利用融合酶检测同型半胱氨酸的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种同型半胱氨酸浓度的测定方法：其特征在于被测底物同型半胱氨酸经基因工程融合酶催化生成产物腺苷，该腺苷产生的速率与样本中同型半胱氨酸的含量成正比，通过测定腺苷的方法，可以得出样本中同型半胱氨酸的含量。所采用的基因融合酶是同型半胱氨酸甲基转移酶(EC2.1.1.10)与腺苷同型半胱氨酸酶(EC3.3.1.1)的融合酶，和腺苷同型半胱氨酸酶(EC3.3.1.1)与蛋氨酸腺苷转移酶(EC2.5.1.6)的融合酶。本发明建立了一种高效的融合酶蛋白用于检测同型半胱氨酸，利用融合酶高效的催化活性，大大地提高了普通酶学反应的灵敏度和检测试剂的稳定性。也为酶循环检测方法提出了新的方法学改进领域。
【专利说明】利用融合酶检测同型半胱氨酸
【技术领域】
[0001]本发明属于医学检验测定【技术领域】，具体涉及一种同型半胱氨酸测定试剂。
【背景技术】
[0002]同型半胱氨酸(Homocysteine)是含硫氨基酸，在细胞内由蛋氨酸脱甲基生成。近期的研究表明，同型半胱氨酸通过产生超氧化物及过氧化物损伤血管内皮细胞，改变凝血因子功能，增加血栓形成倾向，促进动脉粥样硬化及血栓形成，使心血管疾病发病率及死亡率增加，因此测定血中同型半胱氨酸的浓度在临床上意义十分重要。当同型半胱氨酸在细胞内积聚，并进入血液循环后，大部分以氧化型存在，并与蛋白结合，还原形同型半胱氨酸在血中仅占I %。测定血中总同型半胱氨酸的含量，一般需采用还原剂将氧化型同型半胱氨酸还原为还原型同型半胱氨酸，常用的还原剂为三_(羧乙基)磷化氢盐酸盐(TCEP)。
[0003]近几年随着同型半胱氨酸酶循环检测方法的不断发展，一种由同型半胱氨酸甲基转移酶(EC2.1.1.10)和腺苷同型半胱氨酸酶(EC3.3.1.1)及其底物组成的酶循环反应方法，由于其不受体内胱硫醚物质的干扰，在临床诊断领域得到了广泛应用。但是，该方法由于使用的工具酶较多，连续催化反应步骤复杂，试剂质量和反应线性都需不断校正，对使用维护要求较高。
[0004]在上述酶循环方法中，一般需要同型半胱氨酸甲基转移酶、腺苷同型半胱氨酸酶、蛋氨酸S-腺苷转移酶、腺苷脱氨酶、谷氨酸脱氢酶、辅酶I和其它生物活性物质。由于各个蛋白酶的稳定性和活性要求不同，故测定试剂制造中较难找到一个理想的稳定条件；同时在反应体系中，由于各个酶均单独溶解在反应缓冲液中，底物和中间产物不断向主题相扩散，增加了连续催化反应的空间位阻，降低了连续催化反应的效率，由于该方法中连续的酶催化反应步骤较多，因此，实际上很难达到理想的线性反应模式。
[0005]本发明采用了基因工程融合酶技术，利用融合酶高效的催化活性和稳定性，大大提高了催化反应的效率，从而提高了检测试剂的反应性能和稳定性。
[0006] 融合酶是指通过基因工程蛋白重组手段，将目标酶和另外一个或几个酶通过连接肽连接起来，从而获得的具有多种功能的融合酶。构建融合酶的最直接的优势之一是可以将多个蛋白功能集成于一体，实现酶的多功能化。融合酶的优势在于能够将多种酶催化活性整合在一个杂合蛋白上。在类似同型半胱氨酸酶循环法这样的连续酶催化过程中，前一个酶的产物(中间产物)是下一步酶催化反应的底物，而这些酶往往处于游离状态，特别是在液体试剂中，酶分子之间的距离是游离和疏散的，难以进行任何控制，制约了其催化效率。通过融合蛋白技术将多个参与连续或循环序列催化反应的酶连接起来，通过调控其空间靠近效应，控制反应效率。通过融合酶实现多酶的空间靠近效应，能够:1)强化中间产物在两个或多酶之间的传递过程，即所谓的“邻近效应”;2)避免了中间产物向主体相的扩散，此时中间产物类似融合酶蛋白的辅酶；3)减少了中间产物被其他副反应的竞争；4)减少了中间体不稳定性导致的降解；5)增加了中间产物在催化活性中心附近的局部浓度，从而大大加速了整个顺序催化过程；6)更重要的是融合酶蛋白具有更好的稳定性。
【发明内容】
[0007]本发明所要解决的技术问题一方面是为了建立一种利用融合酶的酶学测定方法；另一方面是为了进一步提高现有全自动分析试剂的灵敏度，从而改善测定质量，而提供的一种改良的同型半胱氨酸测定试剂方法；并同时还提供了这种同型半胱氨酸融合测定试剂。
[0008]本发明中的融合酶是指通过基因工程蛋白重组手段，将目标酶和另外一个或两个酶通过连接肽连接起来，从而获得的具有多种功能的融合酶。融合酶最简单的构建方式是直接把两个酶的编码基因首尾相连(除去第一个酶的终止密码子)，构成融合酶基因；也可通过连接肽融合；继而在宿主中进行蛋白表达得到融合酶。由于简单的首尾相连容易影响各个结构域的折叠和天然构象，故本发明中采用了连接肽融合的方法。
[0009]常用的连接肽包括柔性连接肽，如聚甘氨酸连接肽((GGGGS) η (—般η≤6))，α螺旋连接肽，如(ΕΑΑΑΚ)η，和抗蛋白酶水解的脯氨酸-苏氨酸(PT) η重复序列连接肽。不同类型的连接肽具有不同性质，(GGGGS)n连接肽不形成二级结构，能增加蛋白的可溶性，并能提供融合酶蛋白催化活性所需的柔性；(EAAAK)n能形成稳定的二级结构，故能提供两个被融合蛋白之间稳定可控的隔离效果，有利于融合蛋白的有效表达和正确折叠。
[0010]在本发明中，我们发现这些新构建的融合酶蛋白，蛋白的正确折叠以及各个酶的活性部位均未受到影响，与单个酶相比，融合蛋白的酶的比活力增加50%以上，而且热稳定性显著提高。
[0011]在本发明中 ，用于测定同型半胱氨酸的融合酶的单体酶序列基因来自S-腺苷-L-蛋氨酸:L-同型半胱氨酸S-甲基转移酶(EC2.1.1.10)、S-腺苷-L-同型半胱氨酸酶(EC3.3.1.1)和三磷酸腺苷:L-蛋氨酸S-腺苷转移酶(EC2.5.1.6)三种酶。融合后用于检测的杂合酶蛋白包括:同型半胱氨酸甲基转移酶(EC2.1.1.10)与腺苷同型半胱氨酸酶(EC3.3.1.1)的融合酶；腺苷同型半胱氨酸酶(EC3.3.1.1)与蛋氨酸腺苷转移酶(EC2.5.1.6)的融合酶。
[0012]所述融合酶在检测试剂中的用量为催化有效量以上，一般可为0.1~100kU/L(U为国际单位)。
[0013]融合酶作为一种杂合双功能或多功能酶蛋白，可直接反复将样品中的同型半胱氨酸转化为腺苷。腺苷的测定方法很多，包括氧化酶方法:(I)腺苷在腺苷脱氨酶的作用下生成氨和肌苷，后者经嘌呤核苷磷酸化酶作用，与磷酸反应生成次黄嘌呤，在黄嘌呤氧化酶的作用下，次黄嘌呤被最终氧化为尿酸，并产生过氧化物氢，经与生色化合物反应，测定生成的色素；或者脱氢酶方法，如(2)谷氨酸脱氢酶方法，氨与α-酮戊二酸在谷氨酸脱氢酶的作用下，产生L-谷氨酸，同时辅酶NADH或NADPH被氧化为NAD+或NADP+，反应系统在340nm处的吸光度值下降。由于样本中的同型半胱氨酸被融合酶反复催化反应，不断产生腺苷，故大大提闻了测定的灵敏度。
[0014]本发明的方法中，所述的待测样本可为各种形式的需检测其所含同型半胱氨酸含量的样本，如体液样品或组织样本，更具体的如血清样本或血浆样本。所述的待测样本与融合酶反应系统的用量比没有特殊要求，但同一测定批次内应一致。
[0015]本发明的融合酶反应系统为可保证样本在其中能有效进行，需要能保证融合酶活性的缓冲液体系，该缓冲体系较佳的为PH6~9的缓冲液体系。所述的缓冲液可为本领域常用的各种缓冲液，如磷酸盐缓冲液、Tris缓冲液或N-(2-羟乙基)哌嗪-N’-(2-乙基磺酸)(HEPES)缓冲液等。缓冲液的浓度(缓冲对的总浓度)无特殊要求，一般为20~300mmol/L0
[0016]根据需要，本发明的融合酶反应系统还可包括能稳定和/或促进酶活性的酶稳定剂。所述的酶稳定剂较佳的为甘露糖醇、甘油、聚乙二醇(优选聚乙二醇2000~8000)、金属离子(如钾离子或钠离子)、牛血清白蛋白、表面活性剂和防腐剂中的一种或多种。所述的酶稳定剂的用量按常规用量选择，一般为0.1~500mmol/L。
[0017]本发明的方法中，所述的反应和测定的温度以所用融合酶可发挥活性的温度下进行即可，一般为25~39°C，较佳的为37°C。较佳的，在进行所述的反应前，将所述的酶循环反应系统在上述温度下进行哺育，以使酶循环反应系统温度均一平衡。所述的哺育的时间较佳的为2~5分钟，更佳的为5分钟。
[0018]本发明的方法中，具体操作只要使待测样本能在所述的融合酶反应系统中进行反应，测定氨的生成速率即可。
[0019]本发明的方法中，所述的测定一般在所述的反应开始后I~15分钟内完成为宜，最宜在5~10分钟内 完成。
[0020]本发明中，具体测定的读点方法可采用速率法或两点法(也称固定时间法)，通过参照标准品或绘制标准浓度曲线等，计算出同型半胱氨酸含量，在此不再赘述。
[0021]上述谷氨酸脱氢酶的反应检测法中，所述的谷氨酸脱氢酶的用量为催化有效量以上，一般可为0.1~50kU/L(U为国际单位)。所述的α -酮戊二酸或其盐的用量以过量为宜，一般可为I~50mmol/L,较佳的为I~20mmol/L。所述的还原型辅酶的用量以过量为宜，一般可为0.1~lmmol/L,较佳的为0.2~0.3mmol/L。所述的还原型辅酶可为酶学领域各种具有指示吸光度的还原型辅酶，如NADH、NADPH、硫代NADH或硫代NADPH等。相应的，检测在所选用的还原型辅酶的吸收波长下进行。例如，采用NADH或NADPH时，可在340nm下进行检测。采用硫代NADH或硫代NADPH时，特定吸收波长为398nm处，但实际应用时，可采用分析仪器上固定设置的波长，如自动生化分析仪上固定设置的405nm或410nm下进行检测。
[0022]本发明的方法可采用常规仪器进行，如紫外/可见光分光光度计分析仪、半自动或全自动生化分析仪。
[0023]本发明的积极进步效果在于:本发明利用融合酶蛋白稳定高效的特点，用于改善同型半胱氨酸的检测水平，显著提高了检测试剂的准确度和稳定性。为提高酶学测定方法开拓了新的领域。
【具体实施方式】
[0024]下面通过实施例的方式进一步说明本发明，但并不因此将本发明限制在所述的实施例范围之中。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，按照本领域常规方法和条件进行。
[0025]实施例1融合酶蛋白的表达纯化
[0026]融合酶蛋白采用柔性连接肽(GGGGS)2，分别应用于同型半胱氨酸S-甲基转移酶(EC2.1.1.10)与腺苷同型半胱氨酸酶(EC3.3.1.1)的融合，和腺苷同型半胱氨酸酶(EC3.3.1.1)与蛋氨酸腺苷转移酶的融合(EC2.5.1.6)，融合基因的构建方法均一致:
[0027]设计第一酶基因带有EcoR I酶切位点的上游引物，和带有GGGGS及第二酶基因5’端部分序列的下游引物；设计带有GGGGS及第一酶基因3’端部分序列的上游引物，和第二酶基因片段带有Xhol I酶切位点的下游引物。使用美国ABI梯度PCR仪(Veriti?96)，二者的扩增体系和反应条件相同(总体积lOOul，其中10*PCR缓冲液10ul，lOOumo/L模板10ul，50umol/L引物各8ul，2.5mM dNTP8ul, 5U/ul TaqDNA聚合酶0.5ul，超纯水56ul ；94°C 5min,94°C 30s55°C 30s72°C 60s, 30个循环，72°C 15分钟)。经过PCR扩增得到两个大片段；以上述两个大片段互为模板进行重叠延伸PCR，通过1.0%琼脂糖电泳检测，并用胶回收得到目的片段；将上述目的片段与表达载体经过酶切后连接，构建pET-30a表达载体。按构建好的表达载体转化到大肠杆菌BL21表达宿主菌中。
[0028]融合酶蛋白采用刚性连接肽(EAAAK)2，分别应用于同型半胱氨酸甲基转移酶(EC2.1.1.10)与腺苷同型半胱氨酸酶(EC3.3.1.1)的融合，和腺苷同型半胱氨酸酶(EC3.3.1.1)与蛋氨酸腺苷转移酶的融合(EC2.5.1.6)，融合基因的构建方法一致:
[0029]设计第一酶基因带有EcoR I酶切位点的上游引物，和带有(EAAAK)2及部分第二酶基因5’端部分序列的下游引物；设计带有(EAAAK)2及部分第一酶基因3’端部分序列的上游引物，和第二酶基因片段带有Xhol I酶切位点的下游引物。使用美国ABI梯度PCR仪(Veriti?96)，二者的扩增体系和反应条件相同(总体积lOOul，其中10*PCR缓冲液10ul，100umo/L 模板 10ul，50umol/L 引物各 8ul，2.5mM dNTP8ul, 5U/ul TaqDNA 聚合酶 0.5ul，超纯水 56ul ;94°C 5min，94°C 30s55°C 30s72°C 608，30个循环，721: 15 分钟)。经过 PCR 扩增得到两个大片段；以上述两个大片段互为模板进行重叠延伸PCR，通过1.0%琼脂糖电泳检测，并用胶回收得到目的片段；将上述目的片段与表达载体经过酶切后连接，构建pET-30a表达载体。按构建好的表达载体转化到大肠杆菌BL21表达宿主菌中。
[0030]在上述表达宿主菌种，分别筛选出阳性含重组子的转化菌落，提取质粒DNA作菌落PCR验证，挑取验证正确阳性重组子，接种到有抗性的LB培养基中，37°C，200rpm，过夜培养。将过夜培养的菌液按照1: 100的比例接种到有抗性的LB培养基中培养。37°C，200rpm, 4h。使培养液的0D600达0.4~0.6，当细菌达到对数生长期后加IPTG至终浓度为lmmol/L。继续培养3~5小时。取上述培养液lmL，3500rpm离心I分钟，沉淀，加20 μ L聚丙烯酰胺凝胶电泳上样缓冲液(含lOOmmol/L Tris缓冲液，pH6.8，20% β-ΜΕ,4% SDS,
0.2%溴酚蓝和20%甘油)后，作SDS-PAGE检测。选取有目的蛋白表达的菌株进行扩大培养，表达目的蛋白。
[0031]融合酶蛋白的提取纯化
[0032]将诱导表达后的菌液4°C，5000rpm离心15分钟，收集诱导表达的细菌培养液。弃上清，每克湿菌约加PBS缓冲液(含137mM氯化钠，2.7mM氯化钾，IOmM磷酸氢二钠和2mM磷酸二氢钾)清洗三次后，用PBS悬浮菌体。菌液经超声破碎至菌液由浑浊至澄清后，12000rpm离心15分钟,收集上清。置于_20°C保存或进行分离纯化。
[0033]将上述样 品经过0.45 μ m滤膜过滤后上样进行亲和层析纯化。取一只洁净的25mL体积的纯化柱，超声清洗后用蒸馏水对其轻柔的洗涤数次，防止滤膜受损，取IOmL的NiSepharose6FF介质填入柱子中，用30_50ml的蒸懼水对纯化系统进行洗漆。用30~50mL结合缓冲液平衡介质，然后把处理好的上柱样品溶液缓慢的以固定流速泵入到纯化柱中，在4°C条件下，使溶液以lmL/min的速度流下，当样品上样结束后，用结合缓冲液进行洗涤，使非特异性结合蛋白洗脱下来。再用30~50mL的20%洗脱缓冲液冲洗非目的蛋白，然后用洗脱缓冲液洗脱目的蛋白，用1.5mL离心管收集洗脱液。
[0034]采用上述方法，分别获得以下四种融合酶:
[0035]1、同型半胱氨酸甲基转移酶-(GGGGS) 2_腺苷同型半胱氨酸酶，简称H-G-Aase ；
[0036]2、腺苷同型半胱氨酸酶-(GGGGS)2-蛋氨酸腺苷转移酶,简称A-G-Mase ；
[0037]3、同型半胱氨酸甲基转移酶-(EAAAK)2-腺苷同型半胱氨酸酶,简称H-E-Aase ；
[0038]4、腺苷同型半胱氨酸酶-(EAAAK)2-蛋氨酸腺苷转移酶，简称A-E-Mase。
[0039]实施例2利用融合酶制备的试剂与普通酶循环试剂检测准确度的比较
[0040]利用融合酶制备的试剂含有如下组分:
[0041]
【权利要求】
1.一种同型半胱氨酸浓度的测定方法及其检测试剂，其特征在于其被测底物同型半胱氨酸经基因融合酶催化生成产物腺苷，该腺苷产生的速率与样本中同型半胱氨酸的含量成正比，通过测定腺苷的方法，可以得出样本中同型半胱氨酸的含量。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于:所述的基因融合酶是指:同型半胱氨酸甲基转移酶(EC2.1.1.10)与腺苷同型半胱氨酸酶(EC3.3.1.1)的融合酶；腺苷同型半胱氨酸酶(EC3.3.1.1)与蛋氨酸腺苷转移酶(EC2.5.1.6)的融合酶。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于:所述的测定腺苷的方法是指氨测定方法，其试剂除包含权利要求2所指的融合酶蛋白外，还应包含:腺苷脱氨酶、谷氨酸脱氢酶、α -酮戊二酸和还原型辅酶I或还原型辅酶II或其类似物等物质。
4.如权利 求1所述的方法，其特征在于:所述的检测试剂为ΡΗ6~9的缓冲液体系；所述的缓冲液较佳的为磷酸盐缓冲液、Tris缓冲液或Ν-(2-羟乙基)哌嗪-Ν’-(2-乙基磺酸)缓冲液。
5.如权利要求1所述的方法，其特征在于:所述的检测试剂中还包括酶稳定剂； 所述的酶稳定剂较佳的为甘露糖醇、甘油、钾离子、钠离子、牛血清白蛋白、表面活性剂和防腐剂中的一种或多种。
6.如权利要求1所述的方法，其特征在于:所述的检测试剂是单一液体试剂。
7.如权利要求1所述的方法，其特征在于:所述的检测试剂是分为第一和第二部分的两部分液体试剂。
【文档编号】C12Q1/48GK103981251SQ201310051366
【公开日】2014年8月13日 申请日期:2013年2月7日 优先权日:2013年2月7日
【发明者】王学忠 申请人:王学忠, 黄秋连