一种用于大肠杆菌基因敲入的负筛选标记的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及基因工程领域，具体是涉及一种重组工程方法将待目的基因敲入至大 肠杆菌基因组的负筛选标记。
【背景技术】
[0002] 基因表达是现代生物学的一个重要手段，是获得治疗性药物蛋白和催化用酶等应 用领域的必需手段。在基础研究领域，基因表达也是研究基因和蛋白的功能和研究生物体 代谢和调控等必不可少的策略。常规的基因表达常常是将目的基因克隆在质粒上再转化至 宿主菌（最常见的是大肠杆菌），质粒以游离于菌体染色体的形式进行复制，一般常在诱导 之下基因表达。虽然基于质粒的表达最为常见，但基于染色体的基因表达呈现出一些独特 的优点，如无需抗生素的压力以维持质粒的存在，可同时进行多个基因的表达而避免选择 质粒和克隆至质粒的困难。在某些情况之下，由于目的基因的毒性而不能克隆在常为多拷 贝的质粒之上，而基于染色体的表达由于是单拷贝的形式，可以避免毒性的问题。
[0003] 将基因敲入至大肠杆菌基因组常常采用正筛选标记和负筛选标记相结合的方法。 正筛选标记为抗生素抗性基因。目前所采用的负筛选标记有着诸多的缺点，遗传学中最常 用的负筛选标记为sacB基因。sacB基因编码的蔗糖6-果糖基转移酶催化蔗糖而生成对菌 株有毒性的聚鹿糖，故含有sacB的菌株不能生存。但sacB较大（1. 7kb)，sacB和抗生素抗 性基因组成基因盒后，一般在2. 5kb以上，难以进行PCR扩增或难以获得足够的量用于转化 实验，且当此基因盒整合至基因组之后，对所得菌株进行基因型分析也难以扩增出全长进 行分析，而只能设计针对sacB或抗性基因的引物进行基因型分析。另外，常有高达10%的 细胞对sacB基因产物表现出随机的抗性，即为背景克隆。这些不足均制约了sacB基因作为 负筛选标记的使用。其他的一些负筛选标记，如thyA、galK、rpsL、upp和pryF等，需要首先 对宿主菌进行突变得到突变株，再以此突变菌株出发进行基因敲入，这样一方面增加了工 作量，又有着遗传操作的限制，且常常需要额外添加某些生长元素以维持突变菌株的生存。 鉴于此，开发简便、实用和高效率的负筛选标记具重要意义。
【发明内容】
[0004] 为开发适用简洁和高效的负筛选标记用于大肠杆菌基因组的敲入，从而为目的基 因基于染色体的表达提供平台以及为研究基因和蛋白的功能奠定基础。
[0005] 本发明公开了plac启动子驱动的毒性基因ccdB作为大肠杆菌基因敲入的负筛选 标记的应用。
[0006] 本发明提供了一种新型的负筛选标记，即plac启动子驱动的毒性基因ccdB。本发 明所涉及的基因敲除的方法，包括如下两个关键的步骤：
[0007] (1)第一步是自含plac-ccdB-aacCl模板质粒PLS3161扩增含有同源臂的线性 DNA片段，电转化至表达重组酶的大肠杆菌。在庆大霉素筛选之下，重组酶催化同源臂之间 的同源重组而将此DNA片段整合至大肠杆菌基因组。
[0008] (2)第二步是利用相同的同源臂扩增目的DNA片段，将目的DNA片段电转化表 达重组酶的第一步所得菌株，在异丙基-β-D-硫代半乳糖苷的筛选之下，ccdB表达， 其毒性作为负筛选标记的特征，重组酶催化同源臂之间的同源重组，外源DNA片段取代 plac-ccdB-aacCl基因盒而实现基因敲入。
[0009] 本发明所使用的、包含plac-ccdB-aacCl基因盒的模板质粒pLS3161是由如下方 法获得：以PMK2010为模板，SEQIDNO. 1和SEQIDN0. 2为引物PCR扩增得到363bp的 plac的3'端和ccdB基因，以之为模板，SEQIDN0. 3和和SEQIDN0. 2为引物PCR扩增得 到 414bp完整的plac和ccdB基因。以pBAD322G为模板，SEQIDNO. 4 和SEQIDNO. 5 为 引物PCR扩增得到757bp的aacCl。414bp的plac-ccdB片段和757bp的aacCl片段均以 Xhol酶切，两个片段和pKD4以T4DNA聚合酶处理所得的钝端载体以T4DNA连接酶进行连 接。连接产物转化含有pir基因和gyrA462突变基因型的大肠杆菌宿主菌DB3. 1Apir的 感受态细胞，在50μg/ml的氨苄青霉素和25μg/ml的庆大霉素抗性筛选之下得到重组克 隆。重组克隆以酶切和测序进行验证得到PLS3161。
[0010] ccdB基因是来源于F质粒的毒性蛋白基因（包含ccdB基因的大肠杆囷质粒F DNA的GenBank收录号为NC_002483,其中ccdB基因的序列位点为D616_p97105)，所编码 的CcdB蛋白作用于DNA回旋酶催化周期的不同阶段。DNA回旋酶是一种独特II型拓扑异 构酶，作用底物为共价闭环DNA，使DNA表现出复制所必须的负超螺旋构型。CcdB通过抑制 DNA回旋酶的活性而对细胞表现出毒性而抑制细胞的生长。F质粒同时含有ccdA基因，用 于解除ccdB基因的毒性。
[0011] 本发明中将ccdB置于plac启动子之下用作负筛选标记来使用。当plac-ccdB整 合至大肠杆菌基因组后，基因组上的lacl基因和plac-ccdB组成了一个严谨的调控系统。 lacl基因所编码的调节蛋白LacI抑制plac启动子的活性，此时ccdB不能表达故不表现 出对菌株的毒性；而当环境中存在IPTG时，IPTG和调节蛋白Lacl结合，Lacl抑制plac的 活性被解除，plac启动子得以驱使下游的ccdB基因表达。ccdB编码的毒性蛋白对菌株有 毒性，菌体细胞不能生存。此时，重组酶催化的同源片段之间发生同源重组，外源基因取代 plac-ccdB的菌株得以存活，这样就实现了目的基因的敲入。乳糖操纵元的plac启动子在 大肠杆菌中不同的属种的基因组中均含有。目前几乎所用的大肠杆菌基因组中均含有lacl 基因，因此plac-ccdB具有极好的宿主菌的适用性。如某种大肠杆菌宿主菌已携带庆大霉 素抗性基因，则可将aacCl置换为其他的抗性基因进行敲入实验。
[0012] plac-ccdB-aacCl基因盒的全长只用1165bp，大大小于常用的sacB-neo等基因 盒，因此极易扩增得到目的PCR产物（S卩用于电转化的线性底物DNA)。又因为线性底物DNA 转化至MG1655和DH10B等不含Pir基因的宿主菌株，不会带来质粒转化的背景干扰，故所 得的PCR产物无需凝胶回收。凝胶回收一方面造成DNA较大的损失，一方面由于紫外线对 DNA的照射，DNA的转化效率急剧降低。筛选基因敲入菌株时只需在固体筛选培养基中含 ImMIPTG，因此方法简便快捷，任何诱导表达重组酶的质粒均可使用。
[0013] 本发明运用重组工程方法来实现plac-ccdB-aacCl两侧的同源臂和基因组上同 源片段之间的同源重组。重组工程是利用λ-噬菌体来源的重组酶催化同源片段之间的同 源重组进行DNA克隆和修饰的一种DNA操作手段。重组酶基因包含reda，redβ和redγ 基因。redα基因编码5' 一3'DNA外切酶，外切酶作用于转化的双链线性DNA分子而得到 DNA单链分子；redβ基因编码单链结合蛋白，其结合在单链DNA上催化同源DNA分子之间 的重组；redγ基因编码Gam蛋白，Gam蛋白抑制内源性核酸酶对外源DNA片段的降解，利于 提高同源重组的效率。重组工程避免了繁琐的基因克隆等操作步骤，随着其应用的日趋广 泛，已逐渐成为常规的基因组操作手段。
[0014] 基因表达具有广阔的应用前景，在目的蛋白，治疗用蛋白药物、催化用酶和免疫治 疗等方面的有着多种应用。简便快捷和高效的基因敲入手段将极大地促进其基因组学和蛋 白质学等研究。本发明的负筛选标记所基因敲除手段可能成为通用的研究手段。
【附图说明】
[0015] 图1为含负筛选标记的plac-ccdB-aacCl基因盒用于目的基因敲入的示意图。
[0016] HA1和HA2分别表示左侧和右侧的同源臂，plac为由异丙基-β-D-硫代半乳糖苷 (IPTG)诱导的启动子，ccdB是来源于F质粒的毒性蛋白基因，aacCl是庆大霉素抗性基因。 首先以PLS3161为模板，设计的引物中含有HA1和HA2的序列，PCR扩增得到含有两侧为同 源臂的Plac-ccdB-aacCl。将此线性DNA片段转化至表达由λ-噬菌体来源的重组酶的大 肠杆菌细胞中，重组酶催化线性DNA片段中的同源臂和大肠杆菌基因组中的同源片段进行 同源重组，在庆大霉素的抗性筛选之下而获得Plac-ccdB-aacCl基因盒敲入至大肠杆菌基 因组的抗性菌株。其次，以含相同同源臂的引物扩增目的基因，转化至含Plac-ccdB-aacCl 基因盒、并诱导表达重组酶的大肠杆菌中，所得菌体铺布于含IPTG的筛选平板，IPTG诱导 ccdB表达而呈现毒性，表现出负筛选的功能。重组