专利名称：一种体外培养牛胚胎的培养基的制作方法
技术领域：
本发明涉及体外培养牛胚胎的技术领域，具体为一种体外培养牛胚胎的培养基。
背景技术：
现有的体外培养牛胚胎的培养基，其一般选取含有牛血清白蛋白(BSA)的CRlaa 培养基，但是现有的培养基在体外培养牛胚胎时，其总囊胚发育率和直质量囊胚(Cl囊胚， IETS标准)的总数并不高，为此，研究人员进行了大量的实验，具体实验数据见图1，其证实柠檬酸钠和BSA对牛体外受精胚胎的体外发育有有益的影响，同时也确定在BSA和血清中含有的不同的胚胎营养素因子，可能不是柠檬酸钠，对促进牛桑椹胚和囊胚发育，故发现这种胚胎营养素因子对于体外培养牛胚胎的培养基的成分至关重要。
发明内容
针对上述问题，本发明提供了一种体外培养牛胚胎的培养基，其加入了一种新的胚胎营养素因子，使得在该培养基中培养的牛体外胚胎的总囊胚发育率高，且高质量囊胚的总数提高。一种体外培养牛胚胎的培养基，其技术方案是这样的 其特征在于培养基中额外加入二价镁离子。其进一步特征在于
当二价镁离子的含量为0. 35mM 2. ImM时，培养基可提高高质量牛胚胎的数量和质
量；
当二价镁离子的含量为1. 4mM 2. SmM时，培养基可提高牛胚胎中的雌性比。其更进一步特征在于
所述二价镁离子的来源具体为硫酸镁化合物或氯化镁化合物中的二价镁离子； 牛胚胎的所述培养基适合与培养所有牛品种，印系牛(Bos Indicus),欧系牛(Bos Taurus)、以及杂交品系，包括奶牛、肉牛、黄牛、婆罗门牛；
所述牛胚胎包括体内胚胎、体外胚胎、孤雌活化胚胎、克隆胚胎、品种杂交的胚胎； 所述培养基适合于培养所有牛的胚胎，包括新鲜胚胎、慢速冷冻胚胎、玻璃化冷冻胚
胎；
所述体外培养牛胚胎的培养基适合于培养所有牛的胚胎，包括从一细胞开始到胚胎着床前后的囊胚期。采用本发明的结构后，在现有技术的体外培养牛胚胎的培养基中加入二价镁离子后，从数据图表可知，相对于未加入二价镁离子的培养基，其使得在该培养基中培养的牛体外胚胎的总囊胚发育率高，且高质量囊胚的总数提高。
图1为现有技术的培养基中BSA、柠檬酸钠和FBS对体外培养牛胚胎发育的影响效
3果数据表格；
图2为在培养基中加入二价镁离子从0到2. ImM对体外培养牛胚胎发育的影响效果数据表格；
图3为基础培养基中添加镁离子浓度为1. 4mM时对体外培养牛胚胎发育的影响效果数据表格；
图4为基础培养基中添加二价镁离子来源分别为硫酸镁化合物或氯化镁化合物时对体外培养牛胚胎发育的影响效果数据表格；
图5为在培养基中加入二价镁离子从0到5. 6mM对体外培养牛胚胎发育性别的影响效果数据表格。
具体实施例方式实验一含有二价镁离子的培养基对体细胞共培养的IVF胚胎的影响
如图2所示，将加入了 BSA的无血清CRlaa培养基分为A-E五组体外培养牛胚胎，其中 A组不加入二价镁离子，B、C、D、E组加入0. 35mM,0. 70 mM、l. 4 mM、2. 1 mM的二价镁离子， A-E五组的表明活性剂均为6 mg/ml的ICPbio BSA，在相同的其余环境下，分别重复四次， 取得实验数据，图2说明在培养基中加入二价镁离子从0. 35mM到2. ImM，胚胎培养的质量从桑葚期开始有显著的提高，且1. 4mM的浓度下培养的相对0. 35mM浓度下培养的胚胎数量和质量要显著提高。实验二 培养基添加镁离子浓度为0或1. 4mM时对体外培养牛胚胎发育的影响如图3所示，将无血清CRlaa培养基分为A-F六组体外培养牛胚胎，其中A组不加入镁
离子且表明活性剂为ICPbio BSA、B组加入1. 4mM的氯化镁化合物且表明活性剂为ICPbio BSA、C组不加入镁离子且表明活性剂为Sigma BSA、D组不加入镁离子且表明活性剂为PVA、 E组加入1. 4mM的氯化镁化合物且表明活性剂为PVA、F组不加入镁离子且表明活性剂为 FBS，在相同的其余环境下，分别重复四次，取得实验数据，图3说明在基础培养基中添加镁离子浓度为1.4mM时，可显著的提高高质量牛胚胎的数量(这些高质量的胚胎是指适合冷冻保存和胚胎移植的)，并且和添加小牛胎血清(FBS)的效果相当。实验三基础培养基中添加二价镁离子来源分别为硫酸镁化合物或氯化镁化合物时对体外培养牛胚胎发育的影响效果
如图4所示，将无血清CRlaa培养基分为A-F五组体外培养牛胚胎，其中A组不加入二价镁离子且牛血清蛋白为Sigma提供、B组加入1. 4mM的氯化镁化合物且表明活性剂为 Sigma BSAX组加入1. 4mM的硫酸镁化合物且表明活性剂为Sigma BSA,D组不加入镁离子且表明活性剂为ICPbio BSA、E组加入1. 4mM的氯化镁化合物且表明活性剂为ICPbio BSA、 F组加入1. 4mM的硫酸镁化合物且表明活性剂为ICPbio BSA,在相同的其余环境下，分别重复四次，取得实验数据，图4说明镁离子的来源不会影响胚胎的培养，无论是来自硫酸镁或氯化镁的二价镁离子。实验四培养基中加入二价镁离子从O到5. 6mM对体外培养牛胚胎发育性别的影响效果
如图5所示，在基础培养基中分别加入数值为0、0. 35mM、0. 70 mM、l. 4 mM、2. 1 mM、2. 8 mM、3. 5 mM、4. 2 mM、5. 6 mM的二价镁离子后，在相同的其余环境下，分别重复，取得实验数据，图5标明二价镁离子的浓度变化会影响牛胚胎的性别比，浓度1. 4mM 2. 8mM，雌性比显
者提尚。由于母牛的经济效益远远高于公牛，故当二价镁离子的含量为1. 4mM 2. SmM时， 培养基可提高牛胚胎中的雌性比，其给养殖业所带来的经济效益高。其中
Sigma 美国一家生化公司； ICPbio 新西兰的一家生物公司； BSA:牛血清白蛋白； FBS 胎牛血清；
CRlaa培养基一种现有技术的培养基； PVA:聚乙烯醇； mM :mmol/L即毫摩尔每升。
权利要求
1.一种体外培养牛胚胎的培养基，其特征在于培养基中额外加入二价镁离子。
2.根据权利要求1所述的一种体外培养牛胚胎的培养基，其特征在于当二价镁离子的含量为0. 35mM 2. ImM时，培养基可提高高质量牛胚胎的数量和质量。
3.根据权利要求1所述的一种体外培养牛胚胎的培养基，其特征在于当二价镁离子的含量为1. 4mM 2. SmM时，培养基可提高牛胚胎中的雌性比。
4.根据权利要求2所述的一种体外培养牛胚胎的培养基，其特征在于当二价镁离子的含量为1. 4mM时，培养基可显著提高高质量牛胚胎的数量和质量。
5.根据权利要求1至4中任一权利要求所述的一种体外培养牛胚胎的培养基，其特征在于所述二价镁离子的来源具体为硫酸镁化合物或氯化镁化合物中的二价镁离子。
6.根据权利要求1至4中任一权利要求所述的一种体外培养牛胚胎的培养基，其特征在于所述的一种体外培养牛胚胎的培养基适合于养所有牛品种，印系牛、欧系牛、以及杂交品系，包括奶牛、肉牛、黄牛、婆罗门牛。
7.根据权利要求6中任一权利要求所述的一种体外培养牛胚胎的培养基，其特征在于所述的一种体外培养牛胚胎的培养基适合于培养所有牛的胚胎，包括体内胚胎、体外胚胎、孤雌活化胚胎、克隆胚胎、品种杂交的胚胎。
8.根据权利要求7所述的一种体外培养牛胚胎的培养基，其特征在于所述的一种体外培养牛胚胎的培养基适合于培养所有牛的胚胎，包括新鲜胚胎、慢速冷冻胚胎、玻璃化冷冻胚胎。
9.根据权利要求8所述的一种体外培养牛胚胎的培养基，其特征在于所述的一种体外培养牛胚胎的培养基适合于培养所有牛的胚胎，包括从一细胞开始到胚胎着床前后的囊胚期。
全文摘要
本发明提供了一种体外培养牛胚胎的培养基，其加入了一种新的胚胎营养素因子，使得在该培养基中培养的牛体外胚胎的总囊胚发育率高，且高质量囊胚的总数提高。其特征在于培养基中额外加入二价镁离子。
文档编号C12N5/073GK102559585SQ20121002363
公开日2012年7月11日 申请日期2012年2月3日 优先权日2012年2月3日
发明者徐捷, 杜福良, 杨澜, 薛非 申请人:兰诺生物技术无锡有限公司