改造谷氨酸棒杆菌和钝齿棒杆菌精氨酸合成途径中关键酶nagk来提高精氨酸产量的方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及改造谷氨酸棒杆菌和钝齿棒杆菌精氨酸合成途径中关键酶NAGK来提 高精氨酸产量的方法
【背景技术】
[0002] L-精氨酸是一种含有胍基的碱性氨基酸，在哺乳动物中是半必需或条件性必需氨 基酸。在谷氨酸棒杆菌和钝齿棒杆菌中，L-精氨酸的生物合成经历了 8个酶的催化过程（见 附图1)，其中argB基因所编码的乙酰谷氨酸激酶（N-acetyl-L-glutamatekinase，NAGK) 在此途径中扮演关键酶的角色，即此酶受到终产物精氨酸的反馈抑制，是合成精氨酸的瓶 颈。
[0003] 为解除或减轻精氨酸对关键酶的反馈抑制，相关科研工作者通过点突变方法对 argB基因进行改造，以达到在尽量不影响酶活性的基础上，降低其编码蛋白对精氨酸的敏 感性。如，Skanyan和Schendzielorz这两个课题组就分别构建了多个发生点突变的argB 基因，包括argBE19R、argB_、argB_NargBA49V'M54V、argBG2S7D、argBA49V'M5?等。将这些突变 基因分别克隆到表达载体后转入大肠杆菌中诱导表达，纯化的蛋白再进行酶活测定和精氨 酸的半抑制率（IC5。）测定，发现上述突变除argBH26E的酶活性下降较多，导致终产物产量下 降外，其余的突变酶活性都有不同程度的下降但都对产量有贡献，因为终产物的IC5。得到 了提高，且大部分的IC5。提高了 2-5倍。
[0004] 来源于谷氛酸棒杆菌（Corynebacteriumglutamicum)或纯齿棒杆菌 (Corynebacteriumcrenatum)的argB基因全长954bp，翻译的氨基酸残基为317个。可以看 到上述两个课题组的argB基因点突变主要位置在NAGK的N端，C端突变位点为268和287。 而本课题组发现在NAGK的C端311和312位置有两个连续的天冬氨酸，这与Niersbach等 报道的大肠杆菌精氨酸合成途径的负调控蛋白ArgR也在C端128和129位有两个连续的天 冬氨酸是一致的，且Niersbach等报道ArgR的128和129位是结合精氨酸的位点。因此，我 们推测NAGK的C端311和312这两个连续的天冬氨酸也是结合精氨酸的关键位点。据此我 们采用点突变的方法构建了突变的argBD311R'D312R(argBM2)基因和argBE19R'H26E'D311R'_(argB M4)基因，分别进行了表达和纯化后，测定酶活和IC5。，发现酶活性均有提高，argBM2的酶 活提高了 19. 5 %且IC5。提高了 1. 3倍，argBM4的酶活提高了 14. 6 %但1C5。提高了 3. 7 倍。综合比较，我们将argBM4基因替换到突变株钝齿棒杆菌基因组中，精氨酸产量提高了 26. 2%〇
【发明内容】
[0005] 本发明的目的在于提供改造谷氨酸棒杆菌和钝齿棒杆菌精氨酸合成途径中关键 酶NAGK来提高精氨酸产量的方法，从而提高精氨酸的产量。
[0006] 本发明是这样实现的，降低终产物精氨酸对关键酶NAGK的反馈抑制来提高谷氨 酸棒杆菌和钝齿棒杆菌精氨酸产量。其实现的技术步骤为，1、点突变argB基因的构建：通 过设计二对引物将上述突变位点分别引入argB基因，设计一对引物在5'端和3'端加上 Hindlll和Xbal限制性内切酶位点；分别通过PCR技术获得原始的argB基因和及argB M2 基因，并利用重叠PCR技术获得突变的argB M4基因，采用DNA纯化试剂盒纯化扩增产物， 再通过Hindlll和Xbal双酶切，将argB基因、argB M2基因和argB M4基因分别克隆至 PXMJ19质粒中，并将其分别热转至大肠杆菌BL21 (DE3)感受态细胞；
[0007] 2、诱导NAGK在大肠杆菌中高效表达：分别将3株不同的阳性菌接到新鲜的LB(含 氯霉素25μgmL4平板上37°C活化12h，再将单菌落接入5mL液体LB(含氯霉素25μg mL3培养基中，37°C180rpm培养12h;按照1%接种量将3株菌分别接入25mLLB(含氯 霉素25ygmL1)培养基中，37°C180rpm培养至0D= 0.5-0.6左右，加入250yL24mg mL1的异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷（Isopropylβ-D-Thiogalactoside，IPTG)后置于 30°C180rpm诱导表达8h，SDS-PAGE电泳检测表达情况；
[0008]3、测定NAGK酶活：将细胞超声破碎离心后获得的上清作为测定NAGK酶活 反应的粗酶液，酶活反应体积1.5mL，在反应体系中包括400yL40mMN-乙酰-L-谷 氨酸，150yL40mMMgCl2,75yL20mMATPNa2，150yL400mM盐酸羟氨，500yL200mM Tris-HCl(pH= 8. 0)及适量的粗酶液，其余体积用双蒸水补齐至1. 5mL，其中ATPNa2最后加 入以启动酶活反应；在37°C反应lh后加入0.5mL终止液（终止液组成：1000mMHC1，4%三 氯乙酸和5%FeCl3. 6H20)终止反应；最后13000rpm离心lOmin，取上清液测定上其中N-乙 酰-L-谷氨酸氧肟酸在0D540nm处的吸光值。N-乙酰-L-谷氨酸氧肟酸摩尔消光系数ε =456Lmol1cm1。酶活力单位定义为：一个NAGK酶活力单位（U)为在上述反应条件时， 每分钟生成1μmol的N-乙酰-L-谷氨酸氧肟酸所需的粗酶液的酶量；
[0009] 4、测定NAGK的IC5。:L-精氨酸对NAGK的抑制实验中酶活的测定过程与步骤3 一致，只是在NAGK反应体系中再添加了不同浓度的L-精氨酸，分别为0mM、0. 5mM、1.OmM、 1. 5mM、2. 0mM、2. 5mM、3. 0mM、3. 5mM、4. 0mM、4. 5mM、5. 0mM、5. 5mM、6.OmM。通过测定精氨酸不 同添加量的酶活作出NAGK活性随L-精氨酸浓度变化的曲线，根据曲线计算出其半抑制率 15(]值，I5(]的定义为：当反应酶液的酶活下降为初始酶活一半时反应液中添加的L-精氨酸 的浓度；
[0010] 5、突变的argB M4基因整合至基因组：综合比较，将突变的argB M4基因与自杀 载体pK18mobsacB连接后，通过电转法无痕取代钝齿棒杆菌中来源于大肠杆菌的argB基因 (钝齿棒杆菌中原始的argB基因已被来源于大肠杆菌的argB基因替换）。筛选的阳性整合 子通过摇瓶发酵观察到精氨酸的产量提高了26.2%。发酵培养基配方如下：葡萄糖120g/ L，玉米浆25g/L，硫酸铵45g/L，磷酸二氢钾(λ05g/L，MgS04·7Η20 (λ5g/L，30g/L CaC03;培 养条件为：30°C，250rpm，发酵120h。
[0011] 所述来源于谷氨酸棒杆菌和钝齿棒杆菌的argB基因编码蛋白NAGK的第311和 312位氨基酸残基发生了突变，并联合第19和26位氨基酸残基发生了突变；突变后酶活得 到了提高，且减轻了精氨酸对其反馈抑制。
[0012] 所述argB M4基因通过无痕取代技术整合至谷氨酸棒杆菌和钝齿棒杆菌基因组 中。
[0013] 本发明的技术效果是：本发明将来源于谷氨酸棒杆菌和钝齿棒杆菌的精氨酸生物 合成途径中关键酶NAGK编码基因argB进行点突变，使突变的NAGK对精氨酸的反馈抑制敏 感性降低，提高了酶活和IC5。值；将突变的argB M4置换至基因组中，使得精氨酸的产量得 到了提高。
【附图说明】
[0014]图1谷氨酸棒杆菌和钝齿棒杆菌精氨酸生物合成途径。
[0015] 图2为钝齿棒杆菌argB基因定点突变示意图。
[0016] 图3为原始的和点突变argB基因在大肠杆菌中诱导表达的SDS-PAGE图。
[0017]图4为L-精氨酸对NAGK、NAGKM2、NAGKM4的反馈抑制曲线。
[0018] 图5为L-精氨酸的产量和产率。
[0019] 在图3中，泳道1为E.coliBL21-pXMJ19上清；泳道2和4为E.coli BL21-pXMJ19-argB上清；泳道 3 为Ε·coliBL21-pXMJ19-argBM2 上清；泳道 5