一种筛选新基因的方法
【技术领域】
[0001] 本发明设及筛选新基因的技术领域。
【背景技术】
[0002] 在生物学领域，随着科学技术的发展，各种新基因的筛选，特别是有祀标活性的新 基因的筛选是推动科学进步、发展应用的重要手段。然而，祀标新基因的筛选具有操作繁 琐、样本量大等特点，因此，依靠传统的筛选方法耗时耗力，并且容易重复筛选到已知的现 有基因，所W传统的筛选方法还具有筛选率低的缺点。
[0003] 为了提高筛选的祀标新基因的几率，有必要开发出一种新的筛选祀标基因的方 法。
【发明内容】
[0004] 因此，本发明提供了一种筛选新基因的方法，其包括如下步骤： 步骤一:根据与新基因同类的已知基因进行聚类分析获得至少一对用于扩增所述新基 因的第一引物； 步骤二：W待检测样品的DNA为模板，利用所述引物进行PCR扩增得到PCR扩增产物； 步骤S:将所述PCR扩增产物进行克隆； 步骤四：对所述克隆进行分析，W获得新基因。
[0005] 通过使用本发明的方法，大大提高了筛选新基因的几率，并且简化了操作步骤，实 现了高通量地筛选。并且一般来讲，在步骤=中获得的克隆一般为多个。
[0006] 在一个具体实施例中，所述第一引物位于所述已知基因的保守区，且成对的所述 第一引物扩增的区域为所述已知基因的具有活性的可变区。并且用于扩增所述新基因的通 用引物对中的碱基可W存在简并碱基。
[0007] 在一个具体实施例中，在所述步骤一中还包括至少一条用于特异性抑制成对的所 述第一引物扩增所述已知基因的第二引物；优选所述第二引物位于所述已知基因的可变 区;特别优选所述第二引物的Tm值大于所述第一引物的Tm值，例如前者的Tm值可W大于后者 的Tm值1° c-10° C，或者2° C -6° C，或者3° C-5° C。并且一般来讲，用于特异性抑制所述已知基 因扩增的通用引物中不含有简并碱基。
[0008] 在一个具体实施例中，在所述步骤四中，利用基因测序和/或PCR-RFLP对所述克隆 进行分析，W获得新基因。
[0009] 在一个具体实施例中，所述待测样品的数量为多个，优选至少为100种，更优选至 少为500种，最优选至少为2000种。其中，此处的"种"是指不同样品的数量，其并不与生物命 名法中的"物种"完全等同。例如，当所述待测样品为细菌时，且数量为50种时，其中的50种 待测样品可W为50株来自不同物种的细菌;也可W来自同一物种的50株不同的菌株;还可 W是来自多个不同物种的50株不同的菌株。
[0010] 在一个具体实施例中，所述待测样品为苏云金芽胞杆菌。
[0011] 在一个具体实施例中，所述第二引物如SEQ ID No. 3和/或SEQ ID No. 4。
[0012] 在一个具体实施例中，成对的所述第一引物如SEQ ID No. 1和SEQ ID No. 2。
[0013] 在一个具体实施例中，所述新基因为苏云金芽胞杆菌杀虫晶体蛋白的cry8类基 因。
[0014] 在一个具体实施例中，在进行所述PCR-RFLP分析过程中选用限制的性内切酶为 Hinf Io
[0015] 在一个具体实施例中，所述新基因的序列如SEQ ID No. 9所示。
[0016] 在一个具体实施例中，所述新基因翻译后获得的蛋白质的序列如SEQ ID No. 10 所示。
[0017] 本发明取得的有益效果： 1)采用本发明的方法可W实现高通量筛选，从而能够大大减少了工作量。
[0018] 2)在通过本发明的方法实现高通量筛选的同时，大大地提高获得新基因的几率。
【附图说明】
[0019]图巧利用引物对C巧F和C巧R扩增得到的目的片段的电泳图。
[0020] 图2为克隆基因的PCR-RFLP图谱，其中，M为DNA参照物化2000 ; 1为cry犯b ; 2为 cry9Da;3为cry犯a;4为cry拙；5为。巧8化；6为crySAb-like;7为crySEa基因的Hinf I限制 性内切酶酶切图谱。
[0021] 图3为W2000株化样品的基因组DNA为模板，Wcry F和cry R为引物对进行PCR扩 增获得的基因数量与W2000株化样品的基因组DNA为模板，Wcry F和cry R为引物对，W REcry9Da_F/REcry犯a_F为特异性抑制引物进行PCR扩增获得的基因数量百分数的比较。其 中，黑色柱状图为加入了特异性抑制引物获得的基因数量百分数(各个黑色柱状图显示的 百分比相加为100%)，而白色柱状图为没有特异性抑制引物获得的基因数量百分数(各个白 色柱状图显示的百分比相加为100%)。
[0022] 图4为冗余序列排除PCR产物及特异性抑制引物的评估电泳图。其中，1为W2000株 化的基因组池为模板，Wcry_F/c^_R为引物扩增的PCR产物;2为W2000株化的基因组池为 模板、Wcry_F/cry_RW及36。巧90日_。和1?6。巧犯a_F为引物扩增的PCR产物；3为W2000株化 的基因组池为模板，WREcryOTa_F/c^_R为引物扩增的PCR产物;4为W2000株化的基因组 池为模板，WREcryWa_F/cry_R为引物扩增的PCR产物；5为W cry犯a基因为模板，W cry_F/ c^_R为引物扩增的PCR产物；6为Wcry犯a基因为模板、Wcry_F/c巧_IlSREcry犯a_F为引 物扩增的PCR产物;7为WcryWa基因为模板、W cry_F/c^_R为引物扩增的PCR产物;8为W C巧9Da基因为模板、W c^_F/c巧_IlSREcry9Da_F为引物扩增的PCR产物；M为DNA参照物 DL5000。从图中可W看出，由于泳道6和8的PCR体系中加入了特性的抑制引物，因此明显地 降低了相应地2.1化的基因片段的扩增，如此将其用于新基因的扩增体系中，能够抑制已 知基因的扩增，而有利于进一步提高扩增到新基因。
[0023] 图5为无晶体突变株皿73-和转化连接有巧r拙的质粒后的皿73-，即皿8X的电镜照 片。其中，照片A为皿73-，其仅产生芽胞（用S表示）；照片B为皿8X，其不但产生芽胞（用S表 示），而且还产生球形的杀虫晶体蛋白（用C表示）。
[0024] 图6为皿8X的生物活性测定结果。
【具体实施方式】
[0025] W下通过优选的实施例的形式对本发明的上述内容再作进一步的详细说明，但不 构成对本发明的限制。
[00%] 实施例1 1苏云金芽胞杆菌基因组池中cry8/ar9基因类型鉴定 1.1 PCR引物设计 对实验室保存的2000株苏云金芽胞杆菌(8曰(3；[11118 1：11111'；[]1旨16]1313,81：)菌株进行基因 组提取、定量、均一化后，等量混合，建立化基因组池。参照GeneBank中公布的cry8及cry9类 模式基因，进行聚类分析，设计合成一对通用引物cry_F(SEQ ID No. l)/cry_R(SEQ ID No. 2)，进行PCR扩增。其中，C巧_尸的1"值为53.1° C;。巧_如勺1"值为55.4。Co
[0027] 1.2 DNA聚合酶PCR反应 W化基因组池为模板，通用引物cry_F/cry_R进行PCR，扩增基因组池中存在的cry8和 cry9基因。PCR扩增体系见表1。
[002引 表1
扩增循环：94°C变性1 min;54°C退火lmin;72°C延伸2 min20 s;30个循环，最后72°C延 伸10 min,PCR产物用0.7%琼脂糖凝胶电泳检测，可扩增出2.1化大小的PCR目的条带(见图 Do
[0029] 1.3连接反应 将上述的2.1 kb PCR产物经胶回收后插入到祀B载体Ecll36 II位置，连接反应按照W 下连接体系进行，充分混匀后，16°C连接4 h。其中连接采用化KaRa的pMD 19-T vectoH式剂 盒。
[0030] 目的2.1 kb DNA 4山 载体pMD 19-T 1山 Solution I 5 山 1.4E. CO 1 i的热激转化 将连接产物10化加入到100化大肠杆菌D册a感受态细胞中，轻轻混匀，冰浴30 min, 42°C热激90 S，立即置于冰上，冰浴3min，加入800化LB液体培养基，150巧m/min、37°C培 养1 h，取200化涂布于含有氨节抗生素的LB固体平板，加入X-gal溶液40化，IPTG溶液4 y L，37°C培养过夜，进行蓝白斑筛选。W载体正向引物祀B_F和克隆基因反向引物c^_R进行 PCR鉴定，筛选出连接方向正确的阳性克隆。
[0031 ]鉴定 cry8/c;ry9 基因型 随机挑选500个阳性转化子，其中连接方向正确的阳性转化子为200个，分别将运200个 连接正确的阳性转化子接入200 yL LB液体培养基中（含相应抗性），37°C培养4-6 h，作为 PCR模板，W目的基因上下游引物进行PCR扩增。PCR扩增后的产物用化nf I (化KaRa)进行酶 切分析。
[0032] 酶切体系 30化 Hinf I： 1 yL 缓冲液Buffer M: 3 yL 模板： 10化 dd出0: 16 yL 37°C，酶切2 h，用2%的琼脂糖凝胶电泳进行鉴定分析，共获得4种不同的酶切图谱（图2 泳道1-4)，之后进行测序分析，并对测序结果进行分类，结果表明该4种不同的酶切图谱对 应的DNA片段分别属于cry9Da(与cry9Da4相似性为100%，登录号：GQ249297.1)、c巧犯a(与 C巧9Ea9相似性为99%，登录号：1^51495.1)、(3巧犯6(与(3巧犯62相似性为99%，登录号：