一种筛选ccr4拮抗剂的细胞模型及筛选方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于药物和细胞生物学领域，涉及一种CCR4拮抗剂的高通量筛选细胞模 型及其建立方法与应用，特别涉及基于CCR4的高内涵筛选CCR4拮抗剂细胞模型及其建立 方法与应用。
【背景技术】
[0002] 药物筛选模型是药物研发必不可少的药物活性研究平台。高内涵分析技术能在 保持细胞结构和功能完整性的前提下，同时检测被测样品对细胞形态、生长、分化、迁移、凋 亡、代谢途径及信号转导各个环节的影响，在获得生物活性信息的同时能够观察的测试样 品相关的毒性信息。因此，引入高内涵筛选技术是创新药物筛选研究的趋势。
[0003]CCR4(chemokinereceptor4，CCR4)是一种由CCR4基因编码的G蛋白偶联受体， 属于CC类趋化因子受体（CCR)家族成员之一。据报道，CCR4在变应原引发的Th2细胞的募 集，归巢和活化过程中起着重要作用。Th2细胞可分泌多种细胞因子如IL-4、IL-5和IL-13， 刺激炎症细胞的活化，进而影响多种过敏性疾病的发生和发展，如过敏性气道疾病（哮喘、 过敏性鼻炎）。CCR4拮抗剂能够抑制CCR4与配体的结合，阻断受体介导的细胞信号通路，因 此，靶向CCR4发展抗过敏性鼻炎等过敏性疾病的治疗药物，已成为新药研发的重要方向。
[0004] 目前，CCR4拮抗剂的高通量筛选方法主要有基于特定人工细胞的细胞钙 流测定，包括CCR4-HEK_Gqi5 细胞系（Andrews,G.，C.Jones,andK.A.Wreggett,An IntracellularAllostericSiteforaSpecificClassofAntagonistsoftheCCChemokine GProtein-CoupledReceptorsCCR4andCCR5.MolecularPharmacology, 2007. 73(3):p. 855-867)、CCR4-CH0-Gqi5a细胞系（YasuhiroNAKAGAMI,a,etal.，RS-1748,aNovelCC ChemokineReceptor4Antagonist,InhibitsOvalbumin-InducedAirwayInflammation inGuineaPigs.Biol.Pharm.Bull.，2010. 33(6) :p. 1067-1069)、CCR4-CH0-Gal6 细胞 系(DouglasF.Burdi,S.C. ,KarenMattia,CelesteHarrington,ZhanShi, ,etal. ,Small moleculeantagonistsoftheCCchemokinereceptor4(CCR4).Bioorganic&Medicinal ChemistryLetters2007. 17:p. 3141 - 3145)。虽然钙流检测在CCR4拮抗剂的筛选中应用非 常广泛，但该模型是将人工修饰的复合式/嵌合式Gai/q导入CCR4表达细胞，使CCR4由 Gai介导信号通路转变为Gaq介导的调控胞内钙流的信号通路。
[0005]还有基于CCR4-CH0 细胞系（YasuhiroNAKAGAMI,a,etal·，RS-1748,aNovelCC ChemokineReceptor4Antagonist,InhibitsOvalbumin-InducedAirwayInflammationin GuineaPigs.Biol.Pharm.Bull. ,2010. 33 (6) :p. 1067-1069)的[35S]GTPyS结合试验。但 是，该分析方法需要特定的过滤装置和步骤来分离游离的和结合的[35S]GTPγS，这就限制 了该分析方法的通量，此外，值得注意的是，该分析方法涉及放射性物质，安全性较低，不是 未来发展的方向。
[0006] 通过cAMP分析筛选G as偶联受体的激动剂或拮抗剂通常是很容易的，而筛选如 CCR4样的Gai偶联受体的配基，特别是拮抗剂却比较困难。不拘于理论的限制，原因之一 在于需要用forskolin(福司柯林，腺苷酸环化酶的直接激活剂）预刺激AC的活化，然后使 用受体激动剂（TARC或者MDC)抑制被forskolin激活的AC，然后才能检测拮抗剂产生的与 激动剂相反的作用，需要较多的优化步骤，且测试窗口比较小。
[0007]此外，还有CCR4_HEk293 细胞系（Qi，H.，etal.，Anantagonistfor CCR4alleviatesmurineallergicrhinitisbyintranasaladministration.IntArch AllergyImmunol,2012.159 (3):p. 297-305)Hut78 细胞系（Sato,T.，etal.，Inhibitory effectoftheneworallyactiveCCR4antagonistK327onCCR4+CD4+Tcellmigration intothelungofmicewithovalbumin-inducedlungallergicinflammation.Pharmacolo gy，2009. 84(3) :p. 171-82)的细胞趋化实验，但该种方法操作繁复，不适合高通量。
[0008] 因此，亟需开发新的能够高效筛选CCR4拮抗剂的模型。
【发明内容】
[0009] 本发明人经过深入的研究和创造性的劳动，建立了一种能够稳定表达CCR4-EGFP 融合蛋白的细胞，以及一种基于CCR4-EGFP融合蛋白的绿色荧光颗粒的形成来检测CCR4受 到激活或抑制（拮抗）的方法，可用于高通量、高内涵的药物（CCR4拮抗剂）筛选，并能够 通过细胞核数量、形态的分析，鉴别化合物因毒性产生的对受体的非特异性影响，确保筛选 出的拮抗剂具有受体的特异性作用。由此提供了下述发明：
[0010] 本发明的一个方面涉及一种细胞，其同时表达CCR4蛋白和报告基因蛋白。
[0011] 根据本发明任一项所述的细胞，其特征在于如下的（1) 一（3)项中的任意一项或 者多项：
[0012] ⑴所述CCR4为人源；具体地，所述CCR4蛋白的序列为SEQIDN0 :1 ;
[0013] (2)所述报告基因蛋白为EGFP蛋白；具体地，所述EGFP蛋白的序列为SEQIDNO: 3 ；
[0014] (3)所述细胞为人源细胞，具体地，为体外培养的人源细胞；具体地，为人骨瘤细 胞；更具体地，为人骨肉瘤U20S细胞。
[0015] 在本发明的一个实施方案中，CCR4蛋白的序列如下（360aa):
[0017] CCR4蛋白的编码序列如下（1083bp):
[0019]本发明中，EGFP(enhancedgreenfluorescentprotein，EGFP)蛋白是增强型绿色 荧光蛋白，属于一种报告基因蛋白。
[0020] EGFP的蛋白序列如下（239aa):
[0022] EGFP的编码基因序列如下（720bp):
[0024] 在宿主细胞选择上，本发明人曾尝试了多种G蛋白偶联受体常用的表达细胞，例 如HEK293XH0和U20S，但均未能获得稳定表达CCR4-EGFP融合蛋白的HEK293XH0细胞克 隆（实验数据和照片未保留），最终选择U20S作为母细胞。不拘于理论的限制，该细胞为 人源细胞系，相对CH0具有更完善的下游信号通路，受体可正常激活；贴壁细胞相对HEK293 更易操作，细胞较大有利于高内涵成像和分析，转染效率相对较高，适合脂质体转染；表达 报告基因EGFP较强，荧光成像更灵敏。
[0025] 在表达条件优化方面，由于构建的CCR4-EGFP融合蛋白为组成型表达，因此可利 用流式细胞分选方法提高阳性克隆数。同时在CCR4细胞筛选模型的建立过程中，本发明人 发现CCR4基因相对不稳定，在细胞传代过程中容易出现不表达甚至基因丢失的现象，对表 达条件要求比较苛刻。因此本发明人通过保持抗生素筛选压力和亚克隆筛选稳定表达株的 方法成功建立了本发明。
[0026] 根据本发明任一项所述的细胞，其中，所述CCR4蛋白和报告基因蛋白以融合蛋白 形式表达。可选地，CCR4蛋白和报告基因蛋白之间还有连接序列。所述连接序列不影响 CCR4蛋白和报告基因蛋白的融合蛋白的表达。
[0027]CCR4的C端与EGFP连接并融合表达（本发明中表示为CCR4-EGFP融合蛋白，而不 表示为EGFP-CCR4,目的是避免被认为CCR4是以其N端与EGFP连接）。
[0028] 本发明人还通过研究发现，EGFP与CCR4的N端融合表达是不可以的。不拘于理 论的限制，CCR4受体是7次跨膜蛋白，N端在膜外，连接EGFP后会影响受体与配基的结合。
[0029] 在本发明的一个实施方案中，CCR4的C末端与EGFP连接时中间还有限制性内切 酶位点序列，对应氨基酸序列为VDDI(SEQIDNO:5)。
[0030] 在本发明的一个实施方案中，编码上述限制性内切酶位点序列的碱基序列为 GTCGACGATATC(SEQIDNO:6)。其包含Sail和EcoRV限制性内切酶作用位点，使CCR4和EGFP 的基因形成粘末端，并实现连接。该碱基序列也可选择与表达载体适合的其它限制性内切 酶的位点序列（这也会导致CCR4的C末端与EGFP之间为其它的氨基酸序列），如Xhol切 点CTCGAG(对应氨基酸序列LE)、EcoRI切点GAATTC(对应氨基酸序列EF)以及Xbal切点 TCTAGA(对应氨基酸序列SR)。
[0031] 根据本发明任一项所述的细胞，其中，所述融合蛋白为CCR4-EGFP融合蛋白；具体 地，所述CCR4-EGFP融合蛋白的序列为SEQIDN0 :7,603aa，下划线部分为连接序列，如下：
[0033] 其编码序列SEQIDN0 :8,1812bp，下划线部分为连接序列的编码序列，如下：
[0035] 本发明建立了一种以CCR4为靶标的高效、可靠筛选CCR4拮抗剂的细胞或细胞模 型。本发明通过对CCR4激活所引起的与之相融合的EGFP的改变来分析CCR4的激活水平。 根据本发明的构思，将人CCR4与EGFP的融合蛋白稳定表达在人骨肉瘤细胞中，筛选、优化 建立得到所述细胞系。
[0036]目前已有的CCR4激动剂或拮抗剂筛选模型尚无本发明方法的细胞模型。该模型 是基于高内涵分析技术的筛选模型，而高内涵筛选平台属于新技术，普及程度有限，它要求 细胞模型具有较高的重复性和稳定性，并具有较好的实验窗口，即Z'因子符合需求；而血 清或培养