一株高产l-甲硫氨酸的谷氨酸棒杆菌的构建及应用的制作方法
【专利摘要】一株高产L-甲硫氨酸的谷氨酸棒杆菌的构建及应用，属于生物工程领域。本发明提供的高产甲硫氨酸的重组菌株（C.glutamicumsubspecieslactofermentum）QW102/pJYW-4-homm-lysCm-brnFE，已保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC?M2014232。该重组菌株存在以下遗传学特征：表达转运蛋白BrnFE，表达天冬氨酸激酶片段lysC和高丝氨酸脱氢酶片段hom，同时在基因组上缺失thrB和mcbR基因。本发明通过基因工程的方法，获得一株高产甲硫氨酸的重组菌株；还提供了用该重组菌株高产L-甲硫氨酸的方法。
【专利说明】一株高产L-甲硫氨酸的谷氨酸棒杆菌的构建及应用
【技术领域】
[0001] 本发明一株高产L-甲硫氨酸的谷氨酸棒杆菌的构建及应用，属于生物工程领域， 具体涉及一种高产L-甲硫氨酸的方法。
【背景技术】
[0002] L-甲硫氨酸，为含硫α硫氨基酸之一。其合成方法主要为化学合成法和发酵法两 种。目前工业化生产应用的主要为化学合成混旋甲硫氨酸，而发酵法目前仍没有工业化应 用实例。L-甲硫氨酸广泛应用于饲料业，因饲料生产不需要高纯度的L-甲硫氨酸，目前仍 以化学合成法为主。但因化学合成法会产生大量有害物质，发酵法生产甲硫氨酸越来越受 到关注。但由于甲硫氨酸合成途径能耗较高，而且硫同化途径对细胞自身毒性较大，发酵法 生产甲硫氨酸没有达到工业规模。
[0003] 目前发酵法合成甲硫氨酸主要利用大肠杆菌或谷氨酸棒杆菌作为生产菌株，但因 为大肠杆菌自身会产生内毒素，不利于食品安全发酵。同时大肠杆菌中甲硫氨酸代谢途径 相较谷氨酸棒杆菌复杂，不利于菌株的代谢工程改造。而谷氨酸棒杆菌作为一株食品安全 级生产菌株，其具有较高的谷氨酸及天冬氨酸家族氨基酸生产能力，也被用于生产L-甲硫 氨酸，目前已广泛应用在赖氨酸，组氨酸，异亮氨酸等氨基酸的工业化生产中，但甲硫氨酸 尚没有工业化应用的实例。
【发明内容】
[0004] 本发明的目的在于通过基因工程的方法，获得一株高产甲硫氨酸的重组菌株。
[0005] 根据本发明的一个优选实例，本发明提供的高产甲硫氨酸的重组菌株，包含基因 组上高丝氨酸激酶编码基因 Ari?和TetR型阻遏蛋白编码基因的敲除。
[0006] 根据本发明的一个优选实例，本发明提供的高产甲硫氨酸的重组菌株，还包含外 源性的表达反馈抗性天冬氨酸激酶片段，反馈抗性高丝氨酸脱氢酶片段和转运蛋白BrnFE 片段。
[0007] 根据本发明的一个优选实例，外源表达的天冬氨酸激酶片段第311位Thr突变为 lie，外源表达的高丝氨酸脱氢酶片段第377位Gly突变为Glu。
[0008] 根据本发明的一个优选实例，提供的外源性片段存在于载体，所述载体为质粒 pJYW-4。
[0009] 本发明的技术方案：一株高产L-甲硫氨酸的谷氨酸棒杆菌，所述菌株分类命名为 谷氨酸棒杆菌已保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏 号为 CCTCC Μ 2014232。
[0010] 所述菌株其同时存在以下遗传学特征：表达转 运蛋白份77/?'，表达天冬氨酸激酶片段心^^和高丝氨酸脱氢酶片段同时在基因组上缺 失iAri?和《cAT?基因。
[0011] 用所述菌株CCTCC Μ 2014232生产L-甲硫氨酸的方法：以QW102/ '为生产菌，挑活化过的单菌落于50mL/500mL种子培养基，3(TC、 200 rpm培养18 h;然后按初始OD562为1转接至1.2L/3L发酵罐；通过流加氨水调节pH至 7. 0,通过关联搅拌转速和曝气率控制溶氧为30%，通过补加50%的葡萄糖控制残糖在20g/ L以上；每4 h取样测定菌体浓度、残糖和氨基酸含量；检测结果显示，在发酵48 h时甲硫 氣酸广量达到最商，最商广量为3. 1 g/L ; 种子培养基：25 g/L 葡萄糖，20 g/L 玉米浆，1 g/L KH2P04,0. 5 g/L MgS04，1.25 g/L 尿素； 发酵培养基：100 g/L 葡萄糖，20 g/L 玉米浆，20 g/L (NH4)2S04，1 g/L ΚΗ2Ρ04,0·5 g/ L MgS04,0. 01 g/L MnS04,0. 01 g/L FeS04,1 mg/L VB1,6 mg/L VB6,0. 1 mg/L VH,0. 2 g/L VB12。
[0012] 本发明的有益效果：本发明提供的高产甲硫氨酸的重组菌株 '，已保藏于中国典型培养物 保藏中心，保藏号为CCTCC Μ 2014232。该重组菌株存在以下遗传学特征：表达转运蛋白 份77/?'，表达天冬氨酸激酶片段心^^和高丝氨酸脱氢酶片段Αο?，同时在基因组上缺失 和基因。本发明通过基因工程的方法，获得一株高产甲硫氨酸的重组菌株；还提供了 用该重组菌株高产L-甲硫氨酸的方法。 生物材料样品保藏：一株高产L-甲硫氨酸的谷氨酸棒杆菌，其分类命名为谷 氧後棒 Ψ? 舊哪说l/vymhonf-lysC'-brnFECorynebacteriumglutainicuin哪 Vd2/ 已保藏于中国典型培养物保藏中心，地址：中国武汉,武汉大 学，保藏日期2014年5月28日，保藏号为CCTCC NO :M 2014232。
【专利附图】
【附图说明】
[0013] 图1、本发明构建重组质粒图谱。
【具体实施方式】
[0014] 以下通过实施例来进一步阐明本发明，下列实施例用于说明目的而非用于限制本 发明范围。
[0015] 在本发明的下述实施例中，所用的质粒提取试剂盒、基因组提取试剂盒、胶回收试 剂盒、大肠杆菌DH5a菌株购于天根生物公司，所用的限制性内切酶、T4 DNA连接酶、PCR试 剂等均购于TaKaRa生物公司，所用引物由捷瑞生物公司合成。
[0016] 实施例1、重组谷氨酸棒杆菌的构建 在本实施例中，先分别构建了用于谷氨酸棒杆菌中敲除和表达相关基因的质粒，然后 将已构建好的质粒分别转化到相应的谷氨酸棒杆菌中，从而实现相关基因的敲除与过量表 达。
[0017] 1. 1高丝氨酸激酶编码基因iAr沒和阻遏蛋白McbR编码基因敲除质粒的构 建 1. 1. 1敲除基因上下游同源臂mcbRU，mcbRD，thrBU，thrBD和loxp-kan-loxp片段的 扩增 在本实施例中，先设计了用于扩增的引物，抽提用于扩增模板的基因组和质粒，然后通 过PCR分别扩增了相关基因片段。具体如下： 根据Genebank报道的iAri?，《cAT?基因序列，选择基因上下游各lkb左右大小的片段 作为敲除基因上下游同源臂，其中thrBU，thrBD用于iAri?基因的敲除，mcbRU，mcbRD用于 基因的敲除。设计以下8条引物，用于克隆mcbRU，mcbRD，thrBU，thrBD序列： mcbRU-F {PstI) ： GCTCTGCAGT GAAGCTCGTG GCGCCGAACT mcbRU-R {BamHI) ： TAGGATCCAT AGACAAACCG GTTCGTATAGT mcbRD-F ijbal) ： GCATCTAGAT CTTGTTCGCG ATTTCTTTG mcbRD-R {Xhol) ： GCCTCGAGGT GTGTTTTTAG ATCTTCGGTT thrBU-F {Xhol) ： ATCTCGAGGG CAAGTCTGTT GTTA thrBU-R {Xbal) ： ACCTCTAGAT TAGTCCCTTT CGAG thrBD-F {BamHI) ： ACGGATCCCA GTCAAGGTTG AAGTT thrBD-R {PstI) ： ATCCTGCAGC TACGTGGTCT ATCGC 其中mcbRU-F和mcbRU-R用于扩增mcbRU片段，mcbRD-F和mcbRD-R用于扩增mcbRD片 段，thrBU-F和thrBU-R用于扩增thrBU片段，thrBD-F和thrBD-R用于扩增thrBD片段。 引物酶切位点用下划线标示，酶切位点对应的限制性内切酶标示在括号内。
[0018] 根据质粒pDTW-202设计用于扩增loxp-kan-loxp片段的引物，引物序列如下： kan-loxp-F (BamHI): ATGGATCCAA TACGACTCAC TATAGGGCG kan-loxp-R (Xbal): ACCTCTAGAG CGCAATTAAC CCTCACTAAA G 引物酶切位点用下划线标示，酶切位点对应的限制性内切酶标示在括号内。
[0019] 抽提获得谷棒ATCC13032基因组和pDTW-202质粒。
[0020] 以谷棒 ATCC13032 基因组为模板，以 mcbRU-F 和 mcbRU-R，mcbRD-F 和 mcbRD-R， thrBU-F 和 thrBU-R，thrBD-F 和 thrBD-R 为引物对进行 PCR 扩增，获得 mcbRU，mcbRD，thrBU， thrBD片段。以pDTW-202质粒为模板，以kan-loxp-F和kan-loxp-R为引物对进行PCR扩 增，获得loxp-kan-loxp片段。将PCR产物分别进行凝胶电泳检测，获得的产物大小符合预 期大小。
[0021] 使用胶回收试剂盒获得纯化的mcbRU, mcbRD, thrBU, thrBD, loxp-kan-loxp片段。
[0022] 1. 1. 2敲除质粒pWTQl和pWTQ2的构建 将纯化过的片段在37°C条件下酶切处理3h。包括AiJ和及丽贤双酶切片段mcbRU， 油aJ和沿〇/双酶切片段mcbRD，AiJ和及丽双酶切片段thrBD，油aJ和沿〇/双酶切片 段thrBU，及丽贤和油aJ双酶切片段loxp-kan-loxp。使用DNA产物纯化试剂盒对酶切后 的片段进行纯化。
[0023] 用AiJ和沿〇/双酶切质粒pBluscriptll SK (+)，获得带有粘性末端的线性化质 粒。使用DNA产物纯化试剂盒对酶切后的质粒进行纯化。
[0024] 对酶切纯化过的质粒使用T4 DNA连接酶进行连接，连接体系如下： pBluscriptll SK(+)质粒 50-100 ng 连接片段 3倍pBluscriptll SK(+)质粒摩尔比 T4DNA连接酶 1 μ L Τ4 Buffer 2 μ L ddH20 补加至20 μ L 连接温度：16°C，连接时间3-10 h 利用以上连接体系，连接片段mcbRU, mcbRD, loxp-kan-loxp和质粒pBluscriptll SK(+)，以构建·?Μ敲除质粒；连接片段thrBU，thrBD, loxp-kan-loxp和质粒 pBluscriptll SK(+)，以构建 iAri?敲除质粒。
[0025] 将以上连接体系转化大肠杆菌DH5 α，并涂布含有30mg/L的卡那霉素的LB平板， 培养后获取转化子进行鉴定。最终获得敲除质粒，命名为pWTQl ;获得敲除质粒 命名为PWTQ2 (附图1)。
[0026] 1. 2高丝氨酸脱氢酶，天冬氨酸激酶和转运蛋白BrnFE表达载体的构建 1. 2. 1定点突变改造高丝氨酸脱氢酶和天冬氨酸激酶 在本实施例中，选用以下突变位点解除高丝氨酸脱氢酶和天冬氨酸激酶的反馈阻遏作 用。其中高丝氨酸脱氢酶第377位的Gly被突变为Glu，天冬氨酸激酶第311位Thr被突变 为 lie。
[0027] 根据 genebank 报道的 Ao?(SEQ ID NO. 1) ID NO. 2)序列，设计以下四 条引物用于克隆Αο?，序列： hom-F: GCGAATTCAT GACCTCAGCA TCT hom-R: GATGAGCTCT TAGTCCCTTT CGAG lysC-F: GCTGAGCTCG TGGCCCTGGT CGTAC lysC-R: GCCTCGAGTT AGCGTCCGGT 其中hom-F和hom-R用于扩增Ac?基因编码区，lysC-F和lysC-R用于扩增又编码 区。
[0028] 抽提获得ATCC13032基因组。
[0029] 以ATCC13032基因组为模板，分别以hom-F和hom-R，lysC-F和lysC-R为引物对 进行PCR扩增，获得Αο?和基因片段。
[0030] 使用胶回收试剂盒回收获得的Aoffi和基因片段。回收后的片段连接PMD18-T 载体，分别获得pMD18-T-Ao?和pMD18-T-质粒。根据基因的突变位点设计定点突变引 物，序列如下： homint-F ： TGGAAGATCG CGTGGGAGTT TTGGCTGAAT TGGC homint-R ： GCCAATTCAG CCAAAACTCC CCACGCGATC TTCCA lysCint-F ： GCACCACCGA CATCATCTTC ACCTGCCCTC lysCint-R ： GAGGGCAGGT GAAGATGATG TCGGTGGTGC 其中 homint-F 和 homint-R 用于扩增质粒 pMD18-T_Ao?，lysCint-F 和 lysCint-R 用于 扩增质粒pMD18-T-/_F5^。序列中下划线标示的是基因的突变位点。
[0031] 以质粒 pMD18-T_Ao? 和 pMDlS-T-Zj^C 为模板，分别以 homint-F 和 homint-R, lysCint-F和lysCint-R为引物对对整个质粒进行扩增。扩增产物用Z^/?J37°C处理lh，获 得的产物转化大肠杆菌DH5 α，并涂布含有30mg/L的氨苄青霉素的LB平板，培养后获取转 化子进行鉴定。根据鉴定结果，最终获得两个质粒pMD18-T-AoV和pMD18-T-/j^f。
[0032] 质粒pMD18-T-Ao?w和pMDlSUj^f经测序验证，分别含有预期的突变位点。
[0033] 1. 2. 2反馈抗性高丝氨酸脱氢酶和天冬氨酸激酶及转运蛋白BrnFE表达载体的 构建 根据genebank报道的Αο?,又75^，'基因序列，设计以下六条引物用于克隆 又基因序列为 SEQ ID N0.3，SEQ ID Ν0.4); hom-SD-F {EcoRI) ： GCGAATTCAG AAGGAGACTA GTAATGACCT CAGCATCT hom-R {SacI) ： GATGAGCTCT TAGTCCCTTT CGAG lysC-SD-F {SacI) ： GCTGAGCTCA GAAGGAGAGA TGTTAGTGGC CCTGGTCGTA C lysC-R {Xhol) ： GCCTCGAGTT AGCGTCCGGT brnFE-SD-F {BamHI) ： TAAGGATCCA GAAGGAGATA TACCGTGCAA AAAACGCAAG brnFE-R {Xbal) ： TACTCTAGAT TAGAAAAGAT TCAC 其中hom-SD-F和hom-R用于扩增基因编码区；lysC-SD-F和lysC-R用于扩增心 基因编码区；brnFE-SD-F和brnFE-R用于扩增'基因编码区。引物酶切位点用下划线 标示，酶切位点对应的限制性内切酶标示在括号内。
[0034] 以质粒 pMD18-T-Ac?w 和 pMD18_T_又为模板，分别以引物 hom-SD-F 和 hom-R， 以及引物lysC-SD-F和lysC-R为引物对，进行PCR扩增，获得AoV和心片段。
[0035] 以ATCC13032基因组为模板，以引物brnFE-SD-F和brnFE-R为引物对进行PCR扩 增，获得基因'编码区序列。
[0036] 用胶回收试剂盒回收获得和6/77/?'片段。
[0037] 抽提获得大肠到谷棒穿梭表达质粒pJYW-4。
[0038] 将纯化过的片段和质粒在37°C条件下酶切处理3h，进一步使用胶回收试剂盒 回收获得带有粘性末端的片段hsf和'，以及线性化质粒pJYW-4。将获得的 质粒和片段进行连接，成功获得表达质粒pJYW-4-AM，pJYW-4-7_f·^，pJYW-4-fo77/^， (附图 1)。
[0039] 根据genebank报道的Αο?, #5^基因序列，设计以下两条引物用于克隆 基因片段： hom-lysC-F ： TATGGGCCCA GAAGGAGACT AGTAATGACC TCAGCATCT hom-lysC-R: TAGGGATCCT TAGCGTCCGG TGCCTG 以质粒为模板，引物hom-lysC-F和hom-lysC-R为引物对进行PCR 扩增，获得片段。
[0040] 用胶回收试剂盒回收获得片段。
[0041] 将纯化过的片段和质粒pJYW-4-foT?/^'在37 °C条件下酶切 处理3h，进一步使用胶回收试剂盒回收获得带有粘性末端的-心片段和 线性化质粒pJYW-4-foT?/^'。将获得的质粒和片段进行连接，成功获得表达质粒 (附图 1)。
[0042] 1. 3谷棒中重组菌株的构建 1. 3. 1高丝氨酸激酶和阻遏蛋白McbR缺失菌株的构建 以谷氨酸棒杆菌ATCC13032为出发菌株，电转敲除质粒pWTQl至ATCC13032以构建高 丝氨酸激酶缺失菌株ATCC13032缺iAr儿具体操作流程如下： (1)从大肠杆菌DH5 α中提取质粒pWTQl，用pH8. 0的水洗脱备用。
[0043] (2)电转质粒pWTQl至谷棒ATCC13032,菌液涂布含有卡那霉素的LBHIS平板进行 培养，筛选获得正确转化子。
[0044] (3)电转质粒pDTW-109至步骤（2)中获得的转化子，涂布含有氯霉素的LBHIS平 板，25°C进行筛选。获得的正确转化子命名为WTQ101。
[0045] 采用上述方法，以WTQ101为出发菌株，电转敲除质粒pWTQ2至WTQ101，获得高丝氨 酸激酶和McbR共同缺失菌株，命名为WTQ102。
[0046] 1. 3. 2反馈抗性高丝氨酸脱氢酶，天冬氨酸激酶和转运蛋白BrnFE的外源表达 抽提质粒 pJYW-4-Aofi/Wj^f 和 '，分别电转菌株 WTQ101 和 WTQ102。涂布含有卡那霉素的LBHIS平板，筛选转化子抽提质粒进行单酶切验证，获得以下 正确转化子： WTQ101 hym-\-hornm-lysC ； WTQ102/pJYff-4-Ao#-7^r ； m讲(TZ/pyr^-A-honF-lysC-brnFE。
[0047] 实施例2、重组谷氨酸棒杆菌摇瓶水平生产甲硫氨酸 本实例中使用的培养基配方如下： 种子培养基：25 g/L 葡萄糖，20 g/L 玉米浆，1 g/L KH2P04,0. 5 g/L MgS04，1.25 g/L 尿素。
[0048] 发酵培养基：100 g/L 葡萄糖，20 g/L 玉米浆，20 g/L (NH4)2S04，1 g/L KH2P04， 0.5 g/L MgS04,0. 01 g/L MnS04,0. 01 g/L FeS04,1 mg/L VB1,6 mg/L VB6,0. 1 mg/L VH, 0·2 g/L VB12。
[0049] 挑活化过的单菌落于30mL/250mL种子培养基，30°C、200 rpm培养18 h。然后按 初始0D562为1转接至50mL/500mL发酵培养基中，其中发酵培养基添加20 g/L碳酸钙以平 衡pH。30°C、200 rpm培养72 h。取样测定相关氨基酸产量。
[0050] 本实施例中发酵液氨基酸含量采用HPLC进行测定，具体方法如下： 取发酵样品lmL，1,2000 rpm离心5 min,取上清于一干净EP管中用5%三氯乙酸稀释 20倍，4°C静置6-9 h。静置后的样品于1,2000 rpm离心10 min，0.22 nm水相针式滤器 过滤至氨基酸样品瓶中上机检测。
[0051] 各突变株甲硫氨酸产量对比如下:_
【权利要求】
1. 一株高产L-甲硫氨酸的谷氨酸棒杆菌，其特征在于，所述菌株分类命名为谷氨酸棒 妖麗{C. glutamicum subspecies lactofermentum')^M]S)2/vymhomm-lysCn-brnFE，已像 藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC Μ 2014232。
2. 权利要求1所述菌株QW102/pJYW-4-AoV-/j^f-fo7?/E其特征在于其同时存在以 下遗传学特征：表达转运蛋白'，表达天冬氨酸激酶片段心和高丝氨酸脱氢酶片段 Αο?，同时在基因组上缺失iAr沒和基因。
3. 权利要求1所述的高产L-甲硫氨酸的谷氨酸棒杆菌的应用，其特征在于用于摇瓶水 平及发酵罐水平生产甲硫氨酸。
4. 用权利要求1所述菌株CCTCC Μ 2014232生产L-甲硫氨酸的方法，其特征在于：以 '为生产菌，挑活化过的单菌落于50mL/500mL种子培养基， 30°C、200 rpm培养18 h ;然后按初始0D562为1转接至1. 2L/3L发酵罐；通过流加氨水调 节pH至7. 0,通过关联搅拌转速和曝气率控制溶氧为30%，通过补加50%的葡萄糖控制残糖 在20g/L以上；每4 h取样测定菌体浓度、残糖和氨基酸含量；检测结果显示，在发酵48 h 时甲硫氣酸广量达到最商，最商广量为3. 1 g/L ; 种子培养基：25 g/L 葡萄糖，20 g/L 玉米浆，1 g/L KH2P04,0. 5 g/L MgS04，1.25 g/L 尿素； 发酵培养基：100 g/L 葡萄糖，20 g/L 玉米浆，20 g/L (NH4)2S04，1 g/L ΚΗ2Ρ04,0·5 g/ L MgS04,0. 01 g/L MnS04,0. 01 g/L FeS04,1 mg/L VB1,6 mg/L VB6,0. 1 mg/L VH,0. 2 g/L VB12。
【文档编号】C12P13/12GK104099267SQ201410254429
【公开日】2014年10月15日 申请日期:2014年6月10日 优先权日:2014年6月10日
【发明者】王小元, 秦天宇, 胡晓清, 李烨, 李颜颜 申请人:江南大学