专利名称：酶法转化生产l-半胱氨酸的微生物固体酶制剂的制备及应用的制作方法
酶法转化生产L-半胱氨酸的微生物固体酶制剂的制备及
应用
技术领域：
本发明利用微生物固体酶制剂酶法转化生产氨基酸，属于生物技术领域。涉及微 生物细胞的渗透处理以及冷冻或喷雾干燥，及其在转化生产L-半胱氨酸中的应用。
背景技术：
L-半胱氨酸是一种重要的含硫氨基酸，广泛应用于医药、食品、化妆品以及饲料等 行业。目前我国L-半胱氨酸的生产以毛发水解为主，产量低、能耗高，水解过程中产生大量 废气及废酸，污染环境。而利用酶法制备L-半胱氨酸具有反应条件温和、专一性强、效率 高、副产物少、对环境友好等优点，对节能减排、发展低碳经济具有重要意义，长期以来相关 技术被国外公司垄断。2003年，刘忠等人(微生物学通报，2003，30 (6) :16 21)分离筛选出一株具 有转化 DL-2-氨基-Δ2 噻唑啉-4 羧酸(DL-2-Amino-A2thiazoline-4-Carboxylic Acid, DL-ATC)生成L-半胱氨酸能力的假单胞菌TS-1138菌株，经鉴定为恶臭假单胞菌 (Pseudomonas putida)(天津大学学报，2007，40 (4) :421 426)。金永杰等人(微生物学通报，2004，31 (6) :68_72)对假单胞菌TS-1138菌株转化 DL-ATC的相关酶系进行了分离纯化和酶学性质研究，纯化了 L-ATC水解酶和L-SCC水解酶， 两种酶的相对分子质量分别为37. 5kD和42. 8kD，酶促反应的最适温度均为35°C，最适反应 PH分别为7. 0和8. 0，Km值分别为0. 67毫摩尔/升和0. 15毫摩尔/升，最大反应速度分 别为0. 39X 10_3毫摩尔/升·分钟和0. 42X 10_3毫摩尔/升·分钟。余养盛等人(Biosci.Biotechnol. Biochem.，2006，70 (9) 2262 2267)对恶臭假 单胞菌TS-1138菌株转化DL-ATC的相关基因进行了研究，构建了 TS-1138菌株的基因组随 机文库，克隆到两个新的基因(tsB，tsC)，并在大肠杆菌中进行了表达，对表达产物进行功 能鉴定的结果表明，tsB基因编码L-ATC水解酶，tsC基因编码L-SCC酰胺水解酶，从而在分 子水平上证明了 DL-ATC的转化途径。余养盛等人进一步发现(Frontiersof Biology in China, 2007, 2 (4) 391-396)，假单胞菌TS-1138菌株细胞内同时还存在L-半胱氨酸脱巯基酶，该酶可将L-半 胱氨酸分解为丙酮酸、H2S和NH3,从而影响L-半胱氨酸的积累。通过向酶促反应液中添加 羟胺或氨基脲可以部分抑制L-半胱氨酸脱巯基酶的活性，避免产物的分解。余养盛和刘春琴等人分别对TS-1138菌株细胞转化DL-ATC合成L-半胱氨酸的 转化条件进行了报道(生物技术通讯，2006，17 (6) :911-913;微生物学通报，2008，35(1) 45-49)，其最适酶促反应条件为反应温度42°C，反应体系pH 8. 0，反应时间2. 5小时，底物 浓度6克/升，细胞悬液浓度250克/升，反应体系中羟胺浓度1摩尔/升。在最适酶促反 应条件下，由DL-ATC转化为L-半胱氨酸的摩尔转化率为96. 8%。此外，中国专利(申请号200710056754. 9)报道了一种微生物转化生产胱氨酸的 方法。该发明以恶臭假单胞菌TS-1138细胞为酶源的情况下，以羟胺为抑制剂，酶法转化底
3物ATC得到L-半胱氨酸水溶液，并通过进一步氧化方式将所述的半胱氨酸转化成胱氨酸的 方法。该方法直接利用菌体细胞为酶源催化底物，转化效率在90%以上。在上述转化反应研究中，均使用TS-1138菌株的培养细胞为酶源，酶源细胞用量 大(250克/升)，产物生成量相对少，并且酶源细胞需现用现制，因稳定性差而无法长期保 存，导致使用不便，影响了该技术的产业化。
发明内容现有的微生物酶法转化生产L-半胱氨酸的报道中使用的酶源均为TS-1138菌株 的静息细胞(生物技术通讯，2006，17 (6) :911-913;微生物学通报，2008，35(1) :45_49;中 国专利200710056754. 9)，催化反应的酶源细胞用量大，产物生成量少，并且酶源细胞需现 用现制，因稳定性差而无法长期保存，导致使用不便。本发明目的是为解决上述问题，提供 一种酶法转化生产L-半胱氨酸的微生物固体酶制剂的制备及应用。具体是通过细胞透性 化处理提高TS-1138菌株细胞的催化活性，同时通过将透性化细胞进行冷冻干燥或喷雾干 燥，获得可长期保存的酶制剂，为L-半胱氨酸酶法生产奠定了基础。渗透处理细胞技术，是指在不破坏细胞完整结构的前提下，改变细胞壁和细胞膜 的通透性，从而使低分子量物质能够自由进出细胞的技术。通过这种方法获得的细胞通常 称为透性化细胞。而对微生物细胞的干燥通常采用真空冷冻干燥和喷雾干燥技术。真空冷 冻干燥简称冻干，是冷冻技术与真空技术相结合的干燥脱水技术。冻干产品含水量低，不易 被氧化，有利于运输、销售和长期保存。喷雾干燥是一种应用广泛、经济、简便的物料干燥方 法，喷雾干燥直接通过雾化的方式形成雾滴并在与热气体介质接触的过程中蒸发溶剂，从 而产生干燥粉末，由于水分蒸发和受热时间短，可通过控制操作条件和加入合适的保护剂， 最大限度地防止活性物质的变性，从而制备稳定的粉粒状产品。针对真空冷冻干燥或喷雾 干燥过程中酶容易失活的问题，选择合适的保护剂和喷雾干燥的条件至关重要。本发明利用细胞渗透处理技术在不破坏恶臭假单胞菌TS-1138菌株细胞整体结 构的前提下，改变了细胞壁和细胞膜的通透性，提高了底物和产物的传质效率。本发明提供的酶法转化生产L-半胱氨酸的微生物固体酶制剂的制备方法是采 用恶臭假单胞菌TS-1138菌体细胞，以甲苯为渗透剂，渗透处理获得透性化细胞，采用冷冻 干燥或喷雾干燥获得透性化细胞干粉，即可用于酶法转化生产L-半胱氨酸的微生物固体 酶制剂。其中，渗透剂甲苯的浓度范围在0. 至5% (ν/ν)，最佳浓度为2%，渗透处理的 温度范围为15-35°C，最佳温度为25°C，处理时间为15-90分钟，最佳时间为30分钟。在 最佳渗透条件下，所得透性化细胞的酶活可达229. 9U/克，约为对照(静息细胞)的7倍。 TS-1138菌体细胞经透性化处理后，转化DL-ATC生成L-半胱氨酸的最适反应温度为35°C， 与L-ATC水解酶和L-SCC酰胺水解酶的最适反应温度相同。透性化细胞的最适反应pH为 8. 0。在冷冻干燥获得透性化细胞干粉的制备工艺中，本发明采用Plackett-Burman设 计法和响应面分析法获得了一种优化的复合冻干保护剂，复合冻干保护剂为谷氨酸钠、甘 油和甘露醇的混合物，浓度范围分别为谷氨酸钠5-15克/升、甘油10-50毫升/升和甘 露醇10-50克/升，其中最佳浓度为谷氨酸钠11. 21克/升、甘油32毫升/升和甘露醇35克/升。在最佳条件下，使透性化细胞冻干后的残存酶活由12. 5%提高到66.7%。冻干透 性化细胞室温贮存3个月，依旧保持90%以上的活性，而静息细胞4°C贮存7天酶活损失在 50%以上。通过单因素实验和响应面分析实验，确认了最适细胞浓度、底物浓度、反应时间， 获得了该三因素对冻干透性化细胞转化反应的影响规律，建立了以转化率为响应值的二次 响应面回归模型，优化了反应工艺冻干细胞浓度35克/升，底物浓度15克/升，反应时间 2. 5小时。在采用喷雾干燥获得透性化细胞干粉的制备工艺中，本发明采用正交设计法对喷 雾工艺进行优化，考察进口温度、雾化速度、进料菌浓、保护剂含量对酶活力收率的影响。确 定了喷雾条件保护剂为谷氨酸钠、阿拉伯胶或牛肉浸膏，浓度范围为5-20克/升，进口温 度为100-140°C，进料菌浓为100-200克/升，雾化速度0.2-0.6升/小时。其中最佳条件 为保护剂为10克/升的谷氨酸钠、阿拉伯胶或牛肉浸膏，进口温度120°C，进料菌浓为200 克/升，雾化速度0. 2升/小时，在最佳条件下可得到收率最高为68. 92%的透性化细胞酶 粉。制得的喷干粉酶活达614. 7U/克，在室温密封保存3个月，依旧保持90%以上的活性。本发明方法制备的固体酶制剂在酶法转化生产L-半胱氨酸中的应用，以DL-2-氨 基-Δ2 噻唑啉-4 羧酸(DL-2-Amino-A2thiazoline-4-Carboxylic Acid, ATC)为底物，以 透性化细胞干粉即固体酶制剂为酶源，每小时内每克酶制剂可催化718至741. 7毫克的底 物ATC生成595. 1至614. 7克的L-半胱氨酸；冻干酶粉和喷干酶粉的反应温度分别为35°C 或40°C，反应体系最佳pH8. 0，反应最佳时间2. 5小时，底物ATC的初始最佳浓度为4克/ 升，羟胺的最佳浓度1毫摩尔/升。与静息细胞每小时内31. 4毫克的L-半胱氨酸的转化效率相比，制得的喷干粉储 存稳定性高、转化性能好，单位时间每小时内每克固体酶制剂可以转化718至741. 7毫克的 DL-ATC，而制备1克固体酶制剂约需4克湿的静息细胞，因此相当于每克湿静息细胞制成固 体酶制剂后，在单位时间每小时内可以转化179. 5至185. 4毫克的DL-ATC，生成148. 8至 153. 7毫克的L-半胱氨酸，效率大大提高，因此有很好的实际应用价值。本发明的优点和有益效果本发明利用细胞渗透处理技术在不破坏恶臭假单胞菌 TS-1138菌株细胞整体结构的前提下，改变了细胞壁和细胞膜的通透性，提高了底物和产物 的传质效率，所制备的透性化细胞的酶活最高为原始静息细胞的7倍。同时，采用冷冻干燥 或喷雾干燥，将不易保存的透性化细胞制备成为稳定性高、转化活力好的固体酶制剂，与原 始的静息细胞相比在最佳转化工艺条件下，细胞的反应效率大约提高了 6倍，可用于高效 制备L-半胱氨酸，因此本发明在L-半胱氨酸的工业化生产领域具有良好的产业化价值。
图1是甲苯用量对透性化细胞酶活力的影响。 图2是渗透处理温度和时间对透性化细胞酶活力的影响。图3是温度对酶活性的影响。图4是温度对酶稳定性的影响。图5是pH值对酶活性的影响。
具体实施方式本发明提供的酶法转化生产L-半胱氨酸的微生物固体酶制剂的制备方法是采 用恶臭假单胞菌TS-1138菌体细胞，以甲苯为渗透剂，渗透处理获得透性化细胞，采用冷冻 干燥或喷雾干燥获得透性化细胞干粉，即酶法转化生产L-半胱氨酸的微生物固体酶制剂。 其中，制备方法涉及的具体条件通过如下实施例确定，微生物固体酶制剂在L-半胱氨酸的 生产应用的具体操作可参考中国专利(申请号=200710056754. 9)实施例1 TSl 138菌体细胞的制备及酶活分析从平板上挑取一环TS-1138菌种接入液体种子培养基中(葡萄糖20克，ATC 3克， 玉米浆 5 克，尿素 3 克，NaCl 1. 5 克，MnSO4 · H2O 0. 1 克，K2HP043 克，MgSO4 · 7H20 0. 5 克， FeSO4WH2O 0.01克，定容至1升，pH 7. 5)，28°C、200转培养16小时，然后以1 %的接种量转 接于产酶培养基中(葡萄糖20克，ATC 4克，玉米浆1克，尿素3克，NaCl 1. 5克，MnSO4 ·Η20 0. 1 克，Κ2ΗΡ043 克，MgSO4 · 7Η20 0. 5 克，FeSO4 · 7Η20 0. 01 克，定容至 1 升，ρΗ7· 5)，28°C、 200转培养16小时，所得发酵液于4°C下6，000转离心10分钟，收集菌体，用50毫摩尔/ 升的磷酸缓冲液(PH 8.0)悬浮洗涤后再离心，收集菌体作为静息细胞备用。以50毫摩尔/升的磷酸缓冲液(pH 8. 0)配制一定浓度的细胞悬液，加入到以50 毫摩尔/升的磷酸缓冲液(PH 8.0)配制的2倍体积6克/升的DL-ATC溶液中，混勻后，于 35°C保温10分钟，然后采用酸式茚三酮法迅速测定生成的L-半胱氨酸含量。以L-半胱氨 酸为标准品绘制标准曲线。酶活力单位定义为在上述反应条件下，每小时转化DL-ATC生成 1毫克L-半胱氨酸所需的酶源细胞的酶量为1个酶活力单位(U)。酶活以每克细胞所含的 酶活力单位(U/克)表示。实施例2渗透试剂的选择将菌体细胞以50毫摩尔/升的磷酸缓冲液(pH 8.0)配成10%的菌悬液后分别加 入不同的渗透试剂(见表1)，30°C振荡30分钟，4°C下6，000转离心10分钟，收集菌体，再 以50毫摩尔/升的磷酸缓冲液(pH 8. 0)洗涤后离心，得透性化细胞。按实施例1方法检 测透性化细胞的酶活，以确定最佳渗透试剂。表1不同渗透试剂处理后所得透性化细胞的酶活
渗透剂酶活(U/克)倍数对照(无渗透剂)26.81.0DMSO24.30.90.2%Tween 8018.70.710%乙醇58.72.20.2%EDTA68.22.52%氯仿56.32.12%氯仿+ 10%乙醇54.92.02% 氯仿 +0.2%EDTA58.32.22%甲苯207.07.72%甲苯+ 10%乙醇86.43.22% 甲苯 +0.2%EDTA171.96.4 TS-1138菌体细胞经渗透剂渗透处理后，转化DL-ATC生成L-半胱氨酸的能力见表2，其中2%甲苯对TS-1138菌体细胞的渗透效果优于其它渗透剂，所得透性化细胞的酶 活性为未渗透细胞(静息细胞)的7倍以上。甲苯与EDTA或乙醇对TS-1138菌体细胞酶 活的增加没有协同增强作用。分别采用不同浓度的甲苯对细胞进行渗透处理，结果如图1所示。添加2%的甲苯 渗透处理30分钟效果较好。实施例3渗透处理温度和时间对酶活的影响以相同的菌体量分别测定渗透的适宜温度范围和处理时间，结果如图2所示，以 未渗透细胞的酶活为对照，在20-35°C处理15-90分钟获得的透性化细胞的酶活均增加2倍 以上。不过，在较低温度和较短时间范围内(如20 25°C处理15 60分钟)，随着渗透 时间的延长所得透性化细胞的酶活增加；当渗透时间继续增长，酶活反而下降，可能是部分 胞内酶泄露的缘故(如20°C处理90分钟)。在温度较高情况下，如35°C处理15分钟后，酶 活就开始降低，说明该酶的热稳定性不是很好。此外，虽然20°C渗透90分钟的效果最好，所 得透性化细胞的酶活可达165U/克，与25°C渗透30分钟(酶活为160U/克)相比酶活仅约 提高3%，但是却需要3倍的渗透时间。由于低温渗透及渗透时间的延长都会增加能耗，因 此综合考虑，对于100克/升的菌悬液，在25°C下渗透处理30分钟最佳。实施例4 TS-1138菌株透性化细胞悬液的制备将TS-1138菌株细胞以10毫摩尔/升的磷酸缓冲液(pH 8. 0)配制100克/升菌 悬液后加入0. 1-5% (ν/ν)的甲苯，20-351渗透处理15-90分钟，然后于41下6，000转离 心10分钟，弃去上清液，透性化细胞以相同的磷酸缓冲液悬浮洗涤2次，4°C，6，000转离心 10分钟，收集透性化细胞，加入适量上述磷酸缓冲液，获得透性化细胞悬液备用。实施例5冻干保护剂的筛选分别选取蔗糖、海藻糖、脱脂奶粉、山梨醇、甘露醇、维生素C、谷氨酸钠和甘油8种 保护剂作为考察对象，利用Plackett-Burman实验设计，对适用于TS-1138菌株透性化细胞 的冻干保护剂进行筛选，实验设计及结果见表2。从表2可以看出，未添加保护剂的透性化 细胞冻干后仅残存12. 5%的酶活，添加保护剂后，冻干透性化细胞的酶活均有不同程度的 提高，在实验范围内酶活保护率最高可达61.2%。表2Plackett_Burman 实验设计及响应值(N = 12)
权利要求
酶法转化生产L 半胱氨酸的微生物固体酶制剂的制备方法，其特征在于采用恶臭假单胞菌TS 1138菌体细胞，以甲苯为渗透剂，渗透处理获得透性化细胞，采用冷冻干燥或喷雾干燥获得透性化细胞干粉，即酶法转化生产L 半胱氨酸的微生物固体酶制剂。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于渗透剂甲苯的体积浓度范围在0.至 5%，渗透处理的温度范围为15-35°C，处理的时间范围为15-90分钟。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于甲苯的最佳体积浓度为2%，渗透处理的最 佳温度为25°C，处理的最佳时间为30分钟。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于采用冷冻干燥获得透性化细胞干粉的制 备工艺中，使用的复合冻干保护剂为谷氨酸钠、甘油和甘露醇的混合物，浓度范围分别为谷 氨酸钠5-15克/升、甘油10-50毫升/升和甘露醇10-50克/升。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于复合冻干保护剂中谷氨酸钠的最佳浓度 为11. 21克/升、甘油32毫升/升和甘露醇35克/升。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于采用喷雾干燥获得透性化细胞干粉的制 备工艺中，保护剂为谷氨酸钠、阿拉伯胶或牛肉浸膏，浓度范围为5-20克/升，进口温度为 100-140°C，雾化速度范围为0. 2-0. 6升/小时，进料菌浓范围为100-200克/升。
7.根据权利要求6所述方法，其特征在于最佳喷雾干燥条件为10克/升的谷氨酸钠 作为保护剂，进口温度为120°C，雾化速度为0. 2升/小时，进料菌浓为200克/升。
8.权利要求1所述方法制备的固体酶制剂在酶法转化生产L-半胱氨酸中的应用，其 特征在于以 DL-2-氨基-Δ2 噻唑啉-4 羧酸(DL-2-Amino-A2thiazoline-4-Carboxylic Acid,ATC)为底物，以权利要求1制备的透性化细胞干粉即固体酶制剂为酶源，该酶制剂可 酶法转化生产L-半胱氨酸，每小时内每克酶制剂可催化718至741. 7毫克的底物ATC生成 595. 1至614. 7克的L-半胱氨酸；冻干酶粉和喷干酶粉的反应温度分别为35°C或40°C，反 应体系最佳PH8. 0，反应最佳时间2. 5小时，底物ATC的初始最佳浓度为4克/升，羟胺的最 佳浓度1毫摩尔/升。
全文摘要
一种酶法转化生产L-半胱氨酸的微生物固体酶制剂的制备及应用。本发明以甲苯为渗透剂，处理菌悬液获得TS-1138菌株透性化细胞，其酶活高达229.9U/克，约为原始细胞的7倍。在冷冻干燥透性化细胞中，采用谷氨酸钠、甘油和甘露醇为复合冻干保护剂，冷冻干燥后的残存酶活最高达66.7％，4℃贮存3个月后，酶活仍可以保持90％以上。在喷雾干燥细胞中，可采用谷氨酸钠、阿拉伯胶或牛肉浸膏为保护剂，喷雾干燥后残存酶活最高达68.92％，制得的喷干酶粉活力达614.7U/克，在4℃密封可稳定保存3个月。本发明所获得的微生物固体酶制剂活性高利于保存，可用于酶法制备L-半胱氨酸的工业化生产。
文档编号C12P13/12GK101948779SQ201010267648
公开日2011年1月19日 申请日期2010年8月31日 优先权日2010年8月31日
发明者刘磊, 姚瑞娟, 张奇, 张玺, 陈晓芸, 高智慧 申请人:天津启仁医药科技有限公司