专利名称：一种生物杀虫剂筛选模型及其制备方法和应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及农药领域，具体涉及利用基因工程方法对生物杀虫剂进行大规模筛选的方法。
背景技术：
随着全球自然环境变化以及人类活动的影响，虫媒病的传播有加重的趋势。目前卫生害虫的防治主要使用化学杀灭的方法，化学杀虫剂虽然对卫生害虫和水生生物毒性较大，但是对哺乳动物也有伤害，而且卫生害虫容易对化学杀虫剂产生抗药性。
昆虫生长调节剂是近20年发展起来的生物杀虫剂，对环境和人畜安全，防治效果好，还可以防止昆虫产生抗药性，可达到长期控制的目的，因而应用前景十分广阔。但是，目前昆虫生长调节剂的筛选通常以整个虫体为对象进行筛选，这种筛选方法筛选信号弱，灵敏度低，作用靶点和机理不明，大大影响了筛选效率。因此，需要研究一种可以大规模筛选的有效方法。
发明内容
由于昆虫的生长发育是通过定期的蜕皮实现的，蜕皮过程是在甾醇、保幼素、20-羟基蜕皮激素(20-hydroxyecdysone，20E)等几种昆虫激素的调节下完成的。20E的受体是一种核酸受体，由蜕皮激素受体(ecdysteriod receptor，EcR)及哺乳动物类维生素AX受体类似物超螺旋蛋白(Ultraspiracleprotein，USP)组成，前者为前导DNA结合位点，后者为配体结合位点。只有在EcR及USP结合形成二聚体时，EcR-USP二聚体才能与位于蜕皮激素可诱导基因启动子区的蜕皮激素响应元件(Ecdysone responseelement，EcRE)相结合而启动早期基因的转录。对这种激素依赖性的生化代谢步骤的任何干扰，都可导致靶昆虫生长发育异常甚至死亡。
因此，本发明的目的是提供一种生物杀虫剂筛选模型，该模型具有筛选信号强，灵敏度高，作用靶点和机理明确，筛选效率高的优点。
本发明实现上述目的的技术方案是一种生物杀虫剂筛选模型，该模型是染色体上整合有以下外源基因序列的巴斯德毕赤酵母(1)核苷酸序列如SEQ ID NO.1所述的基因片段；(2)核苷酸序列如SEQ ID NO.2所述的基因片段(3)核苷酸序列为SEQ ID NO.3所述的基因片段。
本发明所述的一种生物杀虫剂筛选模型，其中SEQ ID NO.1是能在巴斯德毕赤酵母中组成型表达白纹伊蚊(A.albopictus)蜕皮激素受体EcR的基因表达盒GAP Promoter-EcR-AOXl TT，其碱基序列为agatcttttt tgtagaaatg tcttggtgtc ctcgtccaat caggtagcca tctctgaaat 60atctggctcc gttgcaactc cgaacgacct gctggcaacg taaaattctc cggggtaaaa120cttaaatgtg gagtaatgga accagaaacg tctcttccct tctctctcct tccaccgccc180gttaccgtcc ctaggaaatt ttactctgct ggagagcttc ttctacggcc cccttgcagc240
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本发明所述的一种生物杀虫剂筛选模型，其中SEQ ID NO.2是能在巴斯德毕赤酵母中组成型表达超螺旋蛋白USP的基因表达盒TEF1 Promoter-USP-CYC1 TT，其碱基序列是cccacacacc atagcttcaa aatgtttcta ctcctttttt actcttccag attttctcgg 60actccgcgca tcgccgtacc acttcaaaac acccaagcac agcatactaa attttccctc 120tttcttcctc tagggtgtcg ttaattaccc gtactaaagg tttggaaaag aaaaaagaga 180ccgcctcgtt tctttttctt cgtcgaaaaa ggcaataaaa atttttatca cgtttctttt 240tcttgaaatt ttttttttta gtttttttct ctttcagtga cctccattga tatttaagtt 300aataaacggt cttcaatttc tcaagtttca gtttcatttt tcttgttcta ttacaacttt 360ttttacttct tgttcattag aaagaaagca tagcaatcta atctaagggc ggaattatcg 420gatcccgaat tatcggatcc catgctgaag aaggaaaaac caatgctgtc tgttgctgct 480atcatccagg ctcagggaag atgggataga acattgcctc tggcaggatt ggcaggtttc 540gatgccgcct tggttggtca catgggtcca ctgtctccac aggacatgaa acctgatttg 600aaaccagaca tatctttgct gaatggttct gtgggtccat tttctcttag acacaactgt 660ggtccagcct ctccaggtgc tttcaaccag caggtcgctg cagcccctca acagcaacag 720cagaatgtca acaactcttt gaactctcag cagcaaaatt ccggtggagg tggaggtgga 780ggtacaccaa ctaccccaac caacatgtct caacagtacc caccaaatca tccattgtct 840ggttccaagc atctgtgttc tatctgtggt gatagagcct ctggaaagca ttacggtgtt 900tattcttgtg aaggatgtaa aggatttttc aagagaactg ttagaaaaga cttgtcctat 960gcctgtagag aggacaagaa ctgtactata gacaaaagac aaagaaacag atgtctgtac1020tgtagatacc agaaatgttt ggcctgtggt atgaagagag aagccgtcca ggaggagaga1080caaagatctt ccaagttttc cattaagtct gaagagatca actctacctc ttccgtgaga1140gacgtgacca tcgagagaat cactgctgct gaacagttgt ctgaacagaa atctggtgat1200aatgctatcc catacttgag agtcggatcc aactctatga ttcctccaga atataaggga1260gccgtttctc acctttgtca gatggtgaac aaacaaatct accagctgat agactttgcc1320agaagattgc cacactttac caacttgcat agagacgacc aggtcatgct gctgagatgt1380ggttggaacg agatgttgat cgctgccgtc gcctggagat ctatggagta catcgaaact1440gaaagatccc cagatggttc cagaatatct attagacagc cacaactgat gtgtttagga1500ccaaatttta ccctgcacag aaactctgcc cagcaggctg gagttgacac tctgttcgat1560agaatcctgt gtgagttggg aatcaaaatg aaaagactgg atgtgaccag agctgagctt1620ggagttctca aagctatcat actgttcaat ccagacatta gaggacttaa gtgtcagaat1680ggagacgacg gaatgagaga gaaaatctac gcctgtttgg acgaacattg taaacaacag1740catccatctg aggatggtag attcgctcag cttttgctga gattaccagc cctgagatct1800atctctctca agtgtctcga tcacctgaac tttataagat tgctctctga taaacatttg1860gacaatttta tcatcgagat gctcgatatg ccaatgtaat ctagacacgt ccgacggcgg1920cccacgggtc ccaggcctcg gagatccgtc ccccttttcc tttgtcgata tcatgtaatt1980agttatgtca cgcttacatt cacgccctcc ccccacatcc gctctaaccg aaaaggaagg2040agttagacaa cctgaagtct aggtccctat ttattttttt atagttatgt tagtattaag2100aacgttattt atatttcaaa tttttctttt ttttctgtac agacgcgtgt acgcatgtaa2160cattatactg aaaaccttgc ttgagaaggt tttgggacgc tcgaaggctt taatttgcaa2220gct 2223本发明所述的一种生物杀虫剂筛选模型，其中SEQ ID NO.3是5×EcRE-HSP27 Promoter-GFP DNA片段，由果蝇蜕皮激素受体响应原件5次重复序列(5×EcRE)、果蝇热休克蛋白(HSP27)基因启动子序列、绿色荧光蛋白(GFP)基因序列按上述顺序串联组成，其碱基序列是cgacaagggt tcaatgcact tgtcgacaag ggttcaatgc acttgtcgac aagggttcaa60
tgcacttgtc accggtcaat gaaaatacaa gctctgttgc actctgaaaa gacagctttt 120aaaagcgcga taagagaaga aaatgtttta aataaataca tacatacatg tacatatgta 180tgtactgcat cttaactgtt cgttttgctt tttattcgca aagagaaact cccagaaaag 240aaatgtcaag aagtttctgg ttctttctcc ctctctctat gaaaagccgg ctgtgctaga 300aagagccagt agatgcgaga gaaaactgtt tgttgaatta cggggcgtat tcaaaggggc 360ttttaaatgt cgcttaaatt ttaagtttga caggctaata attgcttgcc tatatctaaa 420tattattata tttgcattag gggatcatag ggaaaacctt ctctgcaggc aaaatctaac 480gaagatggca accccccatc attttattaa agttccgtcc ctggttgcca tgcactagtg 540tgtgtgagcc cagcgtcagt ataaaagccg gcgtcaacgt cgcccgagca cagtctaaac 600tgaaaaattg aaggcaaacg ttgaagcaaa cttcgctaaa aaaattcgaa aaagcaaaaa 660aaattccttt gtctagacag ggttgtgaat aaagagaaaa aaaatcaaaa ccatggggat 720ccaccggtcg ccaccatggt gagcaagggc gaggagctgt tcaccggggt ggtgcccatc 780ctggtcgagc tggacggcga cgtaaacggc cacaagttca gcgtgtccgg cgagggcgag 840ggcgatgcca cctacggcaa gctgaccctg aagttcatct gcaccaccgg caagctgccc 900gtgccctggc ccaccctcgt gaccaccctg acctacggcg tgcagtgctt cagccgctac 960cccgaccaca tgaagcagca cgacttcttc aagtccgcca tgcccgaagg ctacgtccag1020gagcgcacca tcttcttcaa ggacgacggc aactacaaga cccgcgccga ggtgaagttc1080gagggcgaca ccctggtgaa ccgcatcgag ctgaagggca tcgacttcaa ggaggacggc1140aacatcctgg ggcacaagct ggagtacaac tacaacagcc acaacgtcta tatcatggcc1200gacaagcaga agaacggcat caaggtgaac ttcaagatcc gccacaacat cgaggacggc1260agcgtgcagc tcgccgacca ctaccagcag aacaccccca tcggcgacgg ccccgtgctg1340ctgcccgaca accactacct gagcaccca 1369本发明所述的一种生物杀虫剂筛选模型的作用机理是在改造后的巴斯德毕赤酵母内表达EcR及USP，形成EcR-USP二聚体，作用于EcRF，启动HSP27 promoter后使GFP表达，使巴斯德毕赤酵母呈现绿色荧光；本发明所述的生物杀虫剂筛选模型筛选出的药物可以影响EcR或USP的表达、EcR-USP二聚体的形成和EcR-USP二聚体与EcRE结合的途径，导致GFP表达发生改变(表现为发荧光的酵母所发出的荧光强度改变或使荧光酵母数目的增减)，即说明该药物能够改变EcR-USP二聚体形成并与EcRE结合的效率，从而影响所控制基因的表达，是一种有效的生物杀虫剂。
本发明所述的一种生物杀虫剂筛选模型的制备方法，其构建策略见图1，由以下步骤组成(1)人工合成白纹伊蚊EcR及USP的编码序列，以双表达盒形式插入到pGAPZ质粒，得到pGAPZ重组质粒载体，其结构如图1(A)所示；(2)将pGAPZ重组质粒载体上的EcR表达盒和USP表达盒通过同源重组整合到巴斯德毕赤酵母的染色体上，得到酵母A；(3)将果蝇蜕皮激素受体响应原件5次重复序列，依次接上受其调控的HSP27启动子和GFP基因，构建出5×EcRE-HSP27 Promoter-GFP DNA片段，然后将该DNA片段插入pPIC3.5K质粒，得到pPIC3.5K重组质粒载体，其结构如图1(B)所示；(4)将pPIC3.5K重组质粒载体上的5×EcRE-HSP27 Promoter-GFP DNA片段通过同源重组整合到酵母A的染色体上，得到酵母B，即本发明所述的的生物杀虫剂筛选模型。
本发明所述的生物杀虫剂筛选模型用于筛选生物杀虫药物的方法，具体步骤如下(1)本发明所述的生物杀虫剂筛选模型在YPD培养基中于28～30℃，250rpm培养至菌液浓度为OD600＝0.1～0.2，平均分装于试管中，再按100μl药物/ml菌液加入待筛选药物，同时设加入等量溶解该药物的溶剂的菌液为对照组，置于28℃～30℃、250～260rpm的条件下培养至菌液浓度为OD600＝0.8～1；(2)吸取步骤(1)所得到的菌液观察，选出可以使GFP表达量改变的药物即可。
采用本发明筛选生物杀虫药物的方法得到药物是否为生物杀虫药物有以下两种判断方法1、吸取菌液用荧光显微镜观察，能使发荧光的巴斯德毕赤酵母的荧光强度改变或使发荧光的巴斯德毕赤酵母数目增减的药物即为目标筛选物，否则为非目标筛选物；2、通过半定量RT-PCR法检测施加药物组及对照组酵母模型的GFP基因转录效率来判断待筛选药物是否为目标筛选物，具体方法为提取出步骤(2)所得的巴斯德毕赤酵母的总RNA，再反转录合成cDNA作为扩增的模板，然后设计可以扩增GFP基因的引物和可以扩增巴斯德毕赤酵母染色体上能稳定转录的基因片段的引物，如巴斯德毕赤酵母的管家基因Actin-1，进行半定量RT-PCR，扩增产物包括GFP基因和巴斯德毕赤酵母染色体上能稳定转录的基因片段，最后以巴斯德毕赤酵母染色体上能稳定转录的基因片段为内参，检验GFP基因的转录效率，通过凝胶成像扫描系统扫描各条带的灰度，求出GFP基因片段与内参灰度的比值，该比值施药前后有显著变化，则该药物即为目标筛选物，否则为非目标筛选物。
由于本发明所述的生物杀虫剂筛选模型能筛选出影响EcR或USP的表达、EcR-USP二聚体的形成、EcR-USP二聚体与EcRE结合的途径的药物，这些药物可导致昆虫发育受影响甚至于死亡，因此本发明所述的生物杀虫剂筛选模型可用于生物杀虫药物的快速、大规模筛选，本发明还具有筛选信号强，灵敏度高，作用机理明确的优点。
图1是本发明所述的一种生物杀虫剂筛选模型的构建策略图，其中(A)图是pGAPZ重组质粒载体的结构示意图，(B)图是pPIC3.5K重组质粒载体的结构示意图；图2是筛选例中空白对照组酵母模型显微镜下明视野(10×20)图；图3是筛选例中空白对照组酵母模型荧光显微镜视野(10×20)图；图4是筛选例中施药组的酵母模型显微镜下明视野(10×20)图；图5是筛选例中施药组的酵母模型荧光显微镜视野(10×20)图；图6是筛选例中施药组模型酵母与空白组模型酵母的的半定量RT-PCR结果Lane 1是施药组的扩增结果，Lane 2是空白组的扩增结果，M是100bp DNA标志物。
具体实施例方式
制备例一、材料1、EcR序列(Genbank IDAF210733)、USP序列(Genbank IDAF210734)换上毕赤酵母偏爱的密码子，果蝇蜕皮激素受体的响应元件5次重复序列，5×EcRE(采用果蝇HSP27启动子区的EcRE序列，Genbank IDY07758)，均由捷瑞生物工程(上海)有限公司合成；2、引物用DNAMAN软件设计，由北京赛百胜公司合成。
引物15`-gagctccccacacaccatag-3`引物25`-gaattccgcccttagattag-3`引物35`-tctagacacgtccgacggc-3`引物45`-aagcttagcttgcaaattaaag-3`3、pGAPZ质粒购自Invitrongen公司4、pPIC3.5K质粒购自Invitrongen公司5、pEGFP-N1购自美国clonetech公司6、毕赤酵母GS115购自Invitrongen公司7、工具酶HindIII、Sac I、Bgl II、Not I均购自Takara公司二、方法1、将人工合成的EcR序列和USP序列克隆到pUC57质粒上，得到EcR-pUC57质粒和USP-pUC57质粒。
2、构建pGAPZ重组质粒载体(1)将人工合成的EcR亚克隆入pGAPZ质粒GAP启动子的下游，构建pGAP promoter-EcR-AOX1TT读码框。
(2)以pGAP质粒为模板，用引物1和引物2扩增TEF1 promoter序列；以pGAP质粒为模板，用引物3和引物4扩增CYC1 TT序列；将扩增的TEF1 promoter序列和CYC1 TT序列分别插入到USP-pUC57质粒中USP序列的上游和下游，构建TEF1 promoter-USP-CYC1 TT读码框；用HindIII和Sac I双酶解回收目的基因TEF promoter-USP-CYC1 TT序列，插入pGAP promoter-ECR-AOX1TT读码框的下游，构建pGAPZ-ECR-AOX1TT-TEF promoter-USP-CYCTT质粒。
3、构建pPIC3.5K-5×EcRE-HSP27promoter-GFP质粒从果蝇基因组DNA中扩增出HSP27promoter序列，连接到5×EcRE序列下游，然后将5×EcRE-HSP27promoter序列连接入pEGFP-N1质粒的GFP基因的上游，然后用BglII和Not I双酶解获得5×EcRE-HSP-GFP片断，并利用相同的酶切位点将该片段亚克隆入pPIC3.5K质粒。
4、构建本发明所述的一种生物杀虫剂筛选模型使用AvrII酶解pGAPZ-ECR-AOX1TT-TEF promoter-USP-CYCTT质粒，使得质粒线性化，凝胶纯化回收，电转化GS115酵母，Zeocin+梯度平板筛选阳性高拷贝克隆，获得重组酵母A(操作参见Invitrongen公司毕赤酵母表达手册)。
使用Bgl II酶切pPIC3.5K-5×EcRE-HSP27promoter-GFP质粒，凝胶纯化回收大片断，电转化上述重组酵母A，组氨酸缺陷型平板筛选阳性克隆，G418+梯度阳性平板筛选高拷贝克隆，从而获得高拷贝重组酵母B(操作参见Invitrongen公司毕赤酵母表达手册)。
三、结果从培养3天的Zeocin+上平板挑取阳性高拷贝克隆(酵母B)至YPD培养液中培养，29℃摇菌培养至对数生长期，培养液涂板，荧光显微镜下可见球状的巴斯德毕赤酵母细胞发出绿色荧光，见图4。说明将EcR基因和USP基因转录、翻译、结合形成EcR-USP二聚体、二聚体作用于响应序列EcRE，启动HSP27启动子从而启动报告基因GFP表达的模型在巴斯德毕赤酵母体内成功建立，即本发明所述的一种生物杀虫剂筛选模型已成功建立。
筛选例(1)待筛选药物中文名称虫酰肼，购于江苏山达化工有限公司。
通用名称tebbufenozide商品名称MIMIC，comfirm，Romdan，米满化学名称N-叔丁基-N-(4-乙基苯甲酰基)-3，5-二甲基苯酰肼毒性对眼睛和皮肤无刺激性，对高等动物无致畸、致癌、致突变作用。该剂按世界粮油组织(FAO)标准，全面衡量，属实际无毒级农药产品。
作用机制虫酰肼类杀虫剂是20-羟基蜕皮酮类似物，其作用机制尚不明确。
(2)筛选方法将本发明所述的生物杀虫剂筛选模型(菌液浓度为OD600＝0.1)分装于试管中，每管5毫升。留5个空白管(不加待筛选药物，只加500μl溶解该药物的溶剂)做为对照组，其它实验组加入500μl待筛选药物(施药过程参见说明书)，于28℃及250rpm的培养箱中共培养。待菌液浓度为OD600＝0.8时，吸取10μl于载玻片上用荧光显微镜观察。
(3)筛选结果实验结果见图3、图4、图5、图6，从图中可以看出，施药组相对于空白对照组其荧光的酵母数明显减少，荧光酵母的荧光强度也明显减弱。可见虫酰肼是有效的生物杀虫剂。
下面将通过半定量RT-PCR法检测施加药物组及对照组酵母模型的GFP基因转录效率。
a.引物用DNAMAN软件设计，由北京赛百胜公司合成。
pActin15′-TGTCACCAACTGGGACGATA-3′pActin25′-AACCAGCGTAAATTGGAACG-3′pGFP15′-TATACGTAATGGTGAGCAAGGGCG-3′pGFP25′-ATCCAAGGGTTGGCTAGATCCGGTGGAT-3′b.模板使用Omega公司酵母总RNA提取试剂盒分别提取施药组与空白组的模型酵母总RNA，使用随机引物、M-MLV逆转录酶反转录合成cDNA，作为PCR反应的模板。
c.PCR产物引物pActin1和pActin2扩增酵母管家基因Actin-1，PCR产物长度283bp；引物pGFP1和pGFP2扩增EGFP基因，PCR产物长度为737bp。
d.PCR反应采用GFP和Aetin-1同管扩增的方法，以反转录后产物cDNA为模板，采用54℃复性温度扩增GFP、Actin-1基因。
e.结果与分析PCR产物用1％的琼脂糖凝胶电泳分析，结果见图7，以巴斯德毕赤酵母管家基因Actin-1作为内参，检验GFP基因的转录效率。通过凝胶成像扫描系统扫描各条带的灰度，求band1(GFP)与band2(内参)灰度的比值，lane 1比值为0.614，lane2比值为1.134。可见施加药物后，巴斯德毕赤酵母的GFP基因转录水平明显降低，也就说明了虫酰肼是有效的生物杀虫剂。
核苷酸序列表<110>南方医科大学<120>一种生物杀虫剂筛选系统及其制备方法和应用<160>3<210>1<211>2945<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>CDS<223>人工序列描述基因片断<400>1agatcttttt tgtagaaatg tcttggtgtc ctcgtccaat caggtagcca tctctgaaat 60atctggctcc gttgcaactc cgaacgacct gctggcaacg taaaattctc cggggtaaaa 120cttaaatgtg gagtaatgga accagaaacg tctcttccct tctctctcct tccaccgccc 180gttaccgtcc ctaggaaatt ttactctgct ggagagcttc ttctacggcc cccttgcagc 240aatgctcttc ccagcattac gttgcgggta aaacggaggt cgtgtacccg acctagcagc 300ccagggatgg aaaagtcccg gccgtcgctg gcaataatag cgggcggacg catgtcatga 360gattattgga aaccaccaga atcgaatata aaaggcgaac acctttccca attttggttt 420ctcctgaccc aaagacttta aatttaattt atttgtccct atttcaatca attgaacaac 480tatgaattca tgatgaaaag aagatggtcc aacaatggtg gattcactgc tttgagaatg 540ctggacgact cttcttccga ggttacttcc tcttccgccg ccctgggtat gaccatgtct 600ccaaattctc tcggttcacc aaactacgat gaactggaac tgtggagttc ttacgaagac 660aatgcctaca acggtcactc tgtcctatct aatggtaaca acaacctggg aggttgtgga 720gctgccaaca acctgctgat gaacggtatc gtcggtaaca acaacttgaa cggaatgatg 780aacatggcct ctcaagctgt ccaggccaac gcaaactcta ttcagcacat cgtcggtaac 840ctgatcaacg gtgtgaaccc aaatcagacc ttgattccac ctctgccttc tattatccag 900aataccttga tgaacacccc aagatctgaa tccgtcaact ccatttcttc aggtagagag 960gatttgtctc cttcctcttc attgaatggt tacaccgacg gttctgacgc caagaagcag1020aagaagggac caactccaag acagcaggag gaactgtgtc tggtttgtgg tgatagagct1080tccggttatc actacaatgc cttgacctgt gagggttgta aaggtttctt tagaagatct1140gtcaccaaga atgctgttta ctgttgtaag ttcggtcacg cctgtgagat ggacatgtac1200atgagaagaa agtgtcaaga gtgtagattg aagaagtgtc tggccgtcgg aatgagacct1260gagtgtgtcg tgccagagaa ccagtgtgcc atcaagagaa aggagaagaa agcccagaag1320gagaaggaca aggtgcaaac taacgccacc gtctctacaa ctaactctac ctacagatct1380gagatactgc caatcctgat gaaatgtgat ccaccgccgc accaagctat acctctacta1440ccagaaaagt tgctgcagga gaatagattg agaaacatac ctctgctgac tgctaaccaa1500atggccgtca tctacaaatt gatctggtac caggacggtt acgagcagcc atctgaggaa1560gatttgaaaa gaataatgat cggttctcca aacgaggagg aagatcaaca tgacgtgcac1620ttcagacaca taactgaaat cacaatcttg acagttcaat tgatcgtgga gttcgccaag1680ggactgccag catttaccaa gattccacag gaggaccaga tcactctgct gaaggcctgt1740tcttctgagg tcatgatgct gagaatggcc agaagatacg acgctgccac cgactccatc1800ctgttcgcta acaacagatc ttacactaga gactcctaca gaatggccgg catggctgac1860actatagagg acctgctgca cttctgtaga cagatgttct ccttgactgt ggacaacgtc1920gagtacgcct tgctgactgc tatcgtcatc ttctctgaca gaccaggtct ggagcaggcc1980gagctggtcg agcacatcca gtcttactac atcgacactc tgagaatcta catcctgaat2040
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权利要求
1.一种生物杀虫剂筛选模型，该模型是染色体上整合有以下外源基因序列的巴斯德毕赤酵母(1)核苷酸序列如SEQ ID NO.1所述的基因片段；(2)核苷酸序列如SEQ ID NO.2所述的基因片段；(3)核苷酸序列如SEQ ID NO.3所述的基因片段。
2.权利要求1所述的一种生物杀虫剂筛选模型的制备方法，该方法由以下步骤组成(1)人工合成白纹伊蚊EcR及USP的编码序列，以双表达盒形式插入到pGAPZ质粒，得到pGAPZ重组质粒载体；(2)将pGAPZ重组质粒载体上的双表达盒通过同源重组整合到巴斯德毕赤酵母的染色体上；(3)将果蝇蜕皮激素受体的响应元件5次重复序列，依次接上受其调控的HSP27启动子和GFP基因，构建出5×EcRE-HSP27 Promoter-GFP DNA片段，然后将该DNA片段插入pPIC3.5K质粒，得到pPIC3.5K重组质粒载体；(4)将pPIC3.5K重组质粒载体上的5×EcRE-HSP27 Promoter-GFP DNA片段通过同源重组整合到已含有EcR基因表达盒和USP基因表达盒的巴斯德毕赤酵母的染色体上。
3.权利要求1所述的生物杀虫剂筛选模型用于筛选生物杀虫药物的方法，该方法由以下步骤组成(1)本发明所述的生物杀虫剂筛选模型在YPD培养基中于28～30℃，250rpm培养至菌液浓度为OD600＝0.1～0.2，平均分装于试管中，再按100μl药物/ml菌液加入待筛选药物，同时设加入等量溶解该药物的溶剂的菌液为对照组，置于28℃～30℃、250～260rpm的条件下培养至菌液浓度为OD600＝0.8～1；(2)吸取步骤(1)所得到的菌液观察，选出可以使GFP表达量改变的药物即可。
全文摘要
一种生物杀虫剂筛选模型，该模型是染色体上整合有以下外源基因序列的巴斯德毕赤酵母(1)组成型表达白纹伊蚊蜕皮激素受体EcR的基因表达盒GAP Promoter－EcR－AOX1 TT；(2)组成型表达超螺旋USP蛋白的基因表达盒TEF1 Promoter－USP－CYC1 TT；(3)5×EcRE－HSP27 Promoter－GFP DNA片段。该模型的制备是先将含有蜕皮激素受体EcR及超螺旋蛋白USP基因整合到巴斯德毕赤酵母的染色体上，再把含有果蝇5×EcRE－HSP27 Promoter－GFP DNA片段整合到在已含有EcR基因和USP基因的酵母的染色体上得到。把待筛选药物与本发明所述的生物杀虫药物筛选模型共培养，即可筛选出能遏止或增强GFP表达的生物杀虫剂，具有筛选快速、灵敏度高、作用机理明确的优点。
文档编号C12R1/84GK101016518SQ20061012205
公开日2007年8月15日 申请日期2006年9月12日 优先权日2006年9月12日
发明者彭鸿娟, 陈晓光, 顾金保, 杨俊 申请人:南方医科大学