEQ ID NO:4))，3 天后进行心脏缺血/再灌注手术，具体操作如下:小鼠称重并麻醉，仰卧位固定于实验用木板上，并进行心电图监测。剪毛并用碘酒消毒手术区。颈部正中切开气管并插管，连动物呼吸机进行正压通气，在胸骨左缘处及心脏搏动处纵行切开皮肤约2cm，逐层钝性分离皮下组织、肌肉，开胸，小心提起心包并剪开，充分暴露心脏、血管。在肺动脉圆锥和左心耳之间，以左冠状静脉主干为标志，于左心耳根部下方2mm处进针，进针深度0.5mm ;以8/0带针缝合线穿过心肌表层，在肺动脉圆椎旁出针；待心电图恢复稳定IOmin后，予以结扎左冠状动脉前降支(LAD)。以I导联ST段(心肌缺血时心电图典型表现为ST段抬高，如果ST段弓背向上抬高表达心肌缺血手术成功)弓背向上抬高大于0.1mv并持续0.5小时以上作为结扎成功的标志。缺血45min之后，松开结扎线开始再灌注。以ST段下降为标志。清除胸腔内积血并用去针头注射器抽吸气体关闭胸腔。再灌注3小时，采用TUNEL检测试剂盒(Roche公司)通过原位末端缺口标记法(TUNEL法)监测心肌细胞凋亡。再灌注24小时，用伊文斯蓝(Evans blue)/TTC双染测定心肌梗死面积。具体方法如下:心肌缺血/再灌注模型建立24小时后，重新结扎冠状动脉左前降支，注射2 %伊文斯蓝(Evans blue)，取出心脏，用生理盐水洗去血液后，称取全心重和心室重量，沿着垂直于左室长轴的方向将左心室横切成5片切片，置于37°C。1% TTC(氯化三苯基四氮唑)磷酸缓冲液中染色15min，数码相机记录每片心肌的情况。心肌梗死面积按如下方法计算:左心室面积(left ventricle, LV)为蓝色、红色和白色面积之和；危险区总面积(area at risk,AAR)为红色和白色面积之和；梗死区面积(infarct area, INF)为白色面积。危险区面积(AAR/LV, % )=(危险区总面积/左心室面积)X 100% ;心梗面积(INF/AAR，% )=(梗死区面积/危险区总面积)X 100%。
实时定量PCR检测了心肌组织中miRNA-140表达水平，如图4的结果显示，miRNA-140抑制剂可有效抑制心肌组织中的miRNA-140的表达。与阴性对照注射组相比，miRNA-140抑制剂缺血/再灌注(Ι/R)组心肌梗死面积显著降低(图6)，心肌细胞凋亡率明显降低(图5)，说明抑制内源性miRNA-140可减轻缺血/再灌注所致的心肌细胞凋亡、心肌梗死面积。实施侈il 5.miRNA-140 zTO吿ι|齐1|倉^:够改善尤、功倉阻ihbfl庄结构重塑的实验验iiH参照实施例4的方法，静脉注射miRNA-140抑制剂或阴性对照连续3天后对进行
心肌缺血/再灌注手术。缺血/再灌注一周时使用超声心动图检测缺血/再灌注损伤所诱导的小鼠心脏的结构及功能重塑程度。具体方法参见:Lin, Z.,等.miR-23afunctions downstreamof NFATc3 to regulate cardiac hypertrophy.Proc NatlAcad Sci USA 106，12103-12108 (2009)和 Dolber，P.C.，Bauman，R.P.，Rembert, J.C.& Greenfield, J.C.，Jr.Regional changes in myocyte structure inmodel of canine right atrialhypertrophy.Am J Physiol 267，H1279-1287(1994)。 结果如图7所不，检测指标包括左室舒张内径(LVIDd)(图7A)、左室收缩内径(LVIDs)(图7B)和短轴缩短率(FS)(图7C)。表明与阴性对照处理小鼠I/R(缺血/再灌注)组相比，miRNA-140抑制剂处理小鼠Ι/R(缺血/再灌注)组的左室舒张和收缩内径都显著减小，而短轴缩短率则显著升高，说明抑制内源性miRNA-140的表达能够减轻缺血/再灌注所致的心脏结构和功能恶性重塑。`
权利要求
1.一种miRNA-140抑制剂，所述抑制剂的序列为与下述SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列至少有90%同源性的序列: 5' -CUACCAUAGGGUAAAACCACUG-3'，其中每一个碱基均进行了 2' -O-甲基修饰。
2.根据权利要求1所述的miRNA-140抑制剂，其特征在于，所述抑制剂的序列为SEQIDNO:1所示的核苷酸序列，其中每一个碱基均进行了 2，-O-甲基修饰。
3.根据权利要求1或2所述的miRNA-140抑制剂在制备用于诊断、预防、治疗和/或预后评估心脏疾病的药物或试剂盒的用途。
4.根据权利要求3所述的用途，其特征在于，所述心脏疾病选自心肌梗死、心肌缺血损伤、冠心病、心脏肥厚和心肌纤维化中的一种或多种。
5.一种用于预防和/或治疗心脏疾病的药物组合物，所述药物组合物含有有效量的权利要求I或2所述的miRNA-140抑制剂和药学上可接受的病毒、载体或辅料。
6.根据权利要求5所述的药物组合物，其特征在于，所述有效量的miRNA-140抑制剂为20_200mg/kg。
7.根据权利要求5或6所述的药物组合物，其特征在于，所述药学上可接受的载体或辅料选自壳聚糖、胆固醇、脂质体和纳米颗粒中的一种或多种。
8.根据权利要求5至7任一项中所述的药物组合物，其特征在于，所述药物组合物为口服制剂或注射制剂。
9.一种用于诊断和/或预后评估心脏疾病的试剂盒，所述试剂盒包含权利要求1或2所述的miRNA-140抑制剂或用于特异性检测miRNA-140的探针或引物，所述探引物为SEQID NO:5或SEQ ID NO:6所·示的核苷酸序列。
全文摘要
本发明提供一种miRNA-140抑制剂及其用途，所述抑制剂的序列为与下述SEQ ID NO1所示的核苷酸序列至少有90％同源性的序列5′-CUACCAUAGGGUAAAACCACUG-3′，其中每一个碱基均进行了2′-O-甲基修饰；所述miRNA-140抑制剂在制备用于诊断、预防、治疗和/或预后评估心脏疾病的药物或试剂盒的用途。本发明证明miRNA-140抑制剂在心肌缺血损伤及心肌细胞凋亡中的变化及其心肌保护作用。
文档编号C12N15/11GK103243091SQ201210026058
公开日2013年8月14日 申请日期2012年2月7日 优先权日2012年2月7日
发明者李培峰, 焦建琴, 李艳蕊 申请人:中国科学院动物研究所