专利名称：对s-腺苷甲硫氨酸(sam)的改进分析的制作方法
技术领域：
本发明涉及新的重组S-腺苷高半胱氨酸酶(SAHH)和其使用方法。本发 明还涉及应用SAHH监测供试体的诊断方法，该供试体已给药S-腺苷曱硫 氨酸(SAM)。本发明的改进方法可快速而又精确地评估SAM的浓度。
背景技术：
作为"nutraceutical"或处方药给药S-腺苷曱硫氨酸(SAM)最近显示出 SAM是一种抗抑郁剂，是一种緩解肝病的预防或治疗组分，提供一种緩解 关节炎症状的手段。SAM在此的作用机制尚未完全清楚，但是，已确信SAM 和其代谢产物高半胱氨酸的相对浓度影响曱基化水平，而甲基化水平会产 生更深的生理影响。由于该药重要，因此期望找到一种可靠而又易实施的 方法来监测所给药的浓度。本发明提供一种改进的方法，该方法通过SAHH 来评估给药SAM的供试体中该药的治疗性水平。本发明还涉及重组产生的 不同于以前报道的SAHH。
S-腺苷高半胱氨酸酶(S-腺苷高半胱氨酸水解酶；SAHH, EC. 3. 3. 1.1) 催化SAH到高半胱氨酸和腺苷的可逆性转化(de la Haba和Cantoni， 1959)。 腺苷的各种结构类似物使许多生物体的SAHH失活，从而导致细胞毒性的 产生(Ueland, 1982)。核苷类似物对SAHH活性的抑制取决于抑制物的结构 和酶的来源。SAHH最初乂人阴道毛滴虫(7h'c/zowcwas vag/"a/h)基因克隆并且 已鉴定特征(Bagnara等，1996)。
Minotto， L.， Ko, G,A.， Edwards, M. R.和Bagnara， A. S.[重组S-腺苷高半 胱氨酸酶的阴道毛滴虫(7Wc/zomo"os vag/"a/z力表达和鉴定，ExperimentalParasitology 90, 175-180， 1998]进一步描述了阴道毛滴虫(r vag/"afe)SAHH 的特征。编码阴道毛滴虫(7Hc/zowo"w vag/"a/^)中S-腺苷高半胱氨酸酶的基 因在大肠杆菌(&c/2en'c/n'a co//)pQE-30的表达有利于描述该酶的特征。6xHis N端标记表达系统(QIAGEN)可一步纯化6毫克rSAHH,该rSAHH可通过 使用镍-NTA基质的亲和层析于100ml细菌培养得到。测得重组酶的分子量 约为56， 000。 rSAHH的特性包括与腺苷有相似的表观Km 20-25|liM和与腺 苷类似物例如阿糖腺苦(ara-A)有相似的抑制/失活模式。
Minotto等1998的研究结果不同于其他人所发现的水解酶根据酶的来 源以各种寡聚形式存在。原核生物SAHH的活性形式是六聚体(Shimizu等， 1984)或四聚体(Porcelli等，，勿a, 1164, 179-188， 1993)。 大鼠肝脏(Fujioka和Takata, J C/ze肌，256, 1631-1635， 1981)和小牛肝脏 (Richards等，253, 4476-4480, 1978)及其它动物源(Doskeland和Ueland， Biochem. et Biophys Acta 708, 185-193, 1982)的SAHH是四聚体，不过不能 确定亚基是否相同或相似。植物源的SAHH的功能形式是同型二聚体 (Gumnowski和Pawelkiewicz， Fur. J. Biochem. 80, 517-523， 1977)。 it文第一 次才艮道以单体形式起作用的SAHH活性(Minotto等，1998)。
发明内容
本发明涉及一种分析样品中SAM水平的改进新方法。 一方面，本发明 方法可用于分析供试体样品中SAM的治疗性水平，所述供试体例如但并不 限于给药此化合物的患者。本方法还可用于分析生物液体中SAM的水平， 所述生物液体例如j旦并不限于供试体血液或其它生物液体。该方法可在体 内例如血流或体外例如取自供试体的样品里进行。所述方法可作为诊断方 案或治疗方案的一部分。作为治疗方案的一部分，该方法一定程度上可监 测治疗情况或进展。
在本发明的一实施方案中，该试验方法可通过样品与甘氨酸N-曱基转 移酶(GMT),甘氨酸及活性形式SAHH的接触而得以进行。测量样品中一 种或更多种反应产物后就可得出样品中SAM的水平，其中反应产物的量与 样品中SAM水平成正比。在本发明一实施方案中，直接或间接地测量反应 产物高半胱氨酸(HC)。可用任何方法来间接测量HC,包括但并不限于用高 半胱氨酸酶处理并且测量一种或更多种反应产物(例如oc-酮戊二酸，HsS或 NH3)的水平。通过测量吸光度或荧光可直接或间接地测定反应产物H2S。 一种测荧光的方法是使用发焚光试剂。
本发明还提供一种新SAHH,编码它的核酸，包含它的组合物及其制 备和使用方法。所述SAHH含有SEQ ID NO: 1编码的氨基酸序列。
编码本发明SAHH的核酸可置于任何合适核酸载体上以增殖，扩增或 表达。所述核酸还可与其它核苦酸操作性地连接以容许与一种或多种附加 氨基酸共价连接的SAHH表达。附加氨基酸导致产生包含SAHH的杂交或 嵌合蛋白。本发明的一优选实施方案中，附加氨基酸是指那些改进本发明 中后面SAHH纯化的组氨酸标记(His tag)。
本发明核酸可被导入任何合适的寄主细胞或生物体，例如但并不限于 细菌，真菌和高等真核细胞。这些细胞可用于重组表达本发明的核酸，任 选地，接着对表达蛋白进行分离和/或纯化。或者，所述核酸还可应用体外 表达系统来表达。
本发明的SAHH纯化可由任何方便或合适的方法例如，但并不限于沉 淀和/或层析法来完成。在本发明一优选的实施方案中，所述纯化全部或部 分是通过基于与组氨酸标记相互作用的亲和层析来实现的。在本发明另一 优选的实施方案中，这样纯化的SAHH， SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳分析显 示为一条带。
本发明SAHH还可被配制成组合物，例如包含药剂或赋形剂(excipients) 的组合物。所迷SAHH还可用于本发明例如上述的试ar方法和其它方法中， 所述其它方法例如由分析样品中高半胱氨酸向SAH转化来测定高半胱氨酸 水平的方法。另一方面，本发明所述SAHH还可用于通过向SAH的转化耗 竭体内或体外样品中过多高半胱氨酸的方法中。当然本发明所述样品可以 是任何相关生物液体。
更具体地，本发明涉及
1. 评估生物液体样品中S-腺苷曱硫氨酸(SAM)的治疗性水平的方法， 包括将甘氨酸N-曱基转移酶(GMT), S-腺苷高半胱氨酸水解酶(SAHH)或 His SAHH,以及甘氨酸加入该样品中；测量所述样品中一种或多种反应 产物，其中所述一种或多种反应产物的水平与样品中SAM水平成正比。
2. 项1的方法，其中被检测的产物是高半胱氨酸(HC)。
3. 项2的方法，其中所述HC是由下述方法测得，该方法包括用高半 胱氨酸酶(HCYase)处理样品，并测定所述高半胱氨酸与HCYase反应得到的 至少一种产物的浓度。4. 项3的方法，其中测得的产物是H2S。
5. 项4的方法，其中所述H2S通过荧光或吸光度而测定。
6. 项1的方法，其中所述SAHH包含SEQIDNO: 1编码的氨基酸序列。
7. 分析含SAM的样品的试剂盒，该试剂盒包括SAHH或His .SAHH, GMT,甘氨酸及使用说明。
8. —种试验，包括含SAM的生物样品；和GMT,甘氨酸，以及SAHH 或His . SAHH，其中SAHH或His . SAHH活性产生一种可测定的产物以 确定样品中SAM的量。
9. 一种分离的包含SEQIDNO: 1的核酸分子。
10. 项9中定义的核酸分子，还包括编码N端6xHis标记的序列。
11. 有效制备S-腺苷高半胱氨酸水解酶的方法，所述方法包括使含有 项9定义的核酸分子的盒进行表达。
12. 有效制备His S-腺苷高半胱氨酸水解酶的方法，所述方法包括使 含有项IO定义的核酸分子的盒进行表达。
13. 项11的方法，其中所述盒在大肠杆菌中表达。
14. 项12的方法，其中所述盒在大肠杆菌中表达。
15. 纯化His S-腺苷高半胱氨酸水解酶的方法，包括用硫酸铵来沉 淀含His S-腺苦高半胱氨酸水解酶的悬浮液以产生上清和沉淀，所述His -S-腺苷高半胱氨酸水解酶由项12的方法生成；和对该上清进行组氨酸标记识 别型亲和层析。
16. 用单个层析步骤纯化His S-腺苦高半胱氨酸水解酶的方法，包括 使通过项12的方法生成的His 'S-腺香高半胱氨酸水解酶进行Ni-NAT亲和层析。
17. 测定生物液体中高半胱氨酸的方法，包括将所述液体与His S-腺 苷高半胱氨酸水解酶接触并且测定所述液体中高半胱氨酸向SAH的转化， 所述His S-腺苷高半胱氨酸水解酶由项15的方法生成。
18. 包含His .S-腺芬高半胱氨酸水解酶的組合物，所述His.S-腺苷高 半胱氨酸水解酶经SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳分析为一条带，其中所述 His S-腺苷高半胱氨酸水解酶由项15的方法制成。
19. 耗竭体内或来自体内的生物液体中过量高半胱氨酸的方法，包括使 所述液体与项15的方法生成的SAHH接触。
20. —种大肠杆菌宿主细胞，包括项9的核酸分子。21. —种大肠杆菌宿主细胞，包括项10的核酸分子。
图1描述pTrcSAHH插入pTrc多克隆位点Ncol和BamHI。 图2包含SAHH稳定性研究的结果。 图3显示SAHH克隆的筛选。
图4描述pTrcHis SAHH插入pTrc多克隆位点Ncol和BmaHT。
图5包含His SAHH稳定性研究的结果。
图6a-c是本发明SAHH核香酸序列与野生型序列的对比。
实施本发明的方式 本发明提供一种分离和重组核酸，该编码SAHH的核酸包括SEQ ID NO:l,还提供相应SAHH氨基酸序列。另一方面，修饰所述SAHH的基因 以编码已修饰的His . SAHH, His , SAHH有6个额外组氨酸位于SAHH基 因N-末端。
另一方面，本发明提供增殖和维持核酸的方法及它们在SAHH蛋白表 达中的用途。本发明还提供通过一 步或两步纯化法纯化SAHH的方法。
在一实施方案中，本发明涉及生物液体中SAM的测量。其中所述"生 物样品，，指的是从个体中分离出的组织或液体样品，包括但并不限于例如 血液，血成分，血浆，血清，脑脊液，淋巴液，尿液，皮肤外的部分，呼 吸道，肠道，生殖泌尿道，身体分泌物，眼泪，唾液，乳，淋巴以及从动 物，细胞(包括但不限于血细胞)，肿瘤，器官中提取出的其它成分，还包括 体外细胞培养的组分样品。优先选用的是在血浆或血清中测量。
其中所述"表达"包括转录和/或翻译。
其中所述术语"包含"及其相关术语在此表示包含的意思。相当于术 语"包括"及其相关术语。
除非特别说明，否则所有本发明用到的科学技术术语与本领域普通人 员通常理解的意思相同。
SAHH是负责S-腺苷高半胱氨酸(SAH)向高半胱氨酸转化的酶，最终降 低SAM水平。由于与SAH或高半胱氨酸(HC)内源水平相比治疗疾病所给 药SAM水平非常高，下述方案可用来分析给药SAM的供试体中该化合物 的水平。因此，所述试验起到了药物监测装置功能，可用于试剂盒形式中。下图中显示了该试验的大概情况'
S-Ad
S-Ad
NH7CH COOH
;H,
tH，
:HNH2 SAM
甘氛拔f基
CH3NHCH2COOH &OOH SAH
SAH水解每
SH
高半胱^酸6^
(SAHH)
:HNH
2
ctkG
H2S + NH3
COOH HC
正如此处描述的，由于有效地生成了 SAHH或His SAHH,而且高半 胱氨酸酶对高半胱氨酸有高度专一的选择性，从而使所述分析SAM的通常 方法得到了改进。尽管高半胱氨酸相对低于SAM的水平，由此确信所估 SAM的量没有受到内源SAH或HC显著干扰，如果所用酶专一性较低，体 液中存在的半胱氨酸水平显著高于高半胱氨酸的水平就会产生影响。存在 焚光试剂时，本发明方法中测得终产物为硫化氬。
SAHH还催化高半胱氨酸到S-腺苷高半胱氨酸转化的逆反应，最终升 高SAM水平。该反应适用于另一类型试验， 一种测量高半胱氨酸的高半胱 氨酸的酶-转化免疫测定。具体地，本发明所述SAHH或His SAHH将高 半胱氨酸定量地转化成SAH,并接着利用标准ELISA试验测量终产物SAH。 通过提供充足的或较高的(甚至过量的)SAH使其得以实现。或者，针对SAH 的荧光抗体可用来定量生成的SAH。例如，该免疫测定可用于试剂盒并且 在约为1-lOOpM的范围内可用于血浆高半胱氨酸的测定。
本发明所述SAHH或His 'SAHH还可用作药剂，特别是在筛选酶的抑 制物和失活物时用作药剂并且可能用于例如癌症，痴疾，关节炎和其它疾 病的治疗。优选试剂盒形式的SAHH药物，该试剂盒包括一种试验，由于 结合高半胱氨酸和利用二烷基苯二胺试剂例如DBPDA测量生成的辟"匕氢， 所以该试验比较简单。
重组SAHH的其它用途包括与SAH类似物结合的治疗性癌基因，充当 激活有毒力前体药物的酶，该前体药物毒力由SAHH释放的毒性腺苷类似 物来提供。所述腺苷类似物在和Hcy结合成SAH类似物时没有毒性。也可 应用高半胱氨酸类似物，例如结合腺苷或腺苷类似物的硒代高半胱氨酸，其结合SAHH和rMETase基因治疗在癌细胞中释放由所述两基因转导的非 常毒的硒醇及有毒腺苷类似物。
优选的实施方案包括分析样品的试剂盒。优选的是，试剂盒中含有试 验操作说明，该说明可印在试剂盒中的包装插页(insert)上，包装或标签上。 要印的还可印在试剂盒中的容器及样品标签上，并且试剂体积要在试验容 器上标明。精确说明随所检测物质和/或所用检测方法而定，但是可包括下 述说明的一项或多项如果必要，试剂盒组分和/或样品稀释说明，各试验 所用酶体积或浓度说明，试验中所加样品体积说明，所加发焚光试剂说明， 产物测定说明，优选的是温度条件，组分添加和混合时间及校准试验结果 用到的标准。
本发明可通过任何常规方法制备SAHH。通过实施例但并非对本发明 范围的限制，用编码本发明SAHH的合适载体首先转化表达该酶的细菌。 接着，在液态培养基上培养(发酵)该转化细菌许多小时，直至达到高密度。 如果SAHH编码序列受诱导启动子调控，则可加入合适诱导物。结束培养 后，接着就可离心收获细胞，不用时冷冻储存。
先解冻并融化冷冻细胞，然后添加组分沉淀细胞石卒片。离心收集碎片， 得到的上清中含有SAHH活性。在准备好的层析柱上上样之前，先用合适 緩沖液稀释上清。梯度洗脱出所述SAHH,或更优选的是一步微体积洗脱。 然后制成储存制剂以备用。
除了上述提供的一步纯化方法外，可用亲和层析法纯化含组氨酸标记 的SAHH。通过实施例但并不限于本发明，按照上面所描述的来培养和收获 表达带组氨酸标记的SAHH的细菌细胞。接着如上所述解冻并破碎冷冻细 胞，制成细胞悬浮液，向悬浮液中加入固态硫酸氨，并将混合物置于水上， 然后离心。随后收集含有SAHH活性的上清，并在预先准备好(已平衡)的 Ni-NAT层析柱上样，冲洗该柱，实施一步洗脱法。在制成制剂冷冻储存之 前，要先汇集活性成分并对其进行透析。
如下面实施例所述，根据下述步骤SAHH编码序列从阴道毛滴虫 (7Hc/zomowoy vag/加/^)克隆并在大肠杆菌中表达。在此提供编码SAHH基 因的核苷酸序列，与野生型序列比较，如图6a-c所示与Minotto等，1998 公开的序列相当。所述两序列的比较显示出11处点突变。在下面表1列出。
表l SAHH序列的比较
有11处点突变野生型A/C's氨基酸的变化
No. 19(G)CT(A)CTAla. —Thr.
No.201GC(G)GC(C)
No,207CT(T)CT(C)
No210AT(T)AT(C)
No.501GT(C)GT(T)
No.744GT(G)TG(C)
No.834GG(G)GG(C)
No,897CC(T)CC(A)
No.917G(T)CG(C)CVal. —Ala.
No.1314GA(T)GA(A)Asp. — Glu.
No.1346G(T)TG(C)TVal. — Ala.
本发明SAHH酶具有良好性质。例如，SAHH有高度特异性活性至少 为1.5U/ml。此外，本发明SAHH克隆高度表达20%总细胞蛋白。而且， 附图2和图5显示本发明方法制成的SAHH具备高度稳定性。例如，附图2 和图5分别显示SAHH和SAHH . His在45。C可保持三天稳定而无活性丧失。
下面实施例用于说明但并不限制本发明。 实施例1 在pOE-30表达载体里克隆SAHH基因
使用寡核苷酸引物通过PCR扩增编码阴道毛滴虫(T. vaginalis)(Bagnara 等，1996)SAHH的基因组序列，该寡核苷酸引物分别包含在上游(有义)和下 游(反义)引物中改造的Bam/Z/和尸W/的限制酶切位点(两种情况中以下划线 标明限制位点)上游引物，5'TTTTGGATCCGCTTGCAAATCACCTGCTGG TGC3';下游引物，3'CTGCTATCGAGGGGGACGTCTTTT5'。将重组表达 载体pQE-30转化入大肠杆菌C&c/zen'c/n'a co/Z)宿主菌抹M15[pREP4] (Villarejo和Zabin, 1974) (QIAGEN)。 实施例2 重组SAHH的表达，纯化和分析
含pQE-30-SAHH构建体的克隆在含氨千青霉素(100吗/ml)和卡那霉素 (25昭/ml)大肠杆菌M15中过夜生长。O.lmM IPTG诱导表达，接着在39°C 伴随用力振荡生长14小时。于50mM磷酸钠，pH8.0, 300mMNaCl中超声 处理以破碎收获的细胞。随后12000g离心20分钟。用50mM磷酸钠，pH 6.0, 300mMNaCl，含各种浓度咪唑的10 %甘油从M-NTA柱上差异洗脱出该重组酶。纯化重组酶级份不加甘油的于4'C储藏。而其它级份与甘油混合后(终 浓度50。/。)储存在-2(TC和-79。C以确定酶活性受到储藏的影响。通过 Pharmacia Biotech SMART层析系统的尺寸排阻毛细管层析法(Superdex 200PC柱)在未变性情况下分析活性重组酶大小。 实施例3 SAHH在大肠杆菌里的表达
在大肠杆菌里已获得SAHH基因表达，该宿主大肠杆菌提供一种 SAHH-阴性环境(Shimizu等，J所oc/zem， 141， 385-392, 1984)。在37。C用 l-2mM IPTG诱导时，含重组SAHH基因序列大肠杆菌克隆高度表达该酶， 但主要是不溶的"包涵体"。温度降低到3(TC并且IPTG浓度降到O.lmM会 降低表达水平，导致较大比例地表达可溶性和有活性形式的酶。重组SAHH 包含约12%总可溶蛋白。 实施例4 重组蛋白的纯化和特征
通过在Ni-NTA柱上亲和层析来纯化重组的SAHH。该酶分子量约为 55,000-56,000(图1)。利用Superdex 200 PC毛细管柱所得尺寸排阻层析法的 结果显示未变性条件下重组酶分子量约为55,000。在这些条件下该酶具有 活性，SDS-PAGE显示亚基分子量约为55,000-56,000,这些数据显示7: vag/"a&酶的功能形式是单体。该结果不同于其他人的发现，他们发现水解 酶以寡聚形式存在，酶的来源决定四级结构。 实施例5 S-腺苷-L-高半胱氨酸水解酶的发酵与纯化 发酵
1. 取肥大细胞库10iul细菌接种到5mlL.B.上，37。C振荡培养6小时。
2. 取步骤1中0.5ml细菌转移到3个含400ml L. B.的瓶中，37。C振荡 培养过夜。
3.4°C, 3000rpm离心收集细胞，将其悬浮于L.B.中并接种发酵。
4. 细胞在发酵器中28。C培养约6小时至其密度为OD600为7。
5. 加入O.lmMIPTG诱导细胞，28。C过夜培养。
6. 4°C， 4000rpm离心收获细胞，-80°0储存以备纯化。 纯化
1. 匀浆器中匀化3次以分解细胞。
2. 细胞分解液与2。/。PEL, 30%乙醇，8。/。PEG混合，在水浴锅中加热 到37°C。
3. 15000rpm离心30分钟去除细胞;f片，收集上清。4. 加入20mM磷酸钾緩沖液,pH 8.3,lmM DTT和EDTA稀释上清两倍。
5. 将上清加到预平衡的DEAE-琼脂糖快速流柱上。
6. 该柱预先要用20mM磷酸钾緩冲液，pH7.6， 40mMNaCl， lmMDTT 和lmMEDTA预沖洗至0D280低于0.2。
7. 用20mM磷酸钾缓沖液，pH7.6， 100mM NaCl， lmM DTT和EDTA 洗脱SAHH。
8. 向SAHH洗脱液中加入30%甘油和lmMNAD制得终产物。 专一性
高度表达的克隆表达SAHH占总蛋白20%，纯化后，SAHH特异活性 为1.64单位/毫克蛋白。纯度超过90%。 稳定性
如下所述配制该酶20mM磷酸钾缓冲液，pH7.6, 100mMNaCl, 30 % 甘油，lmM DTT, lmM NAD和lmM EDTA。见图2。 实施例6 SAHH活性的测量 试剂分析緩沖液
20mM磷酸钾緩部液，pH 8.0, lmM DTT和lmM EDTA。
2mM S-腺苷-L-高半胱氨酸(SAH)
rHCYase(5毫克/毫升)
L-高半胱氨酸(各种浓度)
40mMDBPDA,溶于6M盐酸中。
40mM高4失氰化钾
{式-验方法
空白 标准曲线 试验
分析緩冲液(pl) 940 970 920
rHCYase(pl) 10 10 10
L-高半胱氨酸(nl) — 20 …
SA称1) 50 —- 50
样品(fil) —- … 20
充分混匀，37。C培养5分钟。
DBPDA(iil) 50 50 50
高铁氰化钾((il) 50 50 50
充分混匀，37。C培养10分钟。读取675nm吸光度或EX665nm/EM690nm荧光值。 一个单位定义为37。C在rHCYase过量存在下1分钟水解S-腺苷高 半胱氨酸1jiM。
实施例7 rSAHH His标记的制备
为构建表达载体，通过PCR修饰SAHH基因，5'引物为 CATCATCATCATCATCACGCTTGCAAATCACCTACTGG
6 x His . Tag
及3'引物为ATGCATGGATCCTTAATAACGGTAAGCATC。
BamHI
pTrc99A(Pharmacia Biotech)用作表达载体。修饰的His tSAHH在SAHH 基因N端有6个额外组氨酸密码，在NcoI-钝端和BamHI位点将其插入。 大肠杆菌JM109为His . SAHH表达的宿主菌抹。 实施例8 具有组氨酸标记的重组S-腺苷高半胱氨酸水解酶纯化 细胞破碎
解冻500g表达SAHH的大肠杆菌冷冻细胞(-80。C)，将其悬浮于500ml 20mM磷酸钾緩沖液，pH7.6,其中含有lmM DTT和lmM EDTA。用匀浆 器(Hc-8000， Microfluidics International Corporation)于5000psi三次石皮碎细月包。 石克酸铵沉淀
向破碎细胞悬浮液中加入结晶硫酸铵(20 % W/V)，冰上混合20分钟后， 在4。C, 12000rpm离心30分钟，然后收集上清以备进一步纯化。 Ni-NAT Superflow层析
将含有10mM咪唑的澄清上清加到用结合缓冲液(Binding Buffer)(50mM磷酸钾緩沖液，pH 7.6， 0.5M NaCl, 10mM咪唑，lmM EDTA 和0.01 % a-巯基乙醇)平衡过的Ni-NAT Superflow柱中(2.0 x 20cm)。用3 倍柱体积结合缓沖液冲洗该柱使其280nm的吸光度值达到基线，然后用冲 洗緩沖液(50mM磷酸钾緩沖液，pH 7.6, 0.5M NaCl, 50mM咪唑，lmM EDTA 和0.01 % a -巯基乙醇)沖洗使其280nrn的吸光度值达到基线。洗脱緩沖液 (50mM石岸酸钾纟爰冲液，pH 7.6, 0.5M NaCl, 300mM咪唑，lmM EDTA和lmM DTT)洗脱酶。汇集活性级分并用含lmM DTT和lmM EDTA 50倍体积 20mM磷酸钾緩沖液透析。终产物用30%甘油和lmMNAD储存在-80。C。
用^5克酸铵和亲和层析两步程序来纯化重组SAHase,该程序特别快而且 有效。该制品通过SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳产生一条带。上述方法纯化 rSAHase特异活性为1.79单位/毫克蛋白。序列表
〈110〉抗癌公司(Anticancer, Inc.) 徐明旭(Xu， Mingxu) 韩庆宏(Han， Qinghong)
〈120〉高特异活性重组S-腺苷高半胱氨酸酶(SAHH)的制备 与高度表达及对S-腺苷甲硫氨酸(SAM)的改进分析
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<140〉 PCT/US 01/01114 〈141〉 2001—0H2
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<170〉 FastSEQ for Windows Version 4.0
〈210〉 1
<211〉 1461
<212> DNA
<213〉阴道毛滴虫(Trichomonas vaginalis)
<400〉 1
atggcttgcs
catgttctcg
cttcgtgagc
cacatgacag
agatgggctt
ggcccaacag
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ggctgactacatcaacgttccagttgagggtccttacaag1440
accgttatta1461
<210〉 2
〈211〉 485
<212〉 PRT
<213>阴道毛滴虫(Trichomonas vaginalis)<400> 2
AlaCysLysSerProThrGlyAlaProPheGluTyrArglieAlaAsp
151015
lieAsnLeuHisValLeuGlyArgLysGluLeuThrLeuAlaGluLys
202530
GluMetProGlyLeuMetValLeuArgGluArgTyrSerAlaSerLys
354045
ProLeuLysGlyValArglieSerGlySerLeuHisMetThrValGin
505560
ThrAlaValLeulieGluThrLeuThrAlaLeuGlyAlaAspValArg
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TrpAlaSerCysAsnliePheSerThrGinAspThrAlaAlaAlaAla
859095
lieValValGlyProThrGlyThrProGluLysProAlaGlyliePro
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ValPheAlaTrpLysGlyGluThrLeuProGluTyrTrpGluAsnThr
115120125
TyrArgAlaLeuThrTrpProAspGlyGinGlyProGinGinValVal
130135140
AspAspGlyGlyAspAlaThrLeuLeulieSerLysGlyPheGluPhe
145150155160
GluThrAlaGlyAlaValProGluProThrGluAlaAspAsnLeuGlu
165170175
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275280285
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325330335
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355360365
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Asp Ala Tyr Arg Tyr 485
<210> 3 <211〉 33 <212〉 DNA <213〉人工序列
<220〉
<223>上游引物
<400〉 3
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<210〉 4
<211〉 24
<212〉 DNA <213〉人工序列
33
<220〉
<223〉下游引物 <400〉 4
ttttctgcag ggggagctat cgtc 24
<210〉 5 〈211〉 38 〈212〉 DNA <213>人工序列
<220>
<223〉引物 〈400〉 5
catcatcatc atcatcacgc ttgcaaatca cctactgg 38
<210〉 6 <211〉 30 <212〉 DNA <213>人工序列
<220〉
<223〉引物 <400〉 6
ctacgaatgg caataattcc taggtacgta 30
权利要求
1.评估生物液体样品中S-腺苷甲硫氨酸(SAM)的治疗性水平的方法，该方法包括将有效量的甘氨酸N-甲基转移酶(GMT)，有效量的S-腺苷高半胱氨酸水解酶(SAHH)或His·SAHH，以及甘氨酸加入该样品中；测量所述样品中一种或多种反应产物，其中所述一种或多种反应产物的水平与样品中SAM水平成正比。
2. 权利要求l的方法，其中被检测的产物是高半胱氨酸(HC)。
3. 权利要求2的方法，其中所述HC是由下述方法测得，该方法包括 用高半胱氨酸酶(HCYase)处理样品，并测定所述高半胱氨酸与HCYase反应 得到的至少 一种产物的浓度。
4. 权利要求3的方法，其中测得的产物是H2S。
5. 权利要求4的方法，其中所述H2S通过荧光或吸光度而测定。
6. 权利要求1的方法，其中所述SAHH包含SEQIDNO: 1编码的氨基 酸序列。
7. 分析含SAM的样品的试剂盒，该试剂盒包括SAHH或His 'SAHH， GMT,甘氨酸及使用说明。
8. —种测定S-腺苷曱硫氨酸(SAM)浓度的方法，包括 含SAM的生物样品；和有效量的甘氨酸N-曱基转移酶(GMT)，甘氨酸，以及S-腺苷高半胱氨 酸水解酶(SAHH)或N-端组氨酸标记的SAHH(His . SAHH),其中SAHH或His . SAHH活性产生一种可测定的产物以确定样品中 SAM的量。
全文摘要
本发明提供涉及SAM检测和制备的新方法及新SAHH酶活性在该方法中的应用。还提供涉及新SAHH的其它方法，组合物及试剂盒。
文档编号G01N33/68GK101298627SQ20081009000
公开日2008年11月5日 申请日期2001年1月12日 优先权日2000年1月14日
发明者徐明旭, 韩庆宏 申请人:抗癌公司