专利名称：一种药物口服吸收预测和筛选模型的建立方法
技术领域：
本发明涉及药物筛选模型领域，具体涉及药物口服吸收预测和筛选模型的建立方法，可应用于药物口服吸收的预测和筛选。
背景技术：
Caco-2 细胞(the human colon carcinoma cell line，人结肠腺癌细胞系，简称 Caco-2)来源于人结肠癌细胞，是目前公认用于预测人体肠道内药物吸收最为经典的体外模型之一。Caco-2细胞可在培养条件下自发进行上皮样分化并可以形成紧密联结，分化出绒毛面和基底面，其形态学、标志酶的功能表达、渗透特征等与小肠上皮细胞相似，因此，此种细胞可以模拟小肠上皮细胞，广泛用于药物吸收过程中物理和生化屏障的研究。
在传统的Caco-2培养模型中Caco-2能表达许多载体蛋白和多种药物代谢酶，包括P-糖蛋白(p-glycoprotein，P_gp)、CYP3A4等。传统Caco-2细胞模型的建立方法为 细胞种板后在基础培养基上培养21天，前7天隔天换液，后14天每天换液；但是该模型比较明显的缺陷是需要长达21天的培养时间，使其应用于预测药物口服吸收时的实验周期过长，不能应付现今大量先导化合物涌现后所需的高通量筛选。发明内容
本发明的目的是针对传统的Caco-2培养模型需要较长培养时间的缺陷，提供一种药物口服吸收预测和筛选模型的建立方法，最大限度地缩短细胞培养周期，提高药物口服吸收预测和筛选的效率。
本方法的原理是利用体外模型与体内吸收的相关性，进行口服药物吸收的预测。
本发明通过以下技术方案实现上述目的。
一种药物口服吸收预测和筛选模型的建立方法，包括如下步骤(1)WDMEM(Dulbecco's modified Eagle medium)为基础培养基培养 Caco-2 细胞， 基础培养基中含体积分数20%的胎牛血清、的非必需氨基酸、100 UmL-1的青霉素和 100 U-πιΓ1的链霉素；(2)种板前一天用鼠尾胶原铺板，即在Transwell板上的每个孔中加入鼠尾胶原，风干过夜；鼠尾胶原的配制方法为取IOOrnl超纯水，加入100 μ 1乙酸，高压灭菌，冷却后加入 5mg/ml鼠尾胶原anl，使用前用甲醇稀释，稀释体积比为甲醇鼠尾胶原=4:1 ；(3)当Caco-2细胞长至覆盖培养瓶瓶底的80% 90%时，胰酶消化，将Caco-2细胞接种在1TransweIl板上，Transwell板下腔加入基础培养基；(4)第2、3天每天更换基础培养基，第4、5、6天加分化培养基，分化培养基为采用上皮细胞分化基础培养基后添加MIOT制得；一共培养6天后，获得形成紧密单层的Caco-2细胞。
优选地，步骤(1)中培养Caco-2细胞是将Caco-2细胞放入培养瓶，置于培养箱内进行培养，隔天更换基础培养基；培养箱的培养条件为温度37°C，通入5% CO2，相对湿度90%。
优选地，步骤(2)中每个孔中加入上述鼠尾胶原800 μ L。
优选地，步骤(3)的接种密度为5Χ105/孔，Transwell板下腔加入基础培养基1.5mLo
其中Transwell板为一种具有0.3μπι孔径的碳酸聚酯膜，起支持Caco-2单层细胞的作用；步骤(4)中的MIOT为MIOT (BD)公司产品，是包括牛胰岛素、霍乱菌素等成分的混合物。
在药物的转运实验进行前及结束后，均用细胞电位仪测定跨上皮细胞电阻 (trans印ithelial electrical resistance, TEER)，以确定单层细胞的紧密性与完整性， 符合条件的细胞可用于实验。
本发明与现有技术相比，具有如下优势a)提高药物体外吸收的有效筛选率。本发明模型使药物经过细胞的吸收、代谢等过程后，取药进行测定，使得体外筛选的结果与整体实验数据的基本吻合；另一方面，本发明减少了细胞的培养时间，从而减少了实验中的不稳定因素，如污染等。因此该快速药物筛选模型提高了药物吸收预测和筛选的可靠性，可有效地提高药物的筛选率；b)简化了筛选程序。常规的体外Caco-2细胞筛选模型需要长达21天的培养，这大大制约了初期先导化合物体外转运和吸收筛选的效率。该发明将培养时间减少为6天，筛选速度是传统培养时间的3倍以上，简化了筛选程序，节约了大量的人力物力；c)操作方便，节约成本。对比国内外报道的筛选模型，本发明模型的经济效益较高。关于快速筛选的模型，有报道用纤维胶原铺板，但其成本较高，成本上消耗比21天培养的传统模型更甚。本发明利用了鼠尾胶原铺板，同样也能达到效果，实现了成本与效率的双赢， 在成本与效率上都比目前报道的预测模型具有优势。
图1 药物在Caco-2细胞单层模型中的转运途径，其中(I )跨细胞被动转运 (细胞通透性)；(II )细胞旁转运；(III)载体介导的转运(a:摄入，b外排)；(IV)经代谢后的转运；图2 :7天Caco-2细胞模型电阻值随着细胞培养天数的变化； 图3:荧光黄标准曲线；图4 荧光黄在Caco-2单层细模型中的透过值(均数士方差，η = 3)； 图5:普萘洛尔标准曲线；图6 普萘洛尔在Caco-2单层细模型中的透过值(均数士方差，η = 3)； 图7 :7天Caco-2细胞模型预测与体外吸收相关性分析； 图8 :21天Caco-2细胞模型预测与体外吸收相关性分析； 图9:地高辛标准曲线；图10:地高辛在21天Caco-2细胞模型中的双向转运特点； 图11 地高辛在7天Caco-2细胞模型中的双向转运特点； 图12 21天Caco-2细胞模型单层的验证(光斑为细胞核)； 图13 :7天Caco-2细胞模型单层的验证(光斑为细胞核)；图14 21天Caco-2细胞模型中由于种板密度过高出现多层细胞(光斑为细胞核)。
具体实施方式
实施例1模型的建立。
图1为Caco-2细胞模型中药物在细胞中的转运途径，本发明根据这些转运途径建立快速Caco-2细胞单层模型，即上述药物口服吸收预测和筛选模型，其建立方法具体步骤如下(1)以DMEM(Dulbecco，s modified Eagle medium)为基础培养基，基础培养基中含体积分数20%的胎牛血清、的非必需氨基酸、100 Umr1的青霉素和100 Umr1的链霉素；将Caco-2细胞培养于25 cm2卡式一次性培养瓶中，置于37°C培养箱内，通入5% CO2，相对湿度90%条件下进行培养，隔天更换基础培养基；(2)种板前一天用鼠尾胶原铺板。鼠尾胶原的配制方法为取IOOml超纯水，加入 100 μ 1乙酸，高压灭菌，冷却后加入5mg/ml鼠尾胶原(生友技术有限公司)2ml，使用前用甲醇稀释，稀释体积比为甲醇鼠尾胶原=4:1。在12孔Transwel 1板上，每孔加入SOOyL上述鼠尾胶原，风干过夜；(3)当Caco-2细胞长至覆盖培养瓶瓶底的80% 90%时，胰酶消化，将Caco-2细胞接种在12孔Transwell板上，接种密度约为5 X IO5/孔，Transwell板下腔加入基础培养基 1. 5 mL ；(4)第2、3天每天更换基础培养基，第4、5、6天加分化培养基，分化培养基为采用上皮细胞分化基础培养基后添加MIOT制得；一共培养6天后，获得形成紧密单层的Caco-2细胞。
在药物的转运实验进行前及结束后，均用细胞电位仪测定跨上皮细胞电阻，以确定单层细胞的紧密性与完整性，符合条件的细胞可用于实验。
实施例2采用几种标准的底物或标记物在实施例1建立的药物口服吸收预测和筛选模型(下面称为7天细胞模型)中进行转运实验，对细胞模型的完整性、通透性、细胞旁路转运以及 P-糖蛋白(P-gp)的表达进行验证，以及进一步形态学的考察，并将实验结果与传统的21天 Caco-2细胞模型进行比较。
一、细胞模型的完整性细胞电阻值是评价Caco-2细胞模型完整性的指标。在本研究中我们使用细胞电位仪 (EVOM)对快速Caco-2模型的电阻值进行测量在细胞种板前对Transwell板模电阻值进行测量，为空白值Ω 1，收板时测定的电阻值为最终电阻值Ω2，即Ω (TEER) = Ω 1-Ω 2
使用细胞电位仪(EVOM)对实施例1建立的快速Caco-2模型的电阻值进行测量， 结果如图2所示，细胞电阻值均大于350 Ω。根据文献报道其电阻值应在150-650 Ω之间， 均在合格范围之内。
二、细胞旁路转运荧光黄是评价Caco-2细胞模型旁路透过的经典标记物。本实验采用荧光分光光度计法测定荧光黄浓度。荧光黄激发波长为420nm，发射波长为520nm。
将20ng/mL荧光黄加于Caco-2细胞单层顶端(A面)，于池后从基底端(B面)取样进行检测。
药物表观渗透系数(Papp)根据下式计算 Papp= [(dC/dt (V) ]/(AXC0)C0为加药侧的药物初始浓度，dC/dt为在接受侧药物出现的速率，V为接受侧的溶液体积，A为Transwell多聚碳酸酯膜的表面积。
如图3所示HBSS(Hanks Balanced Salt Solutions，汉克平衡盐溶液)溶液中荧光黄的标准曲线方程为Y=157. 4Χ-26. 46，r=0. 999 (n=5)。线性范围为31. 25 2000ng/ml。 其中Y为荧光黄的吸光度值(yg/ml)，X为荧光黄浓度(yg/ML)。如图4所示可见Caco-2 细胞单层的紧密性良好，荧光黄在21天细胞模型和7天细胞模型中透过值分别0. 176和 0. 159 (10_6cm/s)，结果无统计学差异，7天细胞模型可能由于培养时间减少，不确定因素作用时间减少，方差较小。
三、细胞通透性普萘洛尔是评价Caco-2细胞通透性的经典标记物。本实验首先建立检测生物样品中普萘洛尔的HPLC方法。采用色谱柱为HypersilBDSC18(I.D. 4. 6mmX150mm，5ym)不锈钢柱(大连依利特公司生产)；流动相为25mM磷酸二氢钾缓冲液乙腈(60:40)，用磷酸调pH 至2. 5 ；流速1. Oml/min ；检测波长290nm ；进样量20 μ L ；采用维拉帕米150 μ g/mL作为内标。将100 μ mol/L荧光黄加于Caco-2细胞单层顶端(A面)，于Ih后从基底端(B面)取样进行检测。
如图5所示HBSS溶液中普萘洛尔的标准曲线方程为Y=O. 098X-0. 246, r=0. 995 (n=5)。线性范围为1 200 μ mol/L。结果如图6所示可见Caco-2细胞单层的通透性良好，普萘洛尔在21天细胞模型和7天细胞模型中透过值分别为31. 36和32. 44( 10_6cm/ s)，结果无统计学差异，与荧光黄透过值一致，7天细胞模型中普萘洛尔透过值方差较小。
四、人体口服吸收利用度与药物在细胞中透过值的相关性分析根据药物在Caco-2细胞模型中的透过结果，结合已报道药物在人体口服吸收利用度， 进行相关性分析。
由相关性分析图7、图8所示，普萘洛尔与荧光黄在Caco-2细胞单层中的透过值和人体口服吸收利用度相关性良好。而且7天细胞模型与21天细胞模型的的预测结果几乎一致，结果如表1，表2所示。
表1 荧光黄体内外相关性分析m I^e I Ammmm F—iXiOWO Μ A ni i it) ^RII“卜… 01W天 Cl IM ■!■■ 0 OW 0表2 普萘洛尔体内外相关性分析
权利要求
1.一种药物口服吸收预测和筛选模型的建立方法，其特征在于包括如下步骤(1)以DMEM为基础培养基培养Caco-2细胞，基础培养基中含体积分数20%的胎牛血清、的非必需氨基酸、100 U-πιΓ1的青霉素和100 U-πιΓ1的链霉素；(2)种板前一天用鼠尾胶原铺板，即在Transwell板上的每个孔中加入鼠尾胶原，风干过夜；鼠尾胶原的配制方法为取IOOml超纯水，加入100 μ 1乙酸，高压灭菌，冷却后加入 5mg/ml鼠尾胶原anl，使用前用甲醇稀释，稀释体积比为甲醇鼠尾胶原=4:1 ；(3)当Caco-2细胞长至覆盖培养瓶瓶底的80% 90%时，胰酶消化，将Caco-2细胞接种在1TransweIl板上，Transwell板下腔加入基础培养基；(4)第2、3天每天更换基础培养基，第4、5、6天加分化培养基，分化培养基为采用上皮细胞分化基础培养基后添加MIOT制得；一共培养6天后，获得形成紧密单层的Caco-2细胞。
2.如权利要求1所述的药物口服吸收预测和筛选模型的建立方法，其特征在于步骤(1)中培养Caco-2细胞是将Caco-2细胞放入培养瓶，置于培养箱内进行培养，隔天更换基础培养基；培养箱的培养条件为温度37°C，通入5% CO2，相对湿度90%。
3.如权利要求1所述的药物口服吸收预测和筛选模型的建立方法，其特征在于步骤(2)中每个孔中加入鼠尾胶原800μ L。
4.如权利要求1所述的药物口服吸收预测和筛选模型的建立方法，其特征在于步骤(3)的接种密度为5ΧIO5/孔。
5.如权利要求1所述的药物口服吸收预测和筛选模型的建立方法，其特征在于步骤 (3) Transwell板下腔加入基础培养基1. 5 mL。
全文摘要
本发明涉及一种药物口服吸收预测和筛选模型的建立方法，是在前期已建立的21天Caco-2细胞模型预测化合物吸收的基础上，进一步建立、优化和验证7天Caco-2细胞模型预测方法，并对该模型的检测指标及细胞形态学进行优化和验证，以得到最适合的药物口服吸收高通量筛选的Caco-2细胞模型。本发明能大大减少细胞模型培养的时间，而减少培养时间能大大降低细胞在21天长期培养中出现污染的可能性，减少劳动强度，以应对现今出现的大量先导化合物的口服吸收预测和筛选。
文档编号C12Q1/02GK102533927SQ20121002314
公开日2012年7月4日 申请日期2012年2月2日 优先权日2012年2月2日
发明者毕惠嫦, 胡晋卿, 蔡伊科, 蔡大可, 黄民 申请人:中山大学