专利名称：Fgf8/shh组合法提高表皮干细胞牙向分化效率的方法
技术领域：
本发明涉及一种诱导表皮干细胞牙向分化的方法，具体涉及采用FGF8/ SHH (fibroblast growth factor 8/ Sonic hedgehog)双生长因子组合法提高动物上皮组织来源的表皮干细胞向成牙釉质细胞分化的效率的方法。
背景技术：
牙齿不仅能够咀嚼食物、帮助发音，而且对面容有很大影响。然而人类遗传性的牙齿缺陷却是一种比较普遍的现象，同时，随着年龄的增长，几乎所有人都有不同程度的牙齿缺陷甚至缺失。牙齿特别是釉质部分，一旦缺失自身将无法完成修复和再生。因此，人类牙齿的再生是一项极具应用前景、社会效益和市场价值的研究工作。根据牙齿发育的特性，利用成体干细胞进行牙齿器官再生同样需要上皮源性的干细胞和间充质源性的干细胞的同时参与。已有研究工作表明，具有诱导成牙潜能的小鼠 Ell. 5 (E12之前)的牙胚上皮与间充质来源的成体干细胞，如骨髓干细胞、牙髓干细胞和牙周膜干细胞等重组构建嵌合体，嵌合体能够发育为具有类似牙齿的结构，证明利用间充质来源的成体干细胞诱导成牙已经在理论上得到解决。但是，由于上皮来源的牙釉质细胞在牙齿萌发过程中已经凋亡，已经不可能从成体牙齿获得相应的上皮源性干细胞，所以必须从其它器官中寻找成体上皮源性干细胞。然而迄今为止，仍未找到一种合适的成体干细胞作为种子细胞，诱导其向牙上皮分化并且形成牙釉质细胞。因此，获得上皮源性的成体干细胞并诱导其向成牙釉质细胞分化是目前人类牙齿再生工程的瓶颈工作之一。表皮干细胞(keratinocyte stem cells, KSC)来源于皮肤表皮的基底层，属于上皮源性的干细胞。目前已经证实表皮干细胞具有多向分化的潜能，而且已经在严重皮肤灼伤、慢性皮肤创伤和基因治疗等临床治疗上得到有效地应用。因此可以尝试利用其成熟的培养和再生技术，为牙齿再生研究提供一种替代牙上皮的成体干细胞。本发明人前期以人表皮干细胞为材料，与具有诱导成牙潜能的小鼠E13. 5牙胚间充质(E12之后)重组，在嵌合体中添加FGF8生长因子能够诱导人表皮干细胞向成牙釉质细胞分化，相关数据发表在Developmental Biology期刊(SCI收录，影响因子4. 7。 Induction of human keratinocytes into enamel- secreting ameloblasts. Developmental Biology. 2010, 344:795-799.)，但是嵌合体形成牙齿结构的效率(成牙率)约为观％，其中表皮干细胞分化形成成釉质细胞的效率(成釉率)约为31%，效率不高。。
发明内容
本发明目的是提供一种采用FGF8/SHH的双生长因子组合法提高诱导表皮干细胞牙向分化的成牙效率的方法。为实现本发明的目的，采用的技术方案是 1、表皮干细胞的分离、培养
①将皮肤组织放入含4%青霉素/链霉素的PBS中清洗两次，然后在解剖镜下剪去皮下脂肪结缔组织；
②将剪去皮下脂肪结缔组织的其余皮肤组织放入PBS清洗三次；
③将清洗好的皮肤组织放入培养皿中，用棉球沾取碘酒进行上下涂拭进行消毒处理， 然后立即放入70%乙醇去碘，再用PBS去乙醇；
④将消毒处理后的皮肤组织剪成2cmX0.5 cm条状，表皮面朝上于4°C 2 U/mL Dispase II 消化 12 14 hr;
⑤在解剖镜下用尖镊分离经消化的皮肤组织的表皮和真皮，取下表皮并放入PBS清
洗；
⑥将表皮放入0.25% Trypsin/0. 05% EDTA中，用弯剪将表皮剪碎，放置于37°C消化 10 15 min ；
⑦用37°C预热的含20%FBS的DMEM中止消化，轻缓吹散表皮碎片；100目细胞筛过滤表皮碎片，余下细胞悬液放置于15 mL离心管；
⑧常温下IOOg离心5min ；
⑨弃上清液，用KSFM轻缓重新悬浮沉淀的细胞，接种于6cm培养皿中，置于37°C 5%C02培养箱培养，培养时间为18 Mhr。⑩吸弃上清液，加入新鲜KFSM ；之后隔天半量换液，当表皮干细胞密度为50%以上时每天换液，至80%时传代。2、牙胚间充质的分离
①取E13.5的小鼠胚胎，在解剖镜下利用尖镊取下胚胎头部并分离下颂；
②将下颂放入2U/mL的Dispase液体中，37 °C消化8 min ；
③解剖镜下，利用尖镊分离磨牙区的牙胚上皮和间充质组织；
④将6 8个牙间充质组织放入装有含10%FBS的DMEM的离心管中，2000rpm离心 5 min，放置于37 V 5% CO2培养箱孵育1 hr，形成牙胚间充质团。3、组合生长因子吸附体的制备
取10 μ L琼脂糖微球清洗晾干后，放入含有120 150 Pg/mL FGF8和200 250 μδ/ mL SHH的20 μ L混合液中静置30 min进行充分吸附，制成琼脂糖微球生长因子吸附体。4、嵌合体重组
①将Trowell器官培养皿外层装PBS缓冲液，里层装含10%胎牛血清(FBS)的DMEM液体培养基；同时在里层依次放入支架网和0. 45 μ m的滤膜，里层的液体培养基刚好没过滤膜；
②利用耳勺将上述步骤2分离的牙胚间充质团挑出，放在准备好的Trowell器官培养皿的滤膜上；
③将7 9个吸附生长因子的琼脂糖微球放到牙胚间充质团上；
④将密度为80% 90%的表皮干细胞刮下，覆盖在滤膜上的附有琼脂糖微球牙胚间充质团上，即嵌合体构建好，于37 V 5%C02培养箱孵育过夜。5、移植裸鼠肾囊膜
①将裸鼠麻醉后，剪开肾部位上方的皮肤和肌肉；
②用弯镊取出肾，在解剖镜下用尖镊将肾囊膜剪开一个小口；
③将上述构建好的嵌合体移植入肾囊膜内；④将移植后的肾放回腹腔，缝合肌肉和皮肤；
⑤裸鼠继续喂养20天。6、嵌合体的鉴定 (1)固定与切片
①固定将移植20天的嵌合体组织取下，放置于4°C的4%多聚甲醛固定12 Mhr ；
②脱钙采用10%EDTA脱钙到嵌合体组织软化；
③脱水依次利用30%、50%、70%、90%和100%乙醇进行逐道进行脱水，每道1hr，然后 100%乙醇再重复一次；
④透明按无水乙醇二甲苯为1:1的比例配制透明液，透明处理30 min，然后放入二甲苯至组织透明为止；
⑤透蜡按二甲苯石蜡为1:1的比例配制透蜡液，透蜡处理30 min，然后放入3道石蜡中，每道1 hr。⑥包埋在解剖镜下将组织放入装满石蜡的纸盒中，注意组织的前后左右方向。⑦切片在切片机进行连续切片，贴在载玻片上，在展片机上展片15 20min， 60°C烘干后放置_20°C备用。(2) HE 染色
①脱蜡将上述组织切片依次放入2道二甲苯，每道15min ；
②复水依次放入100%、90%、70%、50%、30%乙醇和双蒸水，每道5min ；
③放入苏木精染液进行染色8 15min,自来水冲洗2 min ；
④放入伊红染液进行染色30s ；
⑤脱水依次放入70%、90%和100%乙醇，每道5min，然后100%乙醇重复一次；
⑥二甲苯透明，中性树脂封片。显微镜下观察嵌合体是否具有牙本质、成牙本质细胞、牙釉质或成牙釉质细胞的结构仅有牙本质和成牙本质细胞两种结构计为成牙；具有牙本质、成牙本质细胞、牙釉质和成牙釉质细胞四种结构计为成釉。最后统计成牙率与成釉率。本发明所述的器械均为灭菌过的器械，灭菌条件为121°C灭菌20min。本发明所述的细胞培养皿和器官培养皿均购自Corning公司。本发明所述的TE溶液成分为0. 25%胰蛋白酶和0. 05%EDTA。本发明所述的Dispase酶、生长因子TOF8和SHH均购于R & D公司。本发明所述的DMEM 和 KSFM ( Keratinocyte serum-free medium)培养基均购自 GIBCO公司。本发明所述的皮肤组织为小鼠或大鼠出生1天后的背部皮肤，或幼儿包皮环切后遗弃的包皮，幼儿年龄在5 12岁，无其它疾病感染，标本得到患者家属知情同意。所有标本按照福建师范大学动物伦理委员会的相关规定执行。本发明所述的小鼠、大鼠和裸鼠均购自上海斯莱克实验动物有限公司，按照SPF 级条件饲养。采用本发明所述的FGF8/SHH双生长因子组合法诱导表皮干细胞的方法，成牙率和成釉率分别至少提高至48%和67%。这与仅添加FGF8单个生长因子诱导的对照组的成牙率和成釉率分别至少提高了 20%和35%。同时，FGF8/SHH双生长因子组合法操作简便，简易普及。
图1是本发明所述的FGF8/SHH双生长因子组合法提高表皮干细胞牙向分化效率的方法流程示意图。图2是本发明所述的表皮干细胞不同培养阶段生长形态图。图3是本发明所述的FGF8/SHH双生长因子组合法诱导表皮干细胞向成牙釉质细胞分化嵌合体结构图。
具体实施例方式为了对本发明有进一步的理解，现结合附图一实施例的方式对本发明进行阐述。图2中，㈧为培养1天的细胞形态；⑶为培养3天的细胞形态；(C)为培养6 天的细胞形态；(D)为培养8天的细胞形态；(E)为培养11天的细胞形态；(F)为培养13 天的细胞形态。图中标尺均为100 μπι。图3中，(Α，C)为添加FGF8/SHH组合生长因子的嵌合体形态观察；(B)⑶ 分别为图A和图C的局部放大图，示成牙且成牙釉质细胞拉长，产生釉质。成牙釉质细胞(ameloblast，AM)、釉质(enamel, EN)、牙本质(dentin，DE)、成牙本质细胞 (odontoblasts, 0d)、牙乳头(dental pulp, DP)。图 A，C 的标尺为 50 μ m，图 B，D 的标尺为 20 μπι。箭头指示成牙釉质细胞拉长。实施例1
1、表皮干细胞的分离、培养
①将出生1天的小鼠处死后，取背部皮肤组织放入含4%青霉素/链霉素的PBS中清洗两次，然后在解剖镜下剪去皮下脂肪组织；
②将其余皮肤组织放入PBS清洗三次；
③将清洗好的皮肤组织放入培养皿中，用棉球沾取碘酒进行上下涂拭，然后立即放入 70%乙醇去碘，再用PBS去乙醇；
④将消毒的皮肤组织剪成2cmXO. 5 cm条状，表皮面朝上于4°C 2 U/mL Dispase II 消化12 hr ；
⑤在解剖镜下用尖镊分离经消化的皮肤组织的表皮和真皮，取下表皮并放入PBS清
洗；
⑥将表皮放入0.25% Trypsin/0. 05% EDTA中，用弯剪将表皮剪碎，放置于37°C消化10
min ；
⑦用37°C预热的含20%FBS的DMEM中止消化，轻缓吹散表皮碎片；100目细胞筛过滤表皮碎片，余下细胞悬液放置于15 mL离心管；
⑧常温下IOOg离心5min ；
⑨弃上清，用KSFM轻缓重新悬浮沉淀的细胞，接种于6cm培养皿中，置于37°C 5%C02 培养箱培养，培养时间为18hr ；
⑩吸弃上清，加入新鲜KFSM；之后隔天半量换液，当表皮干细胞密度为50%以上时每天换液，至80%时传代。
6
2、牙胚间充质的分离
①取E13.5的小鼠胚胎，在解剖镜下利用尖镊取下胚胎头部并分离下颂；
②将下颂放入2U/mL的Dispase液体中，37 °C消化8 min ；
③解剖镜下，利用尖镊分离磨牙区的牙胚上皮和间充质；
④将8个牙间充质放入装有含10%FBS的DMEM的离心管中，2000rpm离心5 min，放置于37 V 5% C02培养箱孵育1 hr，形成牙胚间充质团。3、组合生长因子的添加
取10 μ L琼脂糖微球清洗晾干后，放入生长因子FGF8 (120 Pg/mL)和SHH (200 μδ/ mL)的混合液中静置30 min。4、嵌合体重组
①将Trowell器官培养皿外层装PBS，里层装含10%FBS的DMEM；同时在里层依次放入支架网和0. 45 μ m的滤膜，里层的液体刚好没过滤膜；
②利用耳勺将上述步骤2分离的牙胚间充质团挑出，放在准备好的Trowell器官培养皿的滤膜上；
③将7个吸附生长因子的琼脂糖微球放到牙胚间充质团上；
④将密度为80% 90%的表皮干细胞刮下，覆盖在滤膜上的附有琼脂糖微球牙胚间充质团上，即嵌合体构建好，于37 V 5%C02培养箱孵育过夜。5、移植裸鼠肾囊膜
①将裸鼠麻醉后，剪开肾部位上方的皮肤和肌肉；
②用弯镊取出肾，在解剖镜下用尖镊将肾囊膜剪开一个小口；
③将上述构建好的嵌合体移植入肾囊膜内；
④将移植后的肾放回腹腔，缝合肌肉和皮肤；
⑤裸鼠继续喂养20天。6、嵌合体的鉴定 (1)固定与切片
①固定将移植20天的嵌合体组织取下，放置于4°C的4%多聚甲醛固定12hr ；
②脱钙采用10%EDTA脱钙到嵌合体组织软化；
③脱水依次利用30%、50%、70%、90%和100%乙醇进行逐道进行脱水，每道1hr，然后 100%乙醇再重复一次；
④透明按无水乙醇二甲苯为1:1的比例配制透明液，透明处理30 min，然后放入二甲苯至组织透明为止；
⑤透蜡按二甲苯石蜡为1:1的比例配制透蜡液，透蜡处理30 min，然后放入3道石蜡中，每道1 hr ；
⑥包埋在解剖镜下将组织放入装满石蜡的纸盒中，注意组织的前后左右方向；
⑦切片在切片机进行连续切片，贴在载玻片上，在展片机上展片15min，6(TC烘干后放置_20°C备用。(2) HE 染色
①脱蜡将上述组织切片依次放入2道二甲苯，每道15min ；
②复水依次放入100%、90%、70%、50%、30%乙醇和双蒸水，每道5min ；③放入苏木精染液进行染色8min,自来水冲洗2 min ；
④放入伊红染液进行染色30s ；
⑤脱水依次放入70%、90%和100%乙醇，每道5min，然后100%乙醇重复一次；
⑥二甲苯透明，中性树脂封片。显微镜下观察嵌合体是否具有牙本质、成牙本质细胞、牙釉质或成牙釉质细胞的结构仅有牙本质和成牙本质细胞两种结构计为成牙；具有牙本质、成牙本质细胞、牙釉质和成牙釉质细胞四种结构计为成釉。最后统计成牙率与成釉率分别提高至5 和72%。与采用单一 FGF8生长因子能够诱导人表皮干细胞向成牙釉质细胞分化的方法所得数据(成牙率约为观％，成釉率约为31%)相比，分别提高了 24%和41%。实施例2
1、表皮干细胞的分离、培养
①将出生1天的大鼠处死后，取背部皮肤组织放入含4%青霉素/链霉素的PBS中清洗两次，然后在解剖镜下剪去皮下脂肪组织；
②将其余皮肤组织放入PBS清洗三次；
③将清洗好的皮肤组织放入培养皿中，用棉球沾取碘酒进行上下涂拭，然后立即放入 70%乙醇去碘，再用PBS去乙醇；
④将消毒的皮肤组织剪成2cmXO. 5 cm条状，表皮面朝上于4°C 2 U/mL Dispase II 消化13 hr ；
⑤在解剖镜下用尖镊分离经消化的皮肤组织的表皮和真皮，取下表皮并放入PBS清
洗；
⑥将表皮放入0.25% Trypsin/0. 05% EDTA中，用弯剪将表皮剪碎，放置于37°C消化12
min ；
⑦用37°C预热的含20%FBS的DMEM中止消化，轻缓吹散表皮碎片；100目细胞筛过滤表皮碎片，余下细胞悬液放置于15 mL离心管；
⑧常温下IOOg离心5min ；
⑨弃上清，用KSFM轻缓重新悬浮沉淀的细胞，接种于6cm培养皿中，置于37°C 5%C02 培养箱培养，培养时间为18 Mhr ；
⑩吸弃上清，加入新鲜KFSM；之后隔天半量换液，当表皮干细胞密度为50%以上时每天换液，至80%时传代。2、牙胚间充质的分离
①取E13.5的小鼠胚胎，在解剖镜下利用尖镊取下胚胎头部并分离下颂；
②将下颂放入2U/mL的Dispase液体中，37 °C消化8 min ；
③解剖镜下，利用尖镊分离磨牙区的牙胚上皮和间充质；
④将7个牙间充质放入装有含10%FBS的DMEM的离心管中，2000rpm离心5 min，放置于37 V 5% C02培养箱孵育1 hr，形成牙胚间充质团。3、组合生长因子的添加
取10 μ L琼脂糖微球清洗晾干后，放入生长因子FGF8 (130 Pg/mL)和SHH (240 μδ/ mL)的混合液中静置30 min。4、嵌合体重组①将Trowell器官培养皿外层装PBS，里层装含10%FBS的DMEM；同时在里层依次放入支架网和0. 45 μ m的滤膜，里层的液体刚好没过滤膜；
②利用耳勺将上述步骤2分离的牙胚间充质团挑出，放在准备好的Trowell器官培养皿的滤膜上；
③将8个吸附生长因子的琼脂糖微球放到牙胚间充质团上；
④将密度为80% 90%的表皮干细胞刮下，覆盖在滤膜上的附有琼脂糖微球牙胚间充质团上，即嵌合体构建好，于37 V 5%C02培养箱孵育过夜。5、移植裸鼠肾囊膜
①将裸鼠麻醉后，剪开肾部位上方的皮肤和肌肉；
②用弯镊取出肾，在解剖镜下用尖镊将肾囊膜剪开一个小口；
③将上述构建好的嵌合体移植入肾囊膜内；
④将移植后的肾放回腹腔，缝合肌肉和皮肤；
⑤裸鼠继续喂养20天。6、嵌合体的鉴定 (1)固定与切片
①固定将移植20天的嵌合体组织取下，放置于4°C的4%多聚甲醛固定14hr ；
②脱钙采用10%EDTA脱钙到嵌合体组织软化；
③脱水依次利用30%、50%、70%、90%和100%乙醇进行逐道进行脱水，每道1hr，然后 100%乙醇再重复一次；
④透明按无水乙醇二甲苯为1:1的比例配制透明液，透明处理30 min，然后放入二甲苯至组织透明为止；
⑤透蜡按二甲苯石蜡为1:1的比例配制透蜡液，透蜡处理30 min，然后放入3道石蜡中，每道1 hr ；
⑥包埋在解剖镜下将组织放入装满石蜡的纸盒中，注意组织的前后左右方向；
⑦切片在切片机进行连续切片，贴在载玻片上，在展片机上展片17min，6(TC烘干后放置_20°C备用。(2) HE 染色
①脱蜡将上述组织切片依次放入2道二甲苯，每道15min ；
②复水依次放入100%、90%、70%、50%、30%乙醇和双蒸水，每道5min ；
③放入苏木精染液进行染色10min,自来水冲洗2 min ；
④放入伊红染液进行染色30s ；
⑤脱水依次放入70%、90%和100%乙醇，每道5min，然后100%乙醇重复一次；
⑥二甲苯透明，中性树脂封片。显微镜下观察嵌合体是否具有牙本质、成牙本质细胞、牙釉质或成牙釉质细胞的结构仅有牙本质和成牙本质细胞两种结构计为成牙；具有牙本质、成牙本质细胞、牙釉质和成牙釉质细胞四种结构计为成釉。最后统计成牙率与成釉率分别提高至50%和71%。与采用单一 FGF8生长因子能够诱导人表皮干细胞向成牙釉质细胞分化的方法所得数据(成牙率约为观％，成釉率约为31%)相比，分别提高了 2 和40%。实施例31、表皮干细胞的分离、培养
①将取自福州儿童医院年龄6岁的幼儿包皮环切手术后遗弃的离体!Bhr内的包皮组织，放入含4%青霉素/链霉素的PBS中清洗两次，然后在解剖镜下剪去皮下脂肪组织；
②将其余皮肤组织放入PBS清洗三次；
③将清洗好的皮肤组织放入培养皿中，用棉球沾取碘酒进行上下涂拭，然后立即放入 70%乙醇去碘，再用PBS去乙醇；
④将消毒的皮肤组织剪成2cmXO. 5 cm条状，表皮面朝上于4°C 2 U/mL Dispase II 消化14 hr ；
⑤在解剖镜下用尖镊分离经消化的皮肤组织的表皮和真皮，取下表皮并放入PBS清
洗；
⑥将表皮放入0.25% Trypsin/0. 05% EDTA中，用弯剪将表皮剪碎，放置于37°C消化15
min ；
⑦用37°C预热的含20%FBS的DMEM中止消化，轻缓吹散表皮碎片；100目细胞筛过滤表皮碎片，余下细胞悬液放置于15 mL离心管；
⑧常温下IOOg离心5min ；
⑨弃上清，用KSFM轻缓重新悬浮沉淀的细胞，接种于6cm培养皿中，置于37°C 5%C02 培养箱培养，培养时间为18 Mhr ；
⑩吸弃上清，加入新鲜KFSM；之后隔天半量换液，当表皮干细胞密度为50%以上时每天换液，至80%时传代。2、牙胚间充质的分离
①取E13.5的小鼠胚胎，在解剖镜下利用尖镊取下胚胎头部并分离下颂；
②将下颂放入2U/mL的Dispase液体中，37 °C消化8 min ；
③解剖镜下，利用尖镊分离磨牙区的牙胚上皮和间充质；
④将8个牙间充质放入装有含10%FBS的DMEM的离心管中，2000rpm离心5 min，放置于37 V 5% C02培养箱孵育1 hr，形成牙胚间充质团。3、组合生长因子的添加
取10 μ L琼脂糖微球清洗晾干后，放入生长因子FGF8 (140 Pg/mL)和SHH (220 μδ/ mL)的混合液中静置30 min。4、嵌合体重组
①将Trowell器官培养皿外层装PBS，里层装含10%FBS的DMEM；同时在里层依次放入支架网和0. 45 μ m的滤膜，里层的液体刚好没过滤膜；
②利用耳勺将上述步骤2分离的牙胚间充质团挑出，放在准备好的Trowell器官培养皿的滤膜上；
③将9个吸附生长因子的琼脂糖微球放到牙胚间充质团上；
④将密度为80% 90%的表皮干细胞刮下，覆盖在滤膜上的附有琼脂糖微球牙胚间充质团上，即嵌合体构建好，于37 V 5%C02培养箱孵育过夜。5、移植裸鼠肾囊膜
①将裸鼠麻醉后，剪开肾部位上方的皮肤和肌肉；
②用弯镊取出肾，在解剖镜下用尖镊将肾囊膜剪开一个小口；③将上述构建好的嵌合体移植入肾囊膜内；
④将移植后的肾放回腹腔，缝合肌肉和皮肤；
⑤裸鼠继续喂养20天。6、嵌合体的鉴定 (1)固定与切片
①固定将移植20天的嵌合体组织取下，放置于4°C的4%多聚甲醛固定18hr；
②脱钙采用10%EDTA脱钙到嵌合体组织软化；
③脱水依次利用30%、50%、70%、90%和100%乙醇进行逐道进行脱水，每道1hr，然后 100%乙醇再重复一次；
④透明按无水乙醇二甲苯为1:1的比例配制透明液，透明处理30 min，然后放入二甲苯至组织透明为止；
⑤透蜡按二甲苯石蜡为1:1的比例配制透蜡液，透蜡处理30 min，然后放入3道石蜡中，每道1 hr ；
⑥包埋在解剖镜下将组织放入装满石蜡的纸盒中，注意组织的前后左右方向；
⑦切片在切片机进行连续切片，贴在载玻片上，在展片机上展片20min，6(TC烘干后放置_20°C备用。(2) HE 染色
①脱蜡将上述组织切片依次放入2道二甲苯，每道15min ；
②复水依次放入100%、90%、70%、50%、30%乙醇和双蒸水，每道5min ；
③放入苏木精染液进行染色15min,自来水冲洗2 min ；
④放入伊红染液进行染色30s ；
⑤脱水依次放入70%、90%和100%乙醇，每道5min，然后100%乙醇重复一次；
⑥二甲苯透明，中性树脂封片。显微镜下观察嵌合体是否具有牙本质、成牙本质细胞、牙釉质或成牙釉质细胞的结构仅有牙本质和成牙本质细胞两种结构计为成牙；具有牙本质、成牙本质细胞、牙釉质和成牙釉质细胞四种结构计为成釉。最后统计成牙率与成釉率分别提高至48%和67%。与采用单一 FGF8生长因子能够诱导人表皮干细胞向成牙釉质细胞分化的方法所得数据(成牙率约为观％，成釉率约为31%，具体见附件的已发表论文)相比，分别提高了 20%和36%。
1权利要求
1.一种FGF8/SHH组合法提高表皮干细胞牙向分化效率的方法，首先将表皮干细胞进行分离和培养，得到传代的表皮干细胞；同时将由小鼠胚胎磨牙区分离得到的牙胚间充质组织团粒与传代的表皮干细胞进行重组成嵌合体，最后将嵌合体移植裸鼠肾囊膜中进行诱导培养，其特征在于小鼠胚胎磨牙区分离得到的牙胚间充质组织团粒与传代的表皮干细胞进行重组前，牙胚间充质组织预先附着上含有双组合生长因子吸附体琼脂糖微球。
2.根据权利要求1所述的一种FGF8/SHH组合法提高表皮干细胞牙向分化效率的方法，其特征在于所述的吸附体琼脂糖微球，首先将琼脂糖微球清洗晾干后，放入含有FGF8和SHH生长因子的混合液中静置30 min进行充分吸附，制成琼脂糖微球生长因子吸附体，其中20 μ L的混合液可放入10 μ L晾干后的琼脂糖微球。
3.根据权利要求2所述的一种FGF8/SHH组合法提高表皮干细胞牙向分化效率的方法，其特征在于所述的FGF8，在混合液中的浓度为120 150 Pg/mL。
4.根据权利要求2所述的一种FGF8/SHH组合法提高表皮干细胞牙向分化效率的方法，其特征在于所述的SHH生长因子，在混合液中的浓度为200 250 Pg/mL。
全文摘要
本发明涉及一种采用FGF8/SHH双生长因子组合法提高动物上皮组织来源的表皮干细胞向成牙釉质细胞分化效率的方法。首先将表皮干细胞进行分离和培养，得到传代的表皮干细胞；同时将附着有双生长因子的蛋白A琼脂糖珠子的由小鼠胚胎磨牙区分离得到的牙胚上皮和间充质组织团粒与表皮干细胞进行重组成嵌合体，最后将嵌合体移植裸鼠肾囊膜中进行诱导培养。FGF8在混合液中的浓度为120～150μg/mL，SHH在混合液中的浓度为200～250 μg/mL。采用本发明所述的方法，成牙率和成釉率分别至少提高至48%和67%，同时，FGF8/SHH双生长因子组合法操作简便，简易普及。
文档编号C12N5/071GK102559582SQ20121002473
公开日2012年7月11日 申请日期2012年2月6日 优先权日2012年2月6日
发明者张彦定, 王冰梅, 陈一平, 黄义德 申请人:福建师范大学