一种矽肺细胞模型的制备方法
【专利摘要】本发明属于医学领域，提供了从分子水平制备矽肺细胞模型的一种简单且能准确代表体内肺纤维化的方法，具体为：对培养至处于静止期的肺泡巨噬细胞使用矽尘刺激，24h后收集上清液，过滤除菌；在培养至处于静止期的肺腺癌细胞A549中加入矽尘及肺泡巨噬细胞上清液，于二者共同孵育肺上皮细胞，完成了矽肺细胞模型的建立。
【专利说明】一种矽肺细胞模型的制备方法
[0001]【技术领域】
本发明涉及一种矽肺细胞模型的制备方法，属医学领域。
[0002]技术背景
矽肺是长期吸入含二氧化硅粉尘引起的以间质性肺纤维化为主的一种慢性不可逆性疾病，其基本病理特征是肺上皮细胞迁移，间质细胞增殖、激活和细胞外基质的沉积。矽肺是中国最严重、发病最多的职业病，其发病机制尚未完全清楚，因此制备体外细胞模型，从细胞和分子水平进一步探索矽肺的发病机制，尤其是研究细胞因子和信号传导网络系统，对其治疗的突破至关重要。
[0003]目前在矽肺细胞模型领域中，无准确统一的制备方法，矽肺纤维化过程中，肺上皮细胞是主要的靶细胞，研究人员通常以矽尘直接刺激肺上皮细胞，使上皮细胞受损，细胞外基质和基层粘连蛋白如IV型胶原蛋白、纤维黏连蛋白(FN)等立即修补并覆盖受损伤口，使上皮细胞表型发生转变，表达间质细胞特性，促进了纤维组织的生成，是以肺上皮细胞为主模拟肺纤维化病理过程的主要方法，然而机体在吸入二氧化硅粉尘后，也可间接刺激肺泡巨噬细胞，释放大量炎性细胞因子和致纤维化因子，促进肺泡炎症反应，逐渐转化为肺间质纤维化。以上方法操作简单，但是与体内肺纤维化的发病过程有一定的距离，单用一种细胞制备矽肺体外细胞模型均不能准确有效的反应出二氧化硅粉尘进入体内后的一系列反应，从而影响后续的药物干预实验，准确性差。
【发明内容】
[0004]本发明的目的是提供一种从分子水平制备矽肺细胞模型的一种简单且能准确代表体内肺纤维化的方法。
`[0005]为实现以上目的，本发明一种矽肺细胞模型的制备方法为:对培养至处于静止期的肺泡巨噬细胞使用矽尘刺激，24h后收集上清液，过滤除菌；在培养至处于静止期的肺腺癌细胞A549中加入矽尘及肺泡巨噬细胞上清液，于二者共同孵育肺上皮细胞，完成了矽肺细胞模型的建立。
[0006]进一步的，所述肺泡巨噬细胞上清液与肺腺癌细胞的体积比为1:1-3 ;优选的体积比为1:2。
[0007]进一步的，使用浓度为50ug/ml的矽尘刺激肺泡巨噬细胞。
[0008]进一步的，所述肺泡巨噬细胞用含体积浓度为20%胎牛血清的F12K培养液，呈悬浮生长，生长缓慢，每周传代I次，置于37°C及体积浓度为5%C02的培养箱中；收集对数生长期的肺泡巨噬细胞，细胞密度达80%-85%，离心，弃大部分旧培养液，用无血清培养液调整细胞密度为IX 106/ml，接种于24孔板内，每孔0.8ml，继续培养24h使其同步化处于静止期
进一步的，所述A549细胞用含10%胎牛血清的DMEM培养液，呈贴壁生长，每周传代3次，用体积浓度为0.25%胰蛋白酶消化，置于37°C及体积浓度为5%C02的培养箱中；待培养A549细胞融合至80%-85%时，取体积浓度为0.25%的胰酶消化后，用无血清培养液调整细胞密度为IX 106/ml，接种于6孔培养板内，每孔2ml，继续培养24h使其同步化处于静止期。[0009]进一步的，所述矽尘为纯度为99%的二氧化硅结晶型标准品，粒子直径在
0.5-10um之间，其中在l-5um之间的占80%;所述矽尘于180°C下干烤6 h灭菌，用无血清培养液DMEM配成浓度为3g/L的母液，于4°C储存。
[0010]本发明产生的有益效果为，本发明使用两种细胞制备矽肺体外细胞模型，可以准确有效的反应出二氧化硅粉尘进入体内后的一系列反应，不会影响后续的药物干预实验，准确性强，有助于对矽肺的突破性治疗。
【具体实施方式】
[0011]本发明的矽肺细胞模型的制备方法具体为:
1.细胞制备:
以肺腺癌细胞A549替代肺上皮细胞，其细胞性状、功能、表达特点等与II型肺泡上皮细胞一致，优点是细胞易于获取和培养；
肺泡巨噬细胞株购自细胞库。
[0012]2.细胞培养:
肺腺癌细胞A549用含体积浓度为10%胎牛血清的DMEM培养液，呈贴壁生长，每周传代3次，需用体积浓度为0.25%胰蛋白酶消化，置于37°C及体积浓度为5%C02的培养箱中；
肺泡巨噬细胞用含体积浓度 为20%胎牛血清的F12K培养液，呈悬浮生长，生长缓慢，每周传代I次，换液时保留部分旧培养液，以利于细胞生长，置于37°C及体积浓度为5%C02的培养箱中。
[0013]3.矽尘的制备:
所述矽尘为二氧化硅结晶型标准品，纯度为99%，粒子直径在0.5-10um之间，其中在l-5um之间的占80% ；
将矽尘于180°C干烤6 h灭菌，用无血清培养液DMEM配成浓度为3g/L的母液，4°C储存备用。
[0014]4.矽肺细胞模型的制备:
收集对数生长期的肺泡巨噬细胞，光学显微镜下观察，细胞密度达80%-85%，离心，弃大部分旧培养液，用无血清培养液调整细胞密度为IX 106/ml，接种于24孔板内，每孔0.8ml,继续培养24h使其同步化处于静止期；用浓度为50ug/ml的矽尘刺激肺泡巨噬细胞，24h后肺泡巨噬细胞中分泌TGF-β 1、EGF、TNF-a、IL等因子，收集上清液，用ELISA法检测上清液中各因子分泌较高，用0.22um滤膜过滤除菌，_80°C保存备用。
[0015]待培养A549细胞融合至80%_85%时，取体积浓度为体积浓度为0.25%的胰酶消化后，用无血清培养液调整细胞密度为lX106/ml，接种于6孔培养板内，每孔2ml，继续培养24h使其同步化处于静止期；根据需要使用不同浓度的矽尘分别刺激A549，同时每孔加入Iml的肺泡巨噬细胞上清液，于矽尘及肺泡巨噬细胞上清液的刺激下共同孵育肺上皮细胞(即肺腺癌细胞)，完成了矽肺细胞模型的建立，作用不同时间后倒置相差显微镜观察细胞形态学的改变，并提取RNA或蛋白。
【权利要求】
1.一种矽肺细胞模型的制备方法，其特征在于:对培养至处于静止期的肺泡巨噬细胞使用矽尘刺激，24h后收集上清液，过滤除菌；在培养至处于静止期的肺腺癌细胞A549中加入矽尘及肺泡巨噬细胞上清液，于二者共同孵育肺上皮细胞，完成了矽肺细胞模型的建立。
2.如权利要求1所述的一种矽肺细胞模型的制备方法，其特征在于:所述肺泡巨噬细胞上清液与肺腺癌细胞的体积比为1:1-3。
3.如权利要求2所述的一种矽肺细胞模型的制备方法，其特征在于:所述肺泡巨噬细胞上清液与肺腺癌细胞的体积比为1:2。
4.如权利要求1所述的一种矽肺细胞模型的制备方法，其特征在于:使用浓度为50ug/ml的矽尘刺激肺泡巨噬细胞。
5.如权利要求1或3所述的一种矽肺细胞模型的制备方法，其特征在于:所述肺泡巨噬细胞用含体积浓度为20%胎牛血清的F12K培养液，呈悬浮生长，生长缓慢，每周传代I次，置于37°C及体积浓度为5%C02的培养箱中。
6.如权利要求5所述的一种矽肺细胞模型的制备方法，其特征在于:收集对数生长期的肺泡巨噬细胞，细胞密度达80%-85%，离心，弃大部分旧培养液，用无血清培养液调整细胞密度为IX 10%1，接种于24孔板内，每孔0.8ml，继续培养24h使其同步化处于静止期。
7.如权利要求1或3所述的一种矽肺细胞模型的制备方法，其特征在于:所述A549细胞用含体积浓度为10%胎牛血清的DMEM培养液，呈贴壁生长，每周传代3次，用体积浓度为0.25%胰蛋白酶消化，置于37°C及体积浓度为5%C02的培养箱中。
8.如权利要求7所述的·一种矽肺细胞模型的制备方法，其特征在于:待培养A549细胞融合至80%-85%时，取体积浓度为0.25%的胰酶消化后，用无血清培养液调整细胞密度为I X 106/ml，接种于6孔培养板内，每孔2ml，继续培养24h使其同步化处于静止期。
9.如权利要求1或3所述的一种矽肺细胞模型的制备方法，其特征在于:所述矽尘为纯度为99%的二氧化硅结晶型标准品，粒子直径在0.5-10um之间，其中在l_5um之间的占80% ;所述矽尘于180°C下干烤6 h灭菌，用无血清培养液DMEM配成浓度为3g/L的母液，于4°C储存。
【文档编号】C12N5/09GK103820389SQ201410065086
【公开日】2014年5月28日 申请日期:2014年2月26日 优先权日:2014年2月26日
【发明者】张春玲, 张华 , 张弘 申请人:青岛市中心医院