专利名称：Tt1基因在植物遗传转化筛选中的应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及植物基因工程领域，具体涉及TTl基因作为筛选标记基因在植物遗传 转化中的应用。
背景技术：
自1983年第一株转基因植物诞生以来，全球抗虫、抗病、抗除草剂和品质改良的 棉花、水稻、大豆、玉米等转基因植物已达120多种，种植面积9000万公顷。转基因技术的 发展能够将具有优良性状的目的基因导入生物基因组中，从而使得其遗传性状得到改良。目前基因转移在技术上还存在着一些限制因素，其中之一就是转化过程中只有少 数细胞能够吸收外源DNA并整合进基因组中，而大多数细胞仍是未转化的。因此，目的基因 的引入常常需要筛选标记基因，从而赋予受体生物以特定的选择性标记，以便于识别和鉴 定转基因生物。现在广泛用于选择的标记基因主要有2大类一类是抗生素抗性基因，包括 新霉素磷酸转移酶基因(npt)、潮霉素磷酸转移酶基因(hpt)、卡那霉素抗性基因(npt II) 等；另一类是除草剂抗性基因，包括草丁膦抗性基因(bar)、草甘膦抗性基因(epsp)等。然而，当获得一个真正的转基因植株后，筛选标记基因就失去其功能和意义，这些 标记基因在转化后仍保留在生物体内，其继续表达的产物也会带来一些不良后果，具有许 多潜在的危害第一安全性。筛选标记基因中抗生素抗性标记基因的安全问题，主要是指其抗性 基因转移所导致的在环境中的传播。另外，转基因动、植物中的标记基因是否会通过食物在 肠道中水平转移至微生物，从而影响抗生素治疗的有效性。对除草剂抗性基因的担忧主要 是因为这类基因可能存在杂草化等生态学风险。尽管风险评估报告对一些筛选标记基因提 供了安全保证，公众对安全的关心已经大大阻碍了转基因作物的商品化，而且对其他标记 基因及其产物的风险评估是一个既昂贵又繁琐的过程。第二影响转化细胞再生。当细胞被转化后，需要从非转化细胞中鉴别并分离出转 化细胞。筛选标记基因同目的基因共同转化，然后将转化后的细胞培养在含有抗生素或除 草剂的培养基上，转化细胞能够存活并生长，而非转化细胞不能生长而最终死亡。非转化细 胞在逐渐凋亡过程中能够分泌毒素或生长抑制剂，阻碍营养物质向转化细胞的运输，进而 影响转化细胞的增殖及分化。第三影响多重转化。通过基因转移技术将多个外源目的基因导入植物体内，已成 为育种学家们的研究目标。标记基因的使用虽然有助于转化细胞的筛选，但影响多重转化。 在细胞第一次转化中使用了某一特殊的标记基因，在随后的转化中就要使用不同的标记基 因。尽管转基因植物能给人类带来了巨大的利益，但目前仍有很多人担心转基因植物 可能对生态环境构成威胁，转基因食品也可能对人类健康造成危害。为了寻找新的、安全 的筛选标记代替抗生素基因、抗除草剂基因，以甘露糖(磷酸甘露糖异构酶基因pmi)、木糖 (木糖异构酶基因xylA)为筛选剂的转化系统应运而生。其原理是因这些糖类不被一般植物细胞吸收而使非转基因细胞的生长受阻，使转基因细胞分离出来。虽然这些糖类对生物 细胞无害且易于被微生物分解，避免了抗生素的副作用，但用于遗传转化时，不同植物所需 筛选剂浓度差别很大，且pmi本身就存在于一些豆科植物中外，可用其筛选的植物范围较 小，在绝大多数植物上的效果还有待验证。因此，为了消除人们的这种担忧，如何利用安全、有效的筛选标记基因进行外源目 的基因的筛选，已经成为近年来植物转基因研究中的一个热点，也是今后基因工程研究的 重要方向之一，目前本领域需要提供新的有效方案。
发明内容
本发明要解决的技术问题是为转基因植物的筛选提供一种新的有效选择。本发明解决技术问题的方案是提供了 TTl基因在植物遗传转化筛选中的应用。其中，上述TTl基因具有如下核苷酸序列(1)如SEQ ID NO. 1所示的核苷酸序列或其简并序列；或O)在⑴限定的核苷酸序列中经过取代、缺失或添加至少一个核苷酸衍生所 得的核苷酸序列，且与SEQ ID NO. 1的序列编码功能相同或相似的多肽。进一步的，上述⑵在⑴限定的核苷酸序列中经过取代、缺失或添加1个或几 个(10个以内)核苷酸衍生所得的核苷酸序列，且与SEQ ID NO. 1的序列编码功能相同或 相似的多肽。本发明还提供了一种植物遗传转化筛选方法。该方法包括以下步骤a、将TTl基因可操作地连于载体上的表达调控序列后，形成含有所述TTl基因的 重组载体；b、将步骤a中的重组载体转入目标植物细胞中；C、经使用逆境条件进行筛选获得转化细胞。另一方面，该方法还可以包括以下步骤a、将TTl基因可操作地连于载体上的表达调控序列后，形成含有所述TTl基因的 重组载体；b、将步骤a中的重组载体转入目标植物细胞中；C、然后将目标植物细胞培育成植株或其后代，所述植物的后代包括植物种子及植 物组织，经使用逆境条件进行筛选获得转化体。上述的逆境筛选是指在目标植物的野生型不能承受而转入TTl基因的转基因型 能够承受的高温、低温或高盐的至少一种逆境下进行筛选，能承受逆境并存活的表明为转 化体，即转基因阳性。本发明还提供了一种基因工程用载体。该基因工程用载体使用TTl基因作为筛选 标记基因。本发明的上述逆境筛选可以在愈伤组织培养阶段进行，也可以在待筛选植物的种 子萌发阶段进行。在愈伤组织分化、生根阶段或分化生根后的进行筛选时，将转化后的愈伤组织放 入培养基中在逆境条件下筛选，筛选压力应按照由低到高的原则，随着筛选次数的增加，筛 选压力的强度也逐渐增加；如第一次筛选效果较差时(转基因与非转基因不能区分，都生长良好)，第二次筛选可适当提高筛选压力浓度。筛选数天后可见有的愈伤组织逐渐分化 出叶苗或根系，或逐渐长大，表明此类愈伤组织转入重组载体，即为转基因阳性；而有的愈 伤组织逐渐褐化或透明，或停止生长，则表明此类愈伤组织耐逆境能力较低，未转入重组载 体，即为转基因阴性。比如高盐(NaCl)逆境条件进行筛选时，以在愈伤组织分化、生根阶段或分化生根 后的筛选阶段，将转化后的愈伤组织放入含有5 40mg/L NaCl的培养基(培养基种类以具 体的待筛选物种确定)中筛选，筛选浓度应按照由低到高的原则，随着筛选次数的增加，筛 选浓度也逐渐增加；第一次筛选效果较差时(转基因与非转基因不能区分，都生长良好)， 第二次筛选可适当提高NaCl浓度。筛选数天后可见有的愈伤组织逐渐分化出叶苗或根系， 或逐渐长大，表明此类愈伤组织转入重组载体，即为转基因阳性；而有的愈伤组织逐渐褐化 或透明，或停止生长，则表明此类愈伤组织耐盐性较低，未转入重组载体，即为转基因阴性。 生长良好的愈伤组织可转入不含NaCl的培养基中恢复生长，待叶片及根系发育完全后移 栽，获得转基因植株。在种子萌发阶段进行筛选时将待筛选植物的种子放入逆境条件中，可见有些种 子逐渐发芽，并开始生长，表明此类种子为转基因阳性；而有些种子不能发芽，或即使发芽 也不能生长，则表明此类种子为转基因阴性。发芽并能继续生长的种子可移入正常环境中 生长，获得转基因植株。比如高盐(NaCl)逆境条件进行筛选时，将转基因植物的种子放入含0. 5 2g/L NaCl的水或培养基中，在常规种子生长的光照、温度、湿度条件下生长5 10天，可见有些 种子逐渐发芽，并开始生长，表明此类种子为转基因阳性；而有些种子不能发芽，或即使发 芽也不能生长，则表明此类种子为转基因阴性。发芽并能继续生长的种子可移入正常环境 中生长，获得转基因植株。本发明中所述的TTl基因，其基本核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO. 1所示，该 基因来源于十字花科(Brassicaceae，也名Cruciferae)中芥属(Brassica)的植物油菜 (Brassicanapus)。在本发明中，“在SEQ ID NO. 1中的核苷酸序列经过取代、缺失或添加至少一个核 苷酸衍生序列”的TTl基因序列一般是指编码具有SEQ ID NO. 1所编码的蛋白活性的多肽 的核苷酸序列及其简并序列。该简并序列是指所述序列中有一个或多个密码子被编码相同 氨基酸的简并密码子所取代后而产生的序列。由于密码子的简并性，所以与SEQ ID NO. 1同 源性低至约89%的简并序列也能编码出SEQ ID NO. 1所编码的多肽的序列。另外，“在SEQ ID NO. 1中的核苷酸序列经过取代、缺失或添加至少一个核苷酸衍生序列”的含义还包括能 在中度严谨条件下，更佳的在高度严谨条件下与SEQ ID NO. 1核苷酸序列杂交的核苷酸序 列。该术语还包括与SEQ ID NO. 1中的核苷酸序列的同源性至少80%，较佳地至少89%， 更佳地至少90 %，最佳地至少95 %的核苷酸序列。在本发明中的相同功能是指提高植物的 抗逆性能。该术语还包括能编码具有与天然的SEQ ID NO. 1所编码的相同功能的蛋白的SEQ ID NO. 1中开放阅读框序列的变异形式。这些变异形式包括(但并不限于)若干个(通常 为1 90个，较佳地1 60个，更佳地1 20个，最佳地1 10个)核苷酸的缺失、插入 和/或取代，以及在5’和/或3’端添加数个(通常为60个以内，较佳地为30个以内，更佳地为10个以内，最佳地为5个以内)核苷酸。比如SEQ ID NO :3所示的核苷酸序列，其 编码的多肽也能提高植物的抗逆性能。本发明所述重组载体，是将TTl基因插入到载体中获得，上述载体可选用本领域 已知的各种载体，尤其是真核表达载体(如PBI121或pCAMBIA2301)。本发明可用上述重组 载体转化宿主植物细胞，筛选获得转化细胞。然后使用各种上述的逆境条件进行筛选。本发明中所述的“可操作地连于”表示如下情况即线性DNA序列的某些部分能够 影响同一线性DNA序列其他部分的活性。例如，如果信号肽DNA作为前体表达并参与多肽 的分泌，那么信号肽(分泌前导序列)DNA就是可操作地连于多肽DNA ；如果启动子控制序 列的转录，那么它是可操作地连于编码序列；如果核糖体结合位点被置于能使其翻译的位 置时，那么它是可操作地连于编码序列。一般，“可操作地连于”意味着相邻，而对于分泌前 导序列则意味着在阅读框中相邻。本发明的有益效果在于本发明提供了筛选标记基因在植物遗传转化中的应用。 将TTl基因作为筛选标记基因，用于筛选的成本低，而且在转化目的基因的同时使植物获 得了另一个逆境抗性，这使得筛选基因同时具有一定的应用价值，且该应用价值对于生物 没有负面影响。
图1 愈伤组织在含氯化钠的分化培养基上生长，左管为未转入TTl基因的愈伤 组织；右管为转入TTl基因的愈伤组织，右管具有一定的耐盐性，即能长出叶片(如右管所 示)°图2 转基因水稻植株中TTl基因的PCR电泳检测结果。从左至右依次为阳性对 照(+)，待检测植株1 7号，野生型阴性对照(_)。图3 愈伤在筛选培养基上生长情况(若确实转入TTl基因，该愈伤可长出愈伤 芽，黑圈中所示)。图4 转基因油菜植株中TTl基因的PCR电泳检测结果。从左至右依次为阳性对 照(+)，待检测植株1 8号，野生型阴性对照(_)。
具体实施例方式
下面通过实施例并结合附图，进一步说明而不限定本发明。下述实施例中，凡未注明具体实验条件的，均为按照本领域技术人员熟知的常规 条件，例如 Sambrook，Russell 的分子克隆实验室手册(New York Co Id Spring Harbor LaboratoryPress, 1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。下述实施例中，所 用农杆菌(Agrobacterium tumefaciensp)采用章鱼碱型菌系的LBA4404菌株；大肠杆菌 (E. coli)采用DH5a菌株，菌株均购自于Qiagen公司。载体pBI121购自于Clontech公 司。其余化学实际均为市售分析纯。下述实施例中，“SEQ ID N0. 1”单独出现时，本领域技 术人员可理解1其为“SEQ IDN0. 1所示核苷酸序列”的简称。实施例一 TTl基因的克隆及过量表达重组载体的构建1、TTl基因的克隆以油菜中的atp6(genebank gi :89279377)基因为诱饵蛋白，根据酵母双杂交方法(见Clontech公司所公开的资料)，筛选到油菜中的一个EST序列(SEQ ID N0:2所示)， 再根据这段筛选到的序列，通过5’RACE (见Takara公司所公开的资料)的方法获得本发明 所述基因，其核苷酸序列如序列表中SEQ ID N0:1所示。根据SEQ ID NO 1所示核苷酸序列设计引物，上游引物(SEQID NO. 3) :5，-ATGTCGGATGATTTGAGTTTATG-3，，下游引物(SEQID NO. 4) :5，-TCAGACTGGTGTTGGGTTGGATAT-3，。用TRIzoI法提取油菜RNA (见hvitrogen公司公开资料)反转录得到cDNA (见 Promega公司公开的反转录试剂盒资料)。经PCR从油菜cDNA中扩增SEQ ID NO 1所示的 核苷酸序列。对PCR产物纯化(见Qiagen公司所公开的PCR产物纯化资料)，经测序验证， 得到序列SEQ ID NO 1的基因片段。2、TTl过量表达重组载体的构建根据SEQ ID NO 1所示核苷酸序列设计引物，上游引物(SEQID NO. 5) :5，-CGCGGATCCATGTCGGATGATTTGAGTTTATG-3，，下游引物(SEQID NO. 6) :5，-CCGGAGCTCTCAGACTGGTGTTGGGTTGGATAT-3，。经PCR，从油菜cDNA中扩增完整的SEQ ID NO 1所示的核苷酸序列。对PCR产物 纯化(见Qiagen公司所公开的资料)，然后用BamHl与Mcl酶切，胶回收，与载体pBI121 连接(连接位点=BamHl与Mel)，获含SEQ ID NO 1的过量表达重组质粒。实施例二水稻遗传转化及NaCl筛选愈伤组织1、转化载体的构建采用的水稻材料(Oryza sativa L.)为粳稻日本晴，为四川农业大学水稻研究所 保存。农杆菌(Agrobacterium tumefaciensp)采用章鱼碱型菌系的LBA4404菌株；大肠杆 菌(E. Coli)采用DH5 α菌株。通过冻融法将含SEQ ID NO. 1的过量表达重组质粒转入大肠杆菌DH5 α中繁殖， 提取质粒(见Qiagen公司公开资料)，将含SEQ ID NO. 1的过量表达重组质粒转入农杆菌 LBA4404中，涂平板形成单菌落待用。2、外植体培养——成熟胚愈伤组织的诱导和继代选取外观健康，饱满，无病斑的成熟水稻种子脱去颖壳，75%酒精中浸泡1分钟， 用无菌水冲洗干净后，0. 升汞灭菌20分钟，再用无菌水冲洗干净。在超净工作台上晾 干，接种到诱导培养基(NB+2，4-D 2. 5mg/L)上，于^TC下暗培养。2周后统计愈伤组织的 诱导情况并进行继代，以后每2周继代一次。3、工程菌的活化与浸染在平板上挑取农杆菌单菌落，经PCR检测(上游引物(SEQ ID N0. 7) :5，-ATTTCATTTGGAGAGAACACGG-3，，下游弓| 物(SEQ ID N0. 8) 5’ -TCAGACTGGTGTTGGGTTGGATAT-3’)，确定转基因阳性菌落，放在IOmlYEP液体培养基(酵 母提取物IOg+胰蛋白胨5g+氯化钠IOg+加水至IL+利福平50 μ g/mL)中，250r/min，28°C 活化培养过夜。取过夜培养液300 μ 1于:3ml YEP液体培养基中，在250r/min，28°C的条件 下遮光振动培养，至菌液达0D600 = 0. 5左右，即可用于转化。上述含目的基因的菌液在无菌的50ml的离心管中以5000r/min离心5分钟后回 收菌体，用30ml的NBCO (NB+2，4_D 2. 0mg/L+乙酰丁香酮100 μ mol/L)液体培养基重悬含目的基因的菌体。选择生长状态良好的，颗粒状胚性愈伤组织用无菌镊子将其适当夹小，创 造伤口，然后放在菌液中浸泡，一般浸染时间为10 30min，之后放入有滤纸的平皿中吸干 多余菌液。4、共培养与NaCl筛选将吸干菌液的愈伤置于NBC0(NB+2，4-D 2. Omg/L+乙酰丁香酮100 μ mol/L)固体 培养基上，22 25°C暗培养2 3天，直至愈伤组织上出现少量菌斑为止。将共培养的愈 伤组织放在广口瓶中，用无菌水清洗至清澈，再浸泡于含头孢霉素500mg/L NBCO液体培养 基中30 60min，将处理后的愈伤组织用无菌滤纸吸干。将愈伤组织接种到预分化培养基(NB+KTlmg/L+NAA 0. 25mg/L)上，暗培养10 15 天。再转到分化培养基(NB+KTlmg/L+NAA 0. 25mg/L+6-BAlmg/L+NaCl 12mg/L)上，25 27°C光照培养(12小时/天)约1 2个月。如果转入TTl基因，则该愈伤具有一定的耐盐 性，即能长出叶片(见图1)。之后将长出叶片幼苗转到生根培养基(NB+NAA 0. 25mg/L+NaCl 20mg/L)上培养，当根长到2cm左右高时取出，洗净根部的培养基，转入盆栽。5、转基因水稻的PCR检测取上述步骤筛选出的转基因阳性水稻植株新鲜叶片，抽提总DNA(见Qiagen公司 所公开的资料)，以提取的DNA做模板，进行PCR检测。上游引物(SEQID NO. 7) :5，-ATTTCATTTGGAGAGAACACGG-3，下游引物(SEQID NO. 8) :5，-TCAGACTGGTGTTGGGTTGGATAT-3，PCR反应完成，在琼脂糖凝胶上电泳检测，有目标条带出现(见图2)，表明目的基 因转化成功。实施例三油菜遗传转化及NaCl筛选转基因愈伤组织1、转化载体的构建采用的甘蓝型油菜(Brassica napus L)材料为蜀杂九号84100-18，为四川大学生 命科学院提供。农杆菌(Agrobacterium tumefaciensp)采用章鱼碱型菌系的LBA4404菌 株；大肠杆菌(E. Coli)采用DH5 α菌株。通过冻融法将含SEQ ID NO. 1的过量表达重组质粒转入大肠杆菌DH5 α中繁殖， 提取质粒(具体方法参见Qiagen公司公开的资料)，将含SEQ ID NO. 1的过量表达重组质 粒转入农杆菌LBA4404中，涂平板形成单菌落待用。2、下胚轴的预培养选取籽粒饱满的甘蓝型油菜种子，4°C过夜春化后用70%乙醇浸泡30s lmin， 0. 1 %的升汞(HgC12)溶液浸泡8 lOmin，无菌水冲洗5次，滤纸吸干，接种于MS固体培养 基上，24°C暗培养2 5天，然后取出光照l^i/d继续萌发7 10天。取5 7cm无菌苗下胚轴，将油菜下胚轴切成7mm左右小段，分散均勻置于预培养 基(MS+ang/L 6-BA+lmg/L 2，4_D+2. 5mg/LAgN03+19. 62mg/L 乙酰丁香酮)中进行 2 5 天 的预培养。3、下胚轴的浸染及共培养在平板上挑取农杆菌单菌落，经PCR检测(上游引物(SEQ ID N0. 7) :5，-ATTTCATTTGGAGAGAACACGG-3，，下游弓| 物(SEQ ID N0. 8) 5’ -TCAGACTGGTGTTGGGTTGGATAT-3’)，确定转基因阳性菌落，将SEQ ID NO. 1过量表达重组质粒的农杆菌接种于含40mg/L利福平LB液体培养基中，摇菌过夜后收集菌体，重悬于 含100mg/L乙酰丁香酮的MS液体培养基中至0D600 = 0. 4 0. 6，摇菌1 2h。将经预培养的健壮的油菜下胚轴分别浸入含SEQ ID NO. 1的过量表达重组质粒的 农杆菌菌液中30s lmin，之后用无菌滤纸迅速吸干多余的菌液，将油菜下胚轴平放于共 培养基(MS+2mg/L6-BA+lmg/L2,4-D+2. 5mg/LAgN03+19. 62mg/L 乙酰丁香酮)上，培养 2 天。4、NaCl筛选培养与诱导将共培养后的油菜下胚轴分别接入分化培养基(MS+ang/L 6-BA+lmg/L 2， 4-D+2. 5mg/LAgN03+19. 62mg/L乙酰丁香酮)中继续培养。每2周更新培养基一次，培养4 周，得到愈伤芽。将愈伤芽在筛选培养基(MS+ang/L6-BA+2. 5mg/L AgN03+NaCl 10mg/L)上，若确 实转入TTl基因，该愈伤可长出愈伤芽(见图3)。待芽长至4 6片真叶时，将芽从愈伤 组织中切下，移入生根培养基(1/2MS+0. 15mg/L NAA+250mg/L头孢霉素+NaCl 15mg/L)中。 待再生苗根系生长发达时，然后将培养罐盖揭开，在培养室中炼苗2 3d。炼苗后将含SEQ IDN0. 1的过量表达转基因植株分别在生根培养基(1/2MS+0. 15mg/LNAA)上发育出完整根 系，将其转入盆栽。5、转基因油菜的PCR检测将上述步骤筛选出的转基因阳性油菜植株新鲜叶片，各取叶片少量抽提总 DNA (见Qiagen公司所公开的资料)，以提取的DNA做模板进行PCR检测。上游引物(SEQID NO. 7) :5，-ATTTCATTTGGAGAGAACACGG-3，下游引物(SEQID N0. 8) :5，-TCAGACTGGTGTTGGGTTGGATAT-3，PCR反应完成，在琼脂糖凝胶上电泳检测，有目标条带出现(见图4)，表明目的基 因转化成功。实施例四油菜遗传转化及热激筛选转基因油菜种子1、转化载体的构建采用的甘蓝型油菜(Brassica napus L)材料为蜀杂九号84100-18，为四川大学生 命科学院提供存。农杆菌(Agrobacterium tumefaciensp)采用章鱼碱型菌系的LBA4404 菌株；大肠杆菌(E. Coli)采用DH5 α菌株。通过冻融法将含SEQ ID NO. 1的过量表达重组质粒转入大肠杆菌DH5 α中繁殖， 提取质粒(见Qiagen公司公开资料)，将含SEQ ID NO. 1的过量表达重组质粒转入农杆菌 LBA4404中，涂平板形成单菌落待用。2、下胚轴的预培养选取籽粒饱满的甘蓝型油菜种子，4°C过夜春化后用70%乙醇浸泡30s lmin， 0. 1 %的升汞(HgC12)溶液浸泡8 lOmin，无菌水冲洗5次，滤纸吸干，接种于MS固体培养 基上，24°C暗培养2 5天，然后取出光照l^i/d继续萌发7 10天。取5 7cm无菌苗下胚轴，将油菜下胚轴切成7mm左右小段，分散均勻置于预培养 基(MS+ang/L 6-BA+lmg/L 2，4_D+2. 5mg/LAgN03+19. 62mg/L 乙酰丁香酮)中进行 2 5 天 的预培养。3、下胚轴的浸染及共培养在平板上挑取农杆菌单菌落，经PCR检测(上游引物(SEQ IDNO. 7) :5，-ATTTCATTTGGAGAGAACACGG-3，，下游弓| 物(SEQ ID NO. 8) 5’ -TCAGACTGGTGTTGGGTTGGATAT-3’)，确定转基因阳性菌落，将SEQ ID NO. 1过量表达重组 质粒的农杆菌接种于含40mg/L利福平LB液体培养基中，摇菌过夜后收集菌体，重悬于 含100mg/L乙酰丁香酮的MS液体培养基中至0D600 = 0. 4 0. 6，摇菌1 2h。将经预培养的健壮的油菜下胚轴分别浸入含SEQ ID NO. 1的过量表达重组质粒的 农杆菌菌液中30s lmin，之后用无菌滤纸迅速吸干多余的菌液，将油菜下胚轴平放于共 培养基(MS+2mg/L6-BA+lmg/L2,4-D+2. 5mg/LAgN03+19. 62mg/L 乙酰丁香酮)上，培养 2 天。4、筛选培养与诱导将共培养后的油菜下胚轴分别接入分化培养基(MS+ang/L 6-BA+lmg/L 2， 4-D+2. 5mg/LAgN03+19. 62mg/L乙酰丁香酮)中继续培养。每2周更新培养基一次，培养4 周，得到愈伤芽。将愈伤芽在筛选培养基(MS+ang/L 6-BA+2. 5mg/LAgN03)上，待芽长至4 6片真 叶时，将芽从愈伤组织中切下，移入生根培养基(1/2MS+0. 15mg/LNAA+250mg/L头孢霉素) 中。待再生苗根系生长发达时，然后将培养罐盖揭开，在培养室中炼苗2 3d。炼苗后将 含SEQ IDN0. 1的过量表达转基因植株分别在生根培养基(1/2MS+0. 15mg/LNAA)上发育出 完整根系，将其转入盆栽培养，收种备用。5、转基因油菜种子的热激筛选选取转基因油菜种子各100粒，放入培养皿中，加水4°C春化过夜。之后将种子放 入盛水的EP管中，置于46°C水浴锅中热激池，之后将种子平铺于垫有浸润滤纸的培养皿 中，待观察。约7天后，将可发芽的种子移入土壤中继续生长，待长至3-4片真叶时，进行 PCR检测。6、转基因油菜的PCR检测将上述步骤筛选出的油菜植株新鲜叶片，各取叶片少量抽提总DNA(见Qiagen公 司所公开的资料)，以提取的DNA做模板进行PCR检测。上游引物(SEQID N0. 7) :5，-ATTTCATTTGGAGAGAACACGG-3，下游引物(SEQID N0. 8) :5，-TCAGACTGGTGTTGGGTTGGATAT-3，PCR反应完成，在琼脂糖凝胶上电泳检测，有目标条带出现，表明目的基因转化成 功，筛选出的植株确为转基因阳性植株。
权利要求
1.TTl基因在植物遗传转化筛选中的应用。
2.根据权利要求1所述的用途，其特征在于所述TTl基因具有如下核苷酸序列(1)如SEQ ID NO. 1所示的核苷酸序列或其简并序列；或O)在(1)限定的核苷酸序列中经过取代、缺失或添加至少一个核苷酸衍生所得的 核苷酸序列，且与SEQ ID NO. 1的序列编码功能相同或相似的多肽。
3.植物遗传转化筛选方法，其特征在于包括以下步骤a、将TTl基因可操作地连于载体上的表达调控序列后，形成含有所述TTl基因的重组 载体；b、将步骤a中的重组载体转入目标植物细胞中；c、经使用逆境条件进行筛选获得转化细胞。
4.植物遗传转化筛选方法，其特征在于包括以下步骤a、将TTl基因可操作地连于载体上的表达调控序列后，形成含有所述TTl基因的重组 载体；b、将步骤a中的重组载体转入目标植物细胞中；C、然后将目标植物细胞培育成植株或其后代，所述植物的后代包括植物种子及植物组 织，经使用逆境条件进行筛选获得转化体。
5.根据权利要求3或4所述的方法，其特征在于所述TTl基因具有如下核苷酸序列(1)如SEQ ID NO. 1所示的核苷酸序列；或O)在(1)限定的核苷酸序列中经过取代、缺失或添加至少一个核苷酸衍生所得的 核苷酸序列，且与SEQ ID NO. 1的序列编码功能相同或相似的多肽。
6.根据权利要求3或4所述的方法，其特征在于所述的逆境筛选是指在目标植物的 野生型不能承受而转入TTl基因的转基因型能够承受的高温、低温或高盐的至少一种逆境 下进行筛选，能承受逆境并存活的表明为转化体，即转基因阳性。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于所述的逆境筛选在待筛选植物的愈伤组 织培养阶段进行或者在待筛选植物的种子萌发阶段进行。
8.基因工程用载体，其特征在于使用TTl基因作为筛选标记基因。
全文摘要
本发明属于生物技术领域，具体涉及TT1基因在植物遗传转化筛选中的应用。本发明要解决的技术问题是为转基因植物的筛选提供一种新的有效选择。本发明解决技术问题的方案是提供了TT1基因在植物遗传转化筛选中的应用。实验证明，将TT1基因作为筛选标记基因，用于筛选的成本低，而且在转化目的基因的同时使植物获得了另外的逆境抗性，这使得筛选基因同时具有一定的应用价值，且该应用价值对于生物没有负面影响，具有很好的应用前景。
文档编号C12Q1/02GK102140474SQ20101055221
公开日2011年8月3日 申请日期2010年11月19日 优先权日2010年1月28日
发明者杨毅 申请人:四川贝安迪生物基因工程有限公司