专利名称：检测半胱氨酸蛋白酶抑制剂c的免疫比浊试剂盒及其制备方法
技术领域：
本发明涉及免疫比浊的检测方法，尤其涉及检测半胱氨酸蛋白酶抑制剂C的免疫比浊试剂盒及其制备方法。
背景技术：
半胱氨酸蛋白酶抑制剂C快速检测试剂盒，可用于人尿液、血浆和血清检测。血清半胱氨酸蛋白酶抑制剂C是一个比较接近理想的反映肾小球滤过功能的内源性标志物，研究资料已表明，半胱氨酸蛋白酶抑制剂C是较血清肌酐(Scr)有更高的敏感性和特异性，较为理想的反映肾小球滤过率(GFR)的内源性标志物。在肾移植中的应用在肾移植术中，移植肾的GFR可作为观察急、慢性排斥反应及免疫抑制剂的肾毒性指标之一，靠缓慢升高的Scr往往不能及时、准确反映移植肾的GFR等功能，而Cystatin C则可作为监测肾移植功能的良好指标。在糖尿病中的应用血Cystatin C是一个比较敏感和实用的检出糖尿病肾病的指标，通过定期检查糖尿病患者的血清Cystatin C,可及时发现GFR改变。在高血压病中的应用40%以上的高血压病患者在中、晚期可并发高血压肾病。据临床观察研究发现高血压致肾损害分为三个阶段其中第一阶段肾小球滤过率基本正常，而肾内压增加；第二阶段肾小管高压性损伤，出现α-微球蛋白等，以及肾小球早期损伤,血Cystatin C升高；第三阶段肾小球硬化，肾小管萎缩,血Cystatin C明显升高。所以，临床定期监测高血压病患者的血清Cystatin C水平，可以及时发现高血压病所导致的早期肾功能损伤，为开展早期预防、诊断和治疗创造条件。颗粒增强免疫透射比池法(particle—enhancedturbidimetric immunoassay,PETIA)是近年来出现的一种较为稳定、准确的体液蛋白均相免疫比浊检测方法，其基本原理是一定粒径胶乳颗粒的表面交联单克隆或多克降抗体，当交联有抗体的微球与抗原结合后，在短时间内会迅速聚集在一起，改变了反应体系的吸光度。这种改变与被测抗原的浓度有一定的相关性，在一定范闹内可以反映被测抗原的浓度。此技术通过颗粒增强的方式，放大了抗原抗体反应，弥补了普通透射比浊法灵敏度不够的缺点，同时又继承了透射比浊法稳定性好、方便快速的优点，克服扎ELISA和RIA方法的缺点，已越来越广泛应用于临床上各种微量蛋白的定量检测。日前，胶乳增强免疫透射比浊法区广泛用于脂蛋白a、C反应蛋白、抗链球菌溶血素O的检测，取得了良好的社会效益，但国内外至今尚未见有此类半胱氨酸蛋白酶抑制剂C检测试剂盒问世。
发明内容
本发明的目的是提供一种检测半胱氨酸蛋白酶抑制剂C的免疫比浊试剂盒及其制备方法。本发明的目的通过以下技术方案来实现检测半胱氨酸蛋白酶抑制剂C的免疫比浊试剂盒，特点是包括盒体、应用液瓶、抗体悬浮液瓶和标准品瓶，所述应用液瓶、抗体悬浮液瓶和标准品瓶放置于盒体内，所述应用液瓶中装有应用液，应用液的组分及其重量百分比为表面活性剂0.019Γ2%，防腐剂O. Of 1%，氯化钠O. 1°/Γ20%，缓冲液l(T200mmol/L ;所述抗体悬浮液瓶中装有包被半胱氨酸蛋白酶抑制剂C单克隆抗体的乳胶悬液，乳胶悬液的组分及其重量百分比为包被半胱氨酸蛋白酶抑制剂C单克隆抗体的乳胶O. 059Γ0. 5%，表面活性剂O. 01% ,防腐剂O. θΓ %,缓冲液l(T200mmOl/L ;所述标准品瓶中装有半胱氨酸蛋白酶抑制剂C标准品。进一步地，上述的检测半胱氨酸蛋白酶抑制剂C的免疫比浊试剂盒，所述应用液中的表面活性剂为 Triton-X100、Triton-X405、Tween-20、Tween-40 或 Tween-80 ;所述应用液中的防腐剂为叠氮钠或Proclin-300或两者混合物；所述应用液中的缓冲液为磷酸盐、碳酸盐、三羟基氨基氨基甲烷或甘氨酸。所述乳胶悬液中的表面活性剂为Triton-XlOO、Triton-X405> Tween-20、Tween-40或Tween-80 ;所述乳胶悬液中的防腐剂为叠氮钠、Proclin-300或两者混合物；所述乳胶悬液中的缓冲液为磷酸盐、碳酸盐、三羟基氨基氨基甲烷或甘氨酸。·
本发明检测半胱氨酸蛋白酶抑制剂C的免疫比浊试剂盒的制备方法，包括以下步骤
a)制备乳胶悬液在磷酸盐缓冲液中将乳胶微球与包被半胱氨酸蛋白酶抑制剂C单克隆抗体混匀，3(Γ40度旋转反应过夜，用清洗储存液进行清洗得到乳胶悬液，置于21度环境下保存；
b)制备应用液将表面活性剂、防腐剂、氯化钠和缓冲液同溶于水，得到应用液；
c)配制半胱氨酸蛋白酶抑制剂C标准品选用半胱氨酸蛋白酶抑制剂C标准品，由缓冲液稀释成浓度为8mg/L。更进一步地，上述的检测半胱氨酸蛋白酶抑制剂C的免疫比浊试剂盒的制备方法，在步骤a)中，乳胶微球的粒径为100nnT500nm ;所述磷酸盐缓冲液的pH为7. 2^9. 2，质量比为2(T200mmOl/L ;所述清洗储存液pH为7. 4^9. 0，清洗储存液的组分及其重量百分比为表面活性剂O. 01% 2%，防腐剂O. 01 1%，缓冲液10^200mmol/L,表面活性剂为 Triton-XlOO, Triton_X405、Tween-20, Tween-40 或 Tween-80,防腐剂为叠氮钠、Proclin-300或两者混合物，缓冲液为磷酸盐、碳酸盐、三羟基氨基氨基甲烷或甘氨酸；所述乳胶微球与包被半胱氨酸蛋白酶抑制剂C单克隆抗体混合是等体积混合。更进一步地，上述的检测半胱氨酸蛋白酶抑制剂C的免疫比浊试剂盒的制备方法，步骤b)中，所述缓冲液pH为7. Γ9.0，缓冲液为磷酸盐、碳酸盐、三羟基氨基氨基甲烷或甘氨酸。再进一步地，上述的检测半胱氨酸蛋白酶抑制剂C的免疫比浊试剂盒的制备方法，步骤c)中，所述缓冲液为磷酸盐、碳酸盐、三羟基氨基氨基甲烷或甘氨酸。本发明技术方案突出的实质性特点和显著的进步主要体现在
通过颗粒增强的方式，放大了抗原抗体反应，弥补了普通透射比浊法灵敏度不够的缺点，同时又继承了透射比浊法稳定性好、方便快速的优点，克服扎ELISA和RIA方法的缺点，实现人血清半胱氨酸蛋白酶抑制剂C在生化仪上大批量定量检测，操作简单，灵敏度高，不易受人为因素干扰，检测稳定性和重复性好，能真实反映被检测物的含量，能利用生化分析仪进行检测，容易实现自动化，适于临床推广应用。
具体实施例方式检测半胱氨酸蛋白酶抑制剂C的免疫比浊试剂盒，包括盒体、应用液瓶、抗体悬浮液瓶和标准品瓶，应用液瓶、抗体悬浮液瓶和标准品瓶放置于盒体内，应用液瓶中装有应用液，应用液的组分及其重量百分比为表面活性剂O. 01°/Γ2%，防腐剂O. Of 1%，氯化钠O. 1°/Γ20%，缓冲液l(T200mmOl/L ;抗体悬浮液瓶中装有包被半胱氨酸蛋白酶抑制剂C单克隆抗体的乳胶悬液，乳胶悬液的组分及其重量百分比为包被半胱氨酸蛋白酶抑制剂C单克隆抗体的乳胶O. 059Γ0. 5%，表面活性剂O. 01% 2%，防腐剂O. θΓ %,缓冲液l(T200mmol/L ;标准品瓶中装有半胱氨酸蛋白酶抑制剂C标准品。其中，应用液中的表面活性剂为Triton-X100、Triton_X405、Tween-20, Tween-40或Tween-80 ;应用液中的防腐剂为叠氮钠或Proclin-300或两者混合物；应用液中的缓冲液为磷酸盐、碳酸盐、三羟基氨基氨基甲烷或甘氨酸。乳胶悬液中的表面活性剂为Triton-X100、Triton-X405、Tween-20、Tween-40 或 Tween-80 ;乳胶悬液中的防腐剂为叠氮 钠、Proclin-300或两者混合物；乳胶悬液中的缓冲液为磷酸盐、碳酸盐、三羟基氨基氨基甲烷或甘氨酸。检测半胱氨酸蛋白酶抑制剂C的免疫比浊试剂盒的制备工艺步骤为
a)制备乳胶悬液在磷酸盐缓冲液中将乳胶微球与包被半胱氨酸蛋白酶抑制剂C单克隆抗体混匀，3(Γ40度旋转反应过夜，用清洗储存液进行清洗得到乳胶悬液，置于21度环境下保存；其中，乳胶微球的粒径为100nnT500nm ;磷酸盐缓冲液的pH为7. 2^9. 2，质量比为2(T200mmOl/L ;清洗储存液pH为7. 4^9. 0，清洗储存液的组分及其重量百分比为表面活性剂0. 01% 2%，防腐剂0. 0Γ %,缓冲液l(T200mmol/L，表面活性剂为Triton_X100、Triton-X405>Tween-20>Tween-40 或 Tween-80,防腐剂为叠氮钠、Proclin-300 或两者混合物，缓冲液为磷酸盐、碳酸盐、三羟基氨基氨基甲烷或甘氨酸；乳胶微球与包被半胱氨酸蛋白酶抑制剂C单克隆抗体混合是等体积混合；
b)制备应用液将表面活性剂、防腐剂、氯化钠和缓冲液同溶于水，得到应用液；其中，表面活性剂0. 01% 2%，防腐剂0. 0Γ %,氯化钠0. 1% 20%，缓冲液l(T200mmol/L，表面活性剂为 Triton-X100、Triton_X405、Tween-20, Tween-40 或 Tween-80，防腐剂为叠氮钠或Proclin-300或两者混合物，缓冲液pH为7. 4^9. O,缓冲液为磷酸盐、碳酸盐、三羟基氨基氨基甲烷或甘氨酸；
c)配制半胱氨酸蛋白酶抑制剂C标准品选用半胱氨酸蛋白酶抑制剂C标准品，由缓冲液稀释成浓度为8mg/L ;其中，缓冲液为磷酸盐、碳酸盐、三羟基氨基氨基甲烷或甘氨酸。实施例I
制备乳胶悬液在磷酸盐缓冲液中将乳胶微球与包被半胱氨酸蛋白酶抑制剂C单克隆抗体混匀，3(Γ40度旋转反应过夜，用清洗储存液进行清洗得到乳胶悬液，置于21度环境下保存；其中，乳胶微球的粒径为120nm ;磷酸盐缓冲液的pH为7. 2，质量比为30mmol/L ;清洗储存液pH为7. 4，清洗储存液的组分及其重量百分比为表面活性剂0. 2%，防腐剂0. 05%，缓冲液30mmol/L，表面活性剂为Triton_X405，防腐剂为Proclin-300，缓冲液为甘氨酸；乳胶微球与包被半胱氨酸蛋白酶抑制剂C单克隆抗体混合是等体积混合。
制备应用液将表面活性剂、防腐剂、氯化钠和缓冲液同溶于水，得到应用液；其中，表面活性剂O. 1%，防腐剂O. 05%，氯化钠5%，缓冲液30mmol/L，表面活性剂为Tween-80，防腐剂为叠氮钠，缓冲液PH为8. 0，缓冲液为甘氨酸。配制半胱氨酸蛋白酶抑制剂C标准品选用半胱氨酸蛋白酶抑制剂C标准品，由缓冲液稀释成浓度为8mg/L ;其中，缓冲液为三羟基氨基氨基甲烷。实施例2
制备乳胶悬液在磷酸盐缓冲液中将乳胶微球与包被半胱氨酸蛋白酶抑制剂C单克隆抗体混匀，3(Γ40度旋转反应过夜，用清洗储存液进行清洗得到乳胶悬液，置于21度环境下保存；其中，乳胶微球的粒径为600nm ;磷酸盐缓冲液的pH为9. 2，质量比为60mmol/L ;清 洗储存液PH为9. 0，清洗储存液的组分及其重量百分比为表面活性剂O. 4%，防腐剂O. 2%，缓冲液60mmol/L，表面活性剂为Triton-XlOO，防腐剂为叠氮钠，缓冲液为三羟基氨基氨基甲烷；乳胶微球与包被半胱氨酸蛋白酶抑制剂C单克隆抗体混合是等体积混合。制备应用液将表面活性剂、防腐剂、氯化钠和缓冲液同溶于水，得到应用液；其中，表面活性剂O. 4%，防腐剂O. 2%，氯化钠10%，缓冲液60mmol/L，表面活性剂为Tween-20，防腐剂为Proclin-300，缓冲液pH为8. 0，缓冲液为三羟基氨基氨基甲烷。配制半胱氨酸蛋白酶抑制剂C标准品选用半胱氨酸蛋白酶抑制剂C标准品，由缓冲液稀释成浓度为8mg/L ;其中，缓冲液为碳酸盐。实施例3
制备乳胶悬液在磷酸盐缓冲液中将乳胶微球与包被半胱氨酸蛋白酶抑制剂C单克隆抗体混匀，3(Γ40度旋转反应过夜，用清洗储存液进行清洗得到乳胶悬液，置于21度环境下保存；其中，乳胶微球的粒径为180nm ;磷酸盐缓冲液的pH为8. 0，质量比为120mmol/L ;清洗储存液pH为8. 4，清洗储存液的组分及其重量百分比为表面活性剂O. 6%，防腐剂
O.4%，缓冲液120mmol/L，表面活性剂为Tween-20，防腐剂为叠氮钠和Proclin-300混合物，缓冲液为碳酸盐；乳胶微球与包被半胱氨酸蛋白酶抑制剂C单克隆抗体混合是等体积混
八
口 ο制备应用液将表面活性剂、防腐剂、氯化钠和缓冲液同溶于水，得到应用液；其中，表面活性剂O. 6%，防腐剂O. 4%，氯化钠15%，缓冲液120mmol/L，表面活性剂为Tween-40，防腐剂为叠氮钠，缓冲液PH为9. 0，缓冲液为碳酸盐。配制半胱氨酸蛋白酶抑制剂C标准品选用半胱氨酸蛋白酶抑制剂C标准品，由缓冲液稀释成浓度为3. 2mg/L ;其中，缓冲液为三羟基氨基氨基甲烷。实施例4
制备乳胶悬液在磷酸盐缓冲液中将乳胶微球与包被半胱氨酸蛋白酶抑制剂C单克隆抗体混匀，3(Γ40度旋转反应过夜，用清洗储存液进行清洗得到乳胶悬液，置于21度环境下保存；其中，乳胶微球的粒径为200nm ;磷酸盐缓冲液的pH为8. 2，质量比为150mmol/L ;清洗储存液pH为8. O,清洗储存液的组分及其重量百分比为表面活性剂O. 8%，防腐剂
O.8%，缓冲液180mmol/L，表面活性剂为Tween-80，防腐剂为叠氮钠，缓冲液为磷酸盐；乳胶微球与包被半胱氨酸蛋白酶抑制剂C单克隆抗体混合是等体积混合。制备应用液将表面活性剂、防腐剂、氯化钠和缓冲液同溶于水，得到应用液；其中，表面活性剂O. 8%，防腐剂O. 8%，氯化钠20%，缓冲液180mmol/L，表面活性剂为Triton-XlOO,防腐剂为叠氮钠和Proclin-300混合物，缓冲液pH为7. 4，缓冲液为磷酸盐。配制半胱氨酸蛋白酶抑制剂C标准品选用半胱氨酸蛋白酶抑制剂C标准品，由缓冲液稀释成浓度为8mg/L ;其中，缓冲液为甘氨酸。以下结合采用所述半胱氨酸蛋白酶抑制剂C的免疫比浊试剂盒在生化分析仪上进行半胱氨酸蛋白酶抑制剂C检测的具体条件
在日立7080生化仪上的的设定参数
反应温度37度
分析方法2点终点法主波长546nm,副波长800nm (可不选)
样本量/应用液/包被半胱氨酸蛋白酶抑制剂C抗体的乳胶悬液3ul/240ul/60ul 反应方向上升 读点分别为19点及31点
选择多点定标后，仅器自动完成定标，定标OK后,进彳丁常规半胱;氣酸蛋白酶抑制剂C检测。本发明通过颗粒增强的方式，放大了抗原抗体反应，弥补了普通透射比浊法灵敏度不够的缺点，同时又继承了透射比浊法稳定性好、方便快速的优点，克服扎ELISA和RIA方法的缺点，实现人血清半胱氨酸蛋白酶抑制剂C在生化仪上大批量定量检测，有以下几个方面突出优点1)操作简单；2)灵敏度高；3)不易受人为因素干扰，检测稳定性和重复性好，能真实反映被检测物的含量；4)能利用生化分析仪进行检测，容易实现自动化，适于临床推广应用。需要理解到的是以上所述仅是本发明的优选实施方式，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以作出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
权利要求
1.检测半胱氨酸蛋白酶抑制剂C的免疫比浊试剂盒，其特征在于包括盒体、应用液瓶、抗体悬浮液瓶和标准品瓶，所述应用液瓶、抗体悬浮液瓶和标准品瓶放置于盒体内，所述应用液瓶中装有应用液，应用液的组分及其重量百分比为表面活性剂0.01% ,防腐剂O. 0Γ %,氯化钠O. 1°/Γ20%，缓冲液l(T200mmol/L ;所述抗体悬浮液瓶中装有包被半胱氨酸蛋白酶抑制剂C单克隆抗体的乳胶悬液，乳胶悬液的组分及其重量百分比为包被半胱氨酸蛋白酶抑制剂C单克隆抗体的乳胶O. 059Γ0. 5%，O. 05°/Γ %，表面活性剂O. 01% ,防腐剂O. 0Γ %，缓冲液l(T200mmOl/L ;所述标准品瓶中装有半胱氨酸蛋白酶抑制剂C标准品。
2.根据权利要求I所述的检测半胱氨酸蛋白酶抑制剂C的免疫比浊试剂盒，其特征在于所述应用液中的表面活性剂为Triton-XlOO、Triton_X405、Tween-20、Tween-40或Tween-80 ;所述应用液中的防腐剂为叠氮钠或Proclin-300或两者混合物；所述应用液中的缓冲液为磷酸盐、碳酸盐、三羟基氨基氨基甲烷或甘氨酸。
3.根据权利要求I所述的检测半胱氨酸蛋白酶抑制剂C的免疫比浊试剂盒，其特征在于所述乳胶悬液中的表面活性剂为Triton-XlOO、Triton_X405、Tween-20、Tween-40或Tween-80 ;所述乳胶悬液中的防腐剂为叠氮钠、Proclin-300或两者混合物；所述乳胶悬液中的缓冲液为磷酸盐、碳酸盐、三羟基氨基氨基甲烷或甘氨酸。
4.权利要求I所述的检测半胱氨酸蛋白酶抑制剂C的免疫比浊试剂盒的制备方法，其特征在于包括以下步骤 a)制备乳胶悬液在磷酸盐缓冲液中将乳胶微球与包被半胱氨酸蛋白酶抑制剂C单克隆抗体混匀，3(Γ40度旋转反应过夜，用清洗储存液进行清洗得到乳胶悬液，置于21度环境下保存； b)制备应用液将表面活性剂、防腐剂、氯化钠和缓冲液同溶于水，得到应用液； c)配制半胱氨酸蛋白酶抑制剂C标准品选用半胱氨酸蛋白酶抑制剂C标准品，由缓冲液稀释成浓度为8mg/L。
5.根据权利要求4所述的检测半胱氨酸蛋白酶抑制剂C的免疫比浊试剂盒的制备方法，其特征在于在步骤a)中，乳胶微球的粒径为120nnT600nm。
6.根据权利要求4所述的检测半胱氨酸蛋白酶抑制剂C的免疫比浊试剂盒的制备方法，其特征在于步骤a)中，所述磷酸盐缓冲液的pH为7. 2^9. 2，质量比为2(T200mmol/L。
7.根据权利要求4所述的检测半胱氨酸蛋白酶抑制剂C的免疫比浊试剂盒的制备方法，其特征在于步骤a)中，所述清洗储存液pH为7. Γ9.0，清洗储存液的组分及其重量百分比为表面活性剂O. 01% 2%，防腐剂O. 01 1%，缓冲液10^200mmol/L,表面活性剂为 Triton-XlOO、Triton_X405、Tween-20, Tween-40 或 Tween-80,防腐剂为叠氮钠、Proclin-300或两者混合物，缓冲液为磷酸盐、碳酸盐、三羟基氨基氨基甲烷或甘氨酸。
8.根据权利要求4所述的检测半胱氨酸蛋白酶抑制剂C的免疫比浊试剂盒的制备方法，其特征在于步骤a)中，所述乳胶微球与包被半胱氨酸蛋白酶抑制剂C单克隆抗体混合是等体积混合。
9.根据权利要求4所述的检测半胱氨酸蛋白酶抑制剂C的免疫比浊试剂盒的制备方法，其特征在于步骤b)中，所述缓冲液pH为7. Γ9.0，缓冲液为磷酸盐、碳酸盐、三羟基氨基氨基甲烷或甘氨酸。
10.根据权利要求4所述的检测半胱氨酸蛋白酶抑制剂C的免疫比浊试剂盒的制备方法，其 特征在于步骤C)中，所述缓冲液为磷酸盐、碳酸盐、三羟基氨基氨基甲烷或甘氨酸。
全文摘要
本发明涉及检测半胱氨酸蛋白酶抑制剂C的免疫比浊试剂盒及制备方法，应用液瓶、抗体悬浮液瓶和标准品瓶放置于盒体内，应用液瓶中装有应用液，其组分表面活性剂0.01%~2%，防腐剂0.01~1%，氯化钠0.1%~20%，缓冲液10~200mmol/L；抗体悬浮液瓶中装有包被半胱氨酸蛋白酶抑制剂C单克隆抗体的乳胶悬液，其组分包被半胱氨酸蛋白酶抑制剂C单克隆抗体的乳胶0.05%~1%，表面活性剂0.01%~2%，防腐剂0.01~1%，缓冲液10~200mmol/L；标准品瓶中装有半胱氨酸蛋白酶抑制剂C标准品。实现在生化仪上大批量定量检测。
文档编号G01N33/577GK102879569SQ20121034589
公开日2013年1月16日 申请日期2012年9月18日 优先权日2012年9月18日
发明者刘照关, 康英杰 申请人:苏州照康生物技术有限公司