专利名称：一种筛选动物抗病毒基因的方法
技术领域：
本发明涉及一种筛选基因的方法。具体而言，动物抗病基因筛选过程中，采用了灭活疫苗刺激实验动物材料，使动物产生一定的反应；进而我们通过分子生物学的手段，主要采用mRNA差异显示技术，比较未用灭活疫苗刺激的动物与灭活疫苗刺激动物的基因表达差异，从而筛选出与灭活疫苗相关的基因。
背景技术：
基因筛选的研究可以为深入了解疾病的发生发展过程，使用药物作用机制，建立疾病诊断、预防、治疗策略奠定基础；因而基因筛选的研究正在成为当今药物及药物靶点发现的重要途径。最近几十年来，随着人类基因组计划的完成，后基因组时代蛋白质组学、功能基因组学等研究的深入开展，给医药发现领域带来了革命。生物基因组庞大规模序列的可利用性、高通量基因表达检测方法的发展及大规模数据分析能力的提高，为药物的寻找展现了广阔的天地。现有技术下，基因筛选研究的基本策略包括通过表达谱差异分析、生物信息学分析和基因克隆等途径获得候选基因；对候选基因进行功能评价，可在基因组、转录、蛋白质组和代谢产物等水平进行；基因功能确证。功能基因的筛选主要有以下过程1)差异表达筛选功能基因筛选基因的研究途径之一是通过正常和疾病组织的表达谱差异分析获得疾病的相关基因，进一步进行基因功能的筛选研究。该筛选策略与疾病过程密切相关，较多地应用于新药及治疗靶点的发现[Reidhaar201son JF, Rhees BK, Hammer J. Genomics approaches to drug discovery. J Cell Biochem,2001,37(Suppl) :110-119. Hanash SM, Madoz2Gurpide J, Misek DE.Identification of novel targets for cancer therapy using expression proteomics. Leukemia,2002,16(4) :478-485. Logsdon CD,Simeone DM, Binkley C, et al. Molecular profiling of pancreatic adenocarcinoma and chronic pancreatitis identifies multiple genes differentially regulated in pancreatic cancer. Cancer Res,2003,63(10) :2649-2657.]。2)生物信息学分析另一研究途径是通过生物信息学分析(bioinformatic analysis)预测、选定基因序列、克隆获得候选基因，进一步进行基因功能的筛选研究[Scherf U，Ross DT, Waltham M, et al. A gene expression database for the molecular pharmacology of cancer. Nat Genet, 2000, 24 (3) :236-244.]。该研究策略所筛选基因的范围比较广，常常应用于新基因的功能探索性研究。所采用生物信息学分析的数据资料，主要来源于DNA芯片技术和其他相关技术测定的基因表达信息。通过与已知基因或蛋白质序列的分析、比较，可以确定候选研究基因序列长度，提供该未知基因产物信号转导通路、细胞结构蛋白类型和细胞定位等预测信息 [Koonin EV, Aravind L，Kondrashov AS. The impact of comparative genomics on ourunderstanding of evolution. Cell, 2000,101(6) :573-576.]。然而，由于人类基因组中约1/3的基因序列与其他基因无同源性，因此这些基因的功能不易进行直接预测。另一方面，蛋白质的功能表现还与其所处的分子环境有关，一种蛋白质实际上与相邻蛋白质形成了功能网络。因此，生物信息学中的功能网络数据库分析，对于了解复杂信号通路及与其他基因产物的关系，可能会提供有价值的参考信息[Ideker T, Thorsson V, Ranish JA, et al. Integrated genomic and proteomic analyses of a systematically perturbed metabolic network. Science,2001,292(5518) :929-934.]。3)其他以上研究策略外，其他途径的功能基因研究也在进行，如直接从正常或疾病组织中克隆单一未知基因，进行功能研究。其中mRNA差异显示方法是是通过基因的差异表达筛选功能基因常用的方法之一。根据大多数真核生物成熟mRNA 3’端有一段腺嘌呤多核苷酸序列，即Poly(A)尾巴。1992 年 Liang和 Pardee 建立了 mRNA 差异显示技术[Liang P, Pardee AB. Differential display of eukaryotic messenger RNA by means of the polymerase chain reaction. Science, 1992, 257 (5072) :967-971. ]。mRNA差异显示技术以两种不同来源的RNA作为模板，用同一种含两个锚定碱基的？01711^^代表(16/(^/( 7(^)锚定引物各自进行反转录反应，然后用与反转录相同的锚定引物和一套10个碱基组成的随机引物cDNA进行PCR扩增。 通过变性或非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳在相邻泳道上平行显示扩增结果，电泳图谱的差异代表基因表达差异情况。这样对于相同的cDNA，PCR产物的种类多少和分布应该是完全一样的，而对于不同的cDNA则不同。PCR扩增产物的差异条带所代表的cDNA就有可能与细胞状态的改变相关。接着把凝胶中显示差异DNA片段的部分切出回收进行再次扩增，以这些片段作为探针，可在cDNA文库或基因组DNA文库中钓出相关基因，也可将差异条带二次PCR 扩增并通过Northern杂交验证、克隆、测序差异cDNA片段。将所得片段采用BLAST软件与 GenBank数据库的已知序列做比较，以推测差异条带的功能，进而研究其表达状况及其与目标性状的关系。从理论上讲，如果选用不同的足够的引物组合，可以检测到细胞中所有基因的表达情况。DDRT-PCR具体包括以下7个基本步骤组织或细胞中总RNA的提取；锚定引物反转录样本RNA为cDNA ；用一套随机引物和锚定引物扩增cDNA ；聚丙烯酰胺凝胶电泳分离扩增产物；差异片段的切割和二次扩增；差异片段的鉴定、克隆、测序分析；对差异片段的定性、定位和功能研究。动物抗病毒基因的筛选有重大的现实意义。动物病毒不但感染动物，给社会造成重大的经济损失，而且还感染人类，严重威胁着人的生命安全。例如，2003年至今H5W亚型禽流感在世界范围内流行，随时都能夺走动物和人的生命；口蹄疫在数百年的广泛流行中， 它给世界人民带来了巨大的损失，每次的暴发除了造成百万头牲畜被屠宰和严重的经济损失外，也严重地影响社会经济、政治的稳定发展，如2001年英国暴发的口蹄疫就使当年的大选被迫推迟。目前，筛选动物抗病毒基因有许多先进的方法，包括上述的mRNA差异显示方法 [W. Zhen,P.Li, B. He, et al. The Novel Epididymis-Specific Beta-Galactosidase-Like Gene Glbl14 Is Essential in Epididymal Development and Sperm Maturation in Rats. (2009)Biol Reprod 80,696-706.A. K. Srivastava, N.K.Ramaswamy,R. Mukopadhyaya,et al. Thiourea modulates the expression and activity profile of mtATPase under salinity stress in seeds of Brassica juncea. (2009)Ann. Bot. 103, 403-410. Y. Takaoka, M. Ohta, A. Ito, et al. Electroacupuncture suppresses myostatin gene expression :cell proliferative reaction in mouse skeletal muscle. (2007) Physiol Genomics 30，102-110]。但是截至目前，还没有有效的筛选抗病毒基因或者是抗病毒因子的方法。由于动物病毒的危害性与制备的难度，利用病毒处理试验材料具有潜在的危害性、试验过程相对复杂性以及对试验条件要求高等特点。为此，发明一种更简便易行的病毒基因筛选方法具有重要的意义。本发明另辟蹊径，采用动物灭活疫苗和灭活病毒来处理动物材料(动物或培养细胞)，在进一步的筛选过程中，筛选到抗病毒相关的基因，这是在动物抗病毒基因筛选未曾见到的。灭活疫苗或灭活病毒是将病原微生物(包括细菌、病毒和立克次体等)及其代谢产物用物理或化学的方法使其灭活，丧失毒力，但仍保留其免疫原性而制成的疫苗，如百日咳疫苗、流脑疫苗等。这种疫苗由于病原微生物已被杀灭，进入人体后不能生长繁殖，因此需要注射剂量大，注射次数多。常规灭活疫苗，是利用常规技术制造的以灭活病毒为抗原的一类疫苗，其研制和生产过程是通过免疫原性好的田间毒株作为疫苗种毒，经病毒培养系统大量增殖，对获得的病毒进行灭活处理，免疫动物后产生良好的体液免疫，并伴随有细胞免疫应答，具有良好的保护作用。本发明即基于上面的研究背景，利用灭活疫苗与动物病毒相似的结构特征、毒性小，利用灭活疫苗处理动物材料，取得一定的刺激作用，并且灭活疫苗获得简便，极大降低了抗动物病毒研发危害性，提高了筛选动物病毒基因的效率，改善了筛选抗病毒基因的研发环境。
发明内容
本发明基于来源于动物病毒的灭活疫苗，用灭活疫苗处理动物材料，再进行相关抗病毒基因的筛选。本发明所述一种筛选动物抗病毒基因的方法，包括采用动物病毒的灭活疫苗和灭活病毒来处理实验的动物材料，再通过分子生物学实验途径获得抗病毒相关基因。本发明设置了对照组，即未用灭活疫苗处理的动物材料。本发明所述的灭活疫苗是指来源于所述病毒，经过灭活而制备的疫苗(无佐剂)。本发明公开了具体的分子生物学实验过程，包含以下步骤1) RNA提取纯化、组建RNA池以及基因反转录2)基因的PCR扩增以及聚丙烯酰胺凝胶电泳3)差异片段的反Northern点杂交鉴定4)差异片段的克隆与序列测定本发明提供了一种更加简便而安全的抗动物病毒基因筛选方法。本发明利用灭活疫苗与动物病毒相似的结构特征、毒性小，用灭活疫苗和灭活病毒处理动物材料，而不采用危险性大的病毒感染试验动物材料，极大提高了筛选动物病毒基因的安全性，也降低了筛选抗病毒基因的研发硬件的要求。
图1DDRT-PCR的聚丙烯酰胺凝胶电泳结果。从左到右为锚定引物H-TllA与8条随机引物(P1-P8)的扩增结果，每对引物每组有3个重复，左边为A组，右边为B组，M为 Marker.箭头所指为差异条带。图2部分差异表达回收条带的二次PCR扩增结果。M.分子量标准；1_14. 二次PCR 扩增产物。图3实施例1中A组探针的反Northern点杂交鉴定结果。+.阳性对照；阴性对照。图4实施例1中B组探针的反Northern点杂交鉴定结果。+.阳性对照；阴性对照。图5重组质粒的酶切鉴定。M.分子量标准；1-13.差异表达片段的重组质粒。图6实施例2中A组探针的反Northern点杂交鉴定。+.阳性对照；阴性对照。图7实施例2中B组探针的反Northern点杂交鉴定结果。+.阳性对照；阴性对照。实施例1抗禽流感病毒免疫相关基因的筛选与鉴定本实施例以40只AA白羽肉鸡为实验材料，其中20只注射H5亚型禽流感灭活疫苗，另20只作为对照，这样在实验中只有疫苗免疫这一个因素起作用，筛选出的即为免疫相关基因。我们在该实施例中采用了灭活疫苗刺激动物。脾脏是体内最大的免疫器官，其中含有B细胞、T细胞、巨噬细胞、树突状细胞等免疫细胞，因此本实施例选择脾脏为研究对象。筛选出的条带通过反Northern点杂交鉴定，仍不确定的再经半定量RT-PCR验证，彻底排除假阳性，使筛选出的基因与功能密切相关。以下是分子生物学部分的实验过程。1)总 RNA 提取研磨组织样取50_100mg组织样于研钵中一加入适量液氮超低温下迅速研磨组织样彻底研磨至粉末状装入1. 5mL新离心管迅速加入ImL TRIZOL试剂，剧烈振荡至透明以充分裂解细胞释放RNA。分相15-30°C温育5min以完全解离核蛋白复合体4°C 12000r/min 离心lOmin，上清移至新离心管，加0. 2mL氯仿用力摇动15S，15_30°C放置2_;3min，12000r/ min 4°C离心15min。RNA沉淀移水相于一新离心管，加0. 5mL异丙醇混勻，室温放置8min， 4-8°C (或室温)12000r/min离心lOmin。洗涤RNA 弃上清，加ImL 75%乙醇洗涤RNA， 2-80C 7500r/min离心5min。RNA溶解弃乙醇，离心机甩下液滴并小心吸弃液滴，空气中干燥或真空干燥5-lOmin，加适当DEPC处理水，吸打几次置55_60°C溶解IOmin。0. 8%琼脂糖凝胶电泳检测。2)总 RNA 纯化依次加入下列成分0. 1 % DEPC处理水、IOx反应Buffer、不含RNA酶的DNA酶 I (1U/ μ L)、RNA 酶抑制剂(40U/ μ L) ,RNA (1 μ g/ μ L), 37°C孵育 30min。加入 50 μ L 的 DEPC 处理水。加入等体积的苯酚/氯仿/异戊醇05 24 1)，充分混勻。12000r/min 4°C离心lOmin，移上清到新离心管中。加10μ L3mol/L乙酸钠、250 μ L无水乙醇混勻，_20°C放置 60min沉淀总RNA。4°C 12000r/min离心lOmin，弃上清。加500 μ L70%的乙醇洗涤沉淀。 40C 7500r/min离心lOmin，弃乙醇。干燥加适量0. 1 % DEPC处理水溶解总RNA。分装，放液氮中保存。3) RNA纯度检测与组建RNA池分光光度计测定0拟60、0拟80，计算0拟60/0D280准确定量总RNA的浓度和纯度， 将每个样品稀释成1 μ g/ μ L，每组中每个样品取5 μ L RNA混勻，组建RNA池。4)反转录以RNA池中总RNA为模板，分别用三条锚定引物H-T11G、H-T11C、H-T1IA进行反转录，方法如下将2 μ LRNA(1 μ g/ μ L)加入无RNA酶的灭菌微量离心管中，加2 μ L弓丨物(ΙΟμπιοΙ/L)和6yL0. DEPC处理水，混勻，70°C变性5min立即置于冰上。稍离心后，依次加入下列成分M-MLV 5 χ Buffer、dNTPs (2. 5mmol/L)、RNA 酶抑制剂(40U/μ L)、 M-MLV (200U/ μ L)、0. 1% DEPC 处理水；42°C温育 lh，95°C 5min 灭活反转录酶。5) PCR 扩增PCR反应条件94°C 5min ；94°C 30S，40°C lmin，72°C lmin，25 个循环；94°C 30S， 53°C lmin，72°C lmin，15 个循环；72°C 10min，4°C。6)聚丙烯酰胺凝胶电泳及差异表达条带的回收点样向8%胶槽中倒入电泳缓冲液(IXTBE)，预电泳lOmin，然后取5 μ L扩增产物与2μ L上样缓冲液混勻，点样。电泳以200V电压电泳几，直到染料迁移到底部。硝酸银染色。按条带在一组“有”而另一组“无”的标准切割差异条带，将差异表达条带用酒精棉球消毒过的解剖刀片挖出，放入灭菌的1. 5mL离心管中。加1-2倍体积胶浸泡液PE，50°C放置30min。得到溶液加入过滤柱CS，12000r/min离心3min，取收集管中的溶液，加3_6倍体积的结合液PG，混勻。将所得溶液加入一个吸附柱CB2中，12000r/min离心30s。用PW漂洗液洗两次，12000r/min离心30s。将吸附柱放入离心管中，加入洗脱缓冲液EB，放置2min， 12000r/min离心2min，离心管底的液体即为回收产物。7) 二次PCR扩增与PCR产物的回收二次 PCR 反应条件94°C 5min ；94°C 30S，53°C lmin, 72 °C lmin，40 个循环； 720C 10min，4°C。取3_5 μ L PCR产物在1 %的琼脂糖凝胶上电泳检测。如果未检测到扩增产物，可将回收cDNA或第一次PCR产物稀释100倍后，再从中取4 μ L作模板按上述体系再次扩增。将PCR产物于1. 5%的琼脂糖凝胶上进行电泳，电泳为1 X TAE,电压85V，电泳约lh，取下凝胶放于紫外灯下，用手术刀切下所需的DNA片断，放在1.5mL离心管中。加入 3倍体积的溶胶液，50°C水浴放置lOmin，期间不断温和上下翻转离心管，直至胶完全溶解。 将上一步所得溶液加入一个吸附柱中(吸附柱放入收集管中)，13000r/min离心30-60S， 倒掉收集管中的废液。加入8001^漂洗液？1，13000171^11离心30-605，弃掉废液。加入 500 μ L漂洗液PW，13000r/min离心30-60S，弃掉废液。将离心柱放回收集管，13000r/min 离心aiiin，尽量除去漂洗液。取出吸附柱，放入一个干净的离心管中，在吸附膜中间位置加入适量洗脱缓冲液EB，(洗脱缓冲液先在65-70°C水浴预热，效果更好)室温放置aiiin， 13000r/min离心lmin。琼脂糖凝胶检测回收效果。8)差异片段的反Northern点杂交鉴定将2 μ L RNA(1 μ g/ μ L)力口入无RNA酶的灭菌微量离心管中，力Π 1 μ L oligodT15(20y g/μ L)和7yL 0. 1 % DEPC水，混勻，70°C变性5min立即置于冰上。稍离心后，依次加入下列成分M-MLV 5x反应Buffer、dNTPs (2. 5mmol/L)、RNA酶抑制剂(40U/μ L), M-MLV (200U/ μ L)、0· 1% DEPC ；42°C温育 lh，95°C 5min 灭活反转录酶。取30 μ L反转录产物加等体积酚/仿，充分混勻，-20°C放置IOmin。10000r/min 离心15min,取上清移入一 0. 5mL离心管。加3 μ L 3mol/LNaAc (ρΗ5· 2)，再加入2倍体积预冷的无水乙醇，混勻后_20°C放置30min。10000r/min离心lOmin，弃上清，70%乙醇洗涤沉淀。10000r/min离心5min，弃上清，37°C干燥lOmin。加无菌去离子水20 μ L 37°C溶解，取 1 μ L稀释100倍测定0D260、0D280光密度值。取16 μ L纯化好的第一链cDNA放入新离心管，封口膜封口，煮沸IOmin,立即置冰上，加4 μ L DIG-HIGH primer混勻，稍微离心，37°C温育20h，65°C IOmin终止标记反应，_20°C存放。9)反 Northern 点杂交点膜裁两块大小相同的带正电荷的尼龙膜，将二次扩增回收的差异表达条带煮沸lOmin，立即置于冰上。分别取2μ L点到大小相同的两张尼龙膜上，并且两张膜上的点样顺序相同。以GAPDH(3-磷酸甘油醛脱氢酶)基因片段为阳性对照，并设立了阴性对照。点膜后自然晾干，将膜DNA面朝上，120°C烤30min。预杂交杂交膜放入杂交盒中，加入预热至42°C的杂交液保温30min，温和摇动。 杂交按25ng探针/mL杂交液比例，取适量已标记的探针在沸水中变性lOmin，迅速置冰上冷却，加到已预热的4mL杂交液中，充分混勻(但不要摇出气泡，以免造成背景)。倒掉预杂交液，将膜放入新的杂交盒中，装入含探针的杂交液，42°C摇床上温和摇动16h。洗膜I 15-25°C，用洗膜液I洗两次，每次5min，温和摇动。洗膜II 用预热至65°C-68°C洗膜液II 洗膜两次，65°C _68°C温和摇动，每次15min。之后进行免疫检测。10)差异片段的克隆连接反应在16°C反应20h，取5111^转化，剩余的_201保存。从_70°C取出冻存的感受态细胞，置于冰上解冻。200μ 感受态细胞中加入5yL连接产物，冰浴30min。42°C 水浴热激90S，立即冰浴anin。加300 μ L液体LB培养基，37°C复活50min。铺200 μ L于含 X-gal,Amp的平板。37°C恒温培养箱培养16_20h。11)质粒DNA的提取与鉴定接1 %含质粒的大肠杆菌细胞于2mL LB培养基。37°C振荡培养过夜。取1. 5mL菌体于离心管，以lOOOOr/min离心30s，弃上清液。加预冷的溶液I 120 μ L重悬菌体。加入 240 μ L溶液11，温和倒置3-4次混勻，冰浴放置5min。加入180 μ L预冷溶液III，轻轻翻转混勻，冰浴放置5min。以12000r/min离心8min，取上清转移至另一新离心管，加入500 μ L Tris饱和酚混勻。以12000r/min离心8min，取上清转移至另一新离心管，加等体积的酚 氯仿异戊醇05 24 1)，振荡混勻。以12000r/min离心8min，取上清转移至另一新离心管，加等体积的氯仿异戊醇04 1)，振荡混勻。以12000r/min离心8min，取上清转移至另一新离心管，加入2倍体积的无水乙醇，沉淀质粒，以12000r/min离心8min。沉淀用 70%乙醇洗涤两次，置室温干燥；待沉淀干燥后，溶于TE缓冲液或水中，加入RNA酶(终浓度为 20 μ g/mL)。测序工作由北京奥科生物技术公司完成，测序引物使用T7 Promoter Primer, 测序仪用3730型。每条差异片段挑取2个阳性克隆测序，测序结果用DNASTAR软件中的 kqMan去掉载体序列。实验结果
1)非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳及硝酸银染色反转录后，采用M对引物扩增，每对引物扩增3管。将DDRT-PCR产物经琼脂糖凝胶检测后，每管取5 μ L样品加2 μ L上样缓冲液，加样后电泳大约几后进行乙醇固定、去离子水漂洗、硝酸氧化、硝酸银染色、去离子水漂洗、碳酸钠显色、冰乙酸停显、去离子水漂洗、 拍照。结果显示，每条泳道上有30-80条带。条带较清晰，最长条带超过2000bp。条带主要分布在300-1200bp。部分结果如图1。2)差异片段的回收和二次PCR扩增电泳结束硝酸银染色后，立即从胶中切下差异条带，用聚丙烯酰胺凝胶DNA回收试剂盒回收。以回收产物为模板，用相应的引物组合和高严谨的PCR扩增条件进行二次PCR 扩增。扩增结果发现，回收的59条差异表达条带中有40条可以重复扩增，并且扩增片段大小与差异表达条带一致。部分回收结果如图2。3)差异片段的反Northern点杂交鉴定将二次扩增回收的差异表达片段分别点到大小相同的两张尼龙膜上，并且两张膜上的点样顺序相同，分别与标记的A、B两组cDNA探针进行杂交。以GAPDH基因片段为阳性对照，并设立了阴性对照。通过比较同一片段在A、B两组中的杂交信号强弱，来确定是否为阳性差异表达条带。在40条差异表达条带中有13条被初步确定为阳性差异表达，编号为 DD1_DD13(依次在序列表中对应 sequence NO 1-—sequence NO :13)，阳性率为 32. 5%。在 13条差异条带中，DD1、DD2仅在A组中表达，DD3、DD4在A组中表达量高于B组；DD5、DD6、 DD7、DD8、DD9仅在B组中表达，DD10、DD11、DD12、DD13在B组中表达量高于A组。其中的 12条差异很显著，只有DD12不是很显著，需通过半定量RT-PCR进行后续鉴定。这13条带聚丙烯酰胺凝胶电泳结果都与杂交结果相符合，只不过有些条带在聚丙烯酰胺凝胶上一组 “有”而另一组“无”，杂交时出现了一组“高”另一组“低”的情况。结果如图3，图4。4)差异片段的克隆差异片段的二次PCR扩增产物经过回收纯化后，进行反Northern点杂交鉴定。将鉴定为阳性的13条差异片段与pGEM-T easy载体进行连接，然后转化Dffia感受态细胞。通过蓝白斑筛选，初步鉴定阳性克隆，挑取白色单克隆摇菌，提取质粒，用EcoR I酶切鉴定，结果如图5。5)差异片段的测序通过酶切鉴定，将阳性克隆送北京奥科生物技术公司测序，测序所用引物为T7 Promoter Primer,测序仪用3730型，测序结果用DNASTAR软件中的kqMan去除载体序列。 结果如序列表所示(sequence NO 1-—sequence NO :13)。实施例2抗口蹄疫病毒相关基因的筛选及分析本实施例以H(-15细胞为材料，一组用适当浓度的口蹄疫疫苗刺激，另一组正常的作为对照，两组细胞的其余培养条件保持相同，这样通过两组细胞差异表达条带的比较， 筛选出抗口蹄疫病毒的相关基因。本实施例的分子生物学实验过程与上述实施例1相同。 具体的结果如下1)差异片段的反Northern点杂交鉴定结果将二次扩增回收的差异表达片段分别点到大小相同的两张尼龙膜上，并且两张膜上的点样顺序相同，分别与标记的A、B两组cDNA探针进行杂交。以GAPDH基因片段为阳性对照，并设立了阴性对照。通过比较同一片段在A、B两组中的杂交信号强弱，来确定是否为阳性差异表达条带。在30条差异表达条带中有8条被初步确定为阳性差异表达，编号为 E1_E8(依次在序列表中对应sequence NO :14-—sequence NO :21)。在8条差异条带中， El，E2，E3仅在B组中表达，E6在B组中表达量高于A组，E5，E7仅在A组中表达，E4，E8在 A组中表达量高于B组。结果如图6和图7所示。2)差异片段的测序通过酶切鉴定，将阳性克隆送北京奥科生物技术公司测序，测序结果用DNASTAR 软件中的kqMan去除载体序列，结果如序列表所示(sequence NO :14-—sequence NO: 21)。
权利要求
1.一种筛选动物抗病毒基因的方法，包括采用动物病毒的灭活疫苗来处理实验的动物材料，再通过分子生物学实验途径获得抗病毒基因。
2.根据权利要求1所述的一种筛选动物抗病毒基因的方法，其特征在于，在前期的处理动物材料过程中，所采用的是利用灭活疫苗来刺激动物材料。
3.根据权利要求2所述的一种筛选动物抗病毒基因的方法，其特征在于，所述的灭活疫苗是指来源于所述动物病毒，经过灭活而制备的疫苗。
4.根据权利要求1所述的一种筛选动物抗病毒基因的方法，其特征在于，所述的动物材料包括个体动物与动物细胞。
5.根据权利要求1所述的一种筛选动物抗病毒基因的方法，其特征在于，所述的分子生物学实验途径包括mRNA差异显示技术的实验过程。
全文摘要
本发明公开了一种筛选动物抗病毒基因的方法。在动物抗病基因筛选过程中，本发明采用了灭活疫苗和灭活病毒来刺激实验动物材料，再通过分子生物学的手段，比较未用灭活疫苗和灭活病毒刺激的动物与灭活疫苗和灭活病毒刺激动物的基因表达差异，从而筛选出与灭活疫苗相关的基因。本发明提供了一种更加简便而安全的抗动物病毒基因筛选方法。本发明采用灭活疫苗与动物病毒相似的结构特征、毒性小的特点，利用灭活疫苗去刺激试验动物材料，与以往采用采用危险性大的病毒感染有显著区别，提高了筛选动物病毒基因的安全性，也降低了筛选抗病毒基因的研发硬件的要求。
文档编号A61K49/00GK102294036SQ20101020850
公开日2011年12月28日 申请日期2010年6月24日 优先权日2010年6月24日
发明者苗向阳 申请人:中国农业科学院北京畜牧兽医研究所