专利名称：一种鉴别绿盖裘氏牛肝菌的特异引物及鉴别方法
技术领域：
本发明涉及一种绿盖裘氏牛肝菌(CXiwaVirens (W. F. Chiu) Yan C. Li & Zhu L. Yang)的PCR鉴别方法及其特异引物，属于利用分子生物学方法鉴别食毒不清牛肝菌技术领域。
背景技术：
云南多元的立体气候和复杂的生境孕育了丰富的野生菌资源，这些资源在增加山区农户家庭收入中有重要的作用，有的偏远地区，野生菌的收入约占家庭年收入1/3-1/2。 在野生菌资源中牛肝菌资源是分布最广、种类最多、形态相似性较高、形态学鉴定相对较难、资源量最大的类群。牛肝菌类群真菌组织呈肉质，易生虫和腐烂，所以为了便于储藏和携带，牛肝菌常常被加工成干片销售，而牛肝菌经加工成干片后形态变化大，导致品质高的和品质低的混淆，有毒种和可食种或食毒不清的种混淆，导致野生食用菌产品混淆严重，品质层次不齐，给消费者人生安全带来潜在危害。绿盖裘氏牛肝菌仏virens)在云南分布区域广、产量高、可食性不清楚，采集者和中间贸易商常常将其加工成干片混于其它可食或品质较高的牛肝菌中销售，偶有造成中毒事件发生。而目前鉴别绿盖裘氏牛肝菌的方法主要是形态学分类法。要从混杂的商品牛肝菌中准确鉴别出食毒不清的绿盖裘氏牛肝菌需要有一定大型真菌分类学基础，但消费者往往不具备这方面的知识，因此，一方面导致中毒事件的发生，另一方面，纵容了不法经销商。目前，国内对绿盖裘氏牛肝菌的研究主要集中的形态分类及系统学研究方面，应用其特异引物对该菌进行快速鉴别或检测的研究未见报道。
发明内容
本发明的目的是提供一种绿盖裘氏牛肝菌鉴别的PCR方法及其特异引物，是对绿盖裘氏牛肝菌或混合牛肝菌进行快速鉴别的方法。
每一个物种都有其独有的遗传物质DNA，它不会随环境及表型变化而变化。随着分子生物学的快速发展，在细胞外进行物种特有DNA片段或序列操作成为了现实，即运用物种的特异引物，通过PCR扩展，并应用琼脂糖凝胶电泳检测其特有片段，实现物种的快速鉴别成为现实。一种鉴别绿盖裘氏牛肝菌的特异引物CVf和CVr，其DNA序列为 CVf CTT ACC GAA CGG AMG GGA TAA CAC C
CVr AGA AGC AAA GNA CAG GAA AAG CAT A 用上述一对特异引物鉴别绿盖裘氏牛肝菌的方法按以下步骤进行
1)牛肝菌样品DNA提取；
2)以上述DNA为模板，用特异引物CVf和CVr进行PCR扩增反应，扩增条件94°C变性 5 min，然后进入；35个循环(94°C变性1 min，55°C退火0. 4 min，72°C延伸0. 4 min)，循环结束后于72°c延伸5 min ；
3)取上述pcr扩增产物在质量浓度为1%的琼脂糖凝胶上电泳，锈化乙锭染色，紫外透
射仪检测扩增片段有无及大小，鉴别牛肝菌中是否混有食毒不清的绿盖裘氏牛肝菌。本发明的方法采用一对特异引物，通过PCR反应即能有效地鉴别混合牛肝菌中是
否混有绿盖裘氏牛肝菌。本发明方法不需要对pcr产物测序，具有快速和准确的特点，一般
从拿到牛肝菌混合样品到出鉴定结果仅需2-3小时。
图1为应用特异引物pcr扩增牛肝菌混合样品产物的dna片段琼脂糖凝胶电泳
图，表1为图1序号注释。表 权利要求
1.一种鉴别绿盖裘氏牛肝菌的特异引物，其特征在于特异引物对是CVf和CVr，其DNA序列为CVf :CTT ACC GAA CGG AMG GGA TAA CAC CCVr :AGA AGC AAA GNA CAG GAA AAG CAT A 。
2.用权利要求1所述的特异引物鉴别绿盖裘氏牛肝菌的方法，其特征在于按以下步骤进行(1)牛肝菌样品DNA提取；(2)以上述DNA为PCR扩增的模板，用特异引物对CVf和CVr进行PCR扩增；(3)取上述(2)的PCR扩增产物在质量浓度为1%的琼脂糖凝胶上电泳，锈化乙锭染色，紫外透射仪检测扩增片段有无及大小，鉴别牛肝菌中是否混有食毒不清的绿盖裘氏牛肝菌。
3.根据权利要求2所述的特异引物鉴别绿盖裘氏牛肝菌的方法，其特征是所述步骤(2)中PCR扩增条件是94°C变性5 min，然后进入连续35个循环，每个循环条件为94°C变性1 min，55°C退火0. 4 min，72°C延伸0. 4 min，循环结束后于72°C延伸5 min。
全文摘要
本发明是一种鉴别绿盖裘氏牛肝菌的特异引物及鉴别方法。特异引物为CVf和CVr，其DNA序列为CVfCTTACCGAACGGAMGGGATAACACC；CVrAGAAGCAAAGNACAGGAAAAGCATA。通过提取混合牛肝菌样品的总DNA，运用特异引物PCR扩增，琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物，达到鉴别混合牛肝菌样品中是否混有食毒不清的绿盖裘氏牛肝菌。本发明方法不需要对PCR产物测序，具有快速和准确的特点，一般从拿到牛肝菌混合样品到出鉴定结果仅需2-3小时。
文档编号C12R1/645GK102559907SQ20121002410
公开日2012年7月11日 申请日期2012年2月3日 优先权日2012年2月3日
发明者李树红, 柴红梅, 田果廷, 赵永昌, 赵静 申请人:云南省农业科学院生物技术与种质资源研究所