专利名称：S-腺苷甲硫氨酸(sam)和超氧化物歧化酶(sod)在制备用于治疗阿尔茨海默病的药物中的用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及S-腺苷甲硫氨酸(SAM)和超氧化物歧化酶(SOD)在制备用于治疗阿 尔茨海默病的药物中的用途。
背景技术：
阿尔茨海默病(AD)是一种分布非常广泛的神经退行性痴呆形式，其影响着相当 大比例的世界上年龄超过70岁的人群，其中男人与女人的比率为1 2。AD的发病率在不 断上升中，原因是更为常见的非遗传性AD形式开始于约70-75岁，而预期寿命由于生活标 准的提高和医学与药理学的进步而增加。该疾病还以与染色体14、19和21的某些基因座 中的突变相关的遗传传递形式存在(一个典型是唐氏综合征个体)。家族型AD的早发约 在50岁出现，并且引起脑变性，之后在2-3年中死亡。该疾病的晚发形式也引起脑变性和 死亡，但是在10年或更长的时间内。脑在神经元之间的间隙中存在大量斑块，并在神经元中(尤其是在大脑皮质、海 马和杏仁核的神经元中)、以及在具有认知功能的脑的其它部分中存在典型的神经原纤维 缠结。淀粉样蛋白斑块，也称为老年斑，是淀粉样蛋白(Αβ)肽的聚合物，Αβ肽衍生自 较大的蛋白β_淀粉样蛋白前体蛋白(APP)。APP是高保守的跨膜糖蛋白超家族的成员。在最近十年中，从事AD研究的科学家为了了解其病因学(尤其是分子机理)已经 进行大量实验。对分子组分及其调节的研究可以阐明其治疗和诊断前景。注意力已经集中 于早老蛋白(presenilins)，其在APP加工中的作用以及因而在Αβ产生中的作用似乎具有 高度意义。已经证明，这些蛋白，即早老蛋白I(PSl)和早老蛋白2 (PS2)，呈现酶活性或调 节其它酶(即分泌酶)的活性，分泌酶将APP裂解成通常可降解的代谢物(α-分泌酶)或 A β肽(β -和γ -分泌酶)。在家族性AD中，编码PSl和PS2的基因的突变导致A β的过 量生成和特别是同种型A β-42 (其是高度促淀粉状变的)的蓄积。最近，关于PSl敲除小 鼠的实验证实Y-分泌酶活性大幅降低，说明PS1，不仅属于Y-分泌酶复合物，也主要负责 Αβ的生成和蓄积。关于分泌酶，据认为BACE基因的产物可单独行使β-分泌酶断裂 作用。临床上有用的Y-和β-分泌酶抑制剂的开发可以成为对抗阿尔茨海默病的重要 武器，并且是当前神经科学中最令人兴奋的挑战之一。已经清楚地证明，PSl的活性不能被 完全抑制，因为需要这种蛋白加工转导因子Notch-Ι，一种对很多干细胞(如与红细胞生成 有关的那些)的成熟而言重要的因子。可以在能够表达与AD有关的基因的细胞培养系统中成功地研究DNA甲基化对基 因表达的调节。作为我们研究的结果，在与老化有关的调节机制方面已经发现了一个非常 有趣的迹象，即，老年人中DNA低甲基化的逐步整体增加以及在老年性痴呆患者中观察到 的同型半胱氨酸蓄积。同型半胱氨酸蓄积和DNA低甲基化在代谢上相关，因为同型半胱氨 酸不能转化成甲硫氨酸，使得代谢向着S-腺苷同型半胱氨酸的合成逆转，已知S-腺苷同型 半胱氨酸是强DNA-甲基转化酶抑制剂，并由此诱导DNA低甲基化。依照已经成熟建立的理论一很多基因在特定序列的胞嘧啶去甲基化时表达，这种生物化学方式可能导致未表达 的基因表达和正常表达的基因过表达。对于AD，这可能是事实，因为PSl即Y-分泌酶的过 表达可以间断地超过α-分泌酶活性，并由此产生Αβ肽，之后肽蓄积，并且可以在很多年 后引起该疾病。DNA甲基化在AD中的可能作用的再一迹象是发现AD患者脑中存在低得多 的死后甲基供体水平。S-腺苷甲硫氨酸(SAM)的较低可得性可能容易地导致与APP代谢有 关的基因的表达改变或增加，从而最终导致Αβ肽在老年斑中的蓄积。
已经在表达APP、PS1、PS2、BACE、α -分泌酶、γ -分泌酶的其它组分以及Notchl的 成神经细胞瘤系(SK-N-SH)上进行了初步实验。用剥夺了叶酸、维生素Β12和维生素Β6的 培养基处理培养物(为了改变同型半胱氨酸的代谢)，向培养基中加入不同浓度的SAM(以 平衡维生素剥夺的影响)。我们发现在剥夺了维生素B的培养基中PSl和BACE表达增加， 并且在施用SAM后PSl和BACE表达显著减少。在用Hpall/PCR对APP和PSl启动子进行的 实验中，我们发现PSl启动子的CpG位点之一的甲基化有显著差异。我们得出结论，可以通 过施用外源性SAM使PSl基因部分沉默。SAM的施用可以减少PSl表达，恢复有利于α-分 泌酶的代谢平衡。还用TgCRNDS株转基因小鼠和相应对照进行了实验；这些小鼠的特征在 于存在人突变的APP基因，并因此可以在短时间内形成淀粉样蛋白斑块。用完全饮食或缺 少B族维生素的饮食喂养这些动物；再次，如在细胞中一样，观察到了 PSl和BACE表达的增 加。在两个实验模型中，基因表达的改变具有增加Y-和β-分泌酶活性以及由此过 度产生Αβ的作用，与用对照饮食处理的动物相比，Αβ更快速地蓄积以形成老年斑。已经在下述出版物中报告了上述数据Fuso A. ,Nicolia V. , Cavallaro R. A. , Ricceri L. ,D' Anselmi F. , ColucciaP., Calamandrei G.和Scarpa S. 2008.在小鼠中B族维生素剥夺诱导高同型半胱氨酸血 症和脑S-腺苷同型半胱氨酸、耗竭脑S-腺苷甲硫氨酸并且增加PSl和BACE表达以及 淀粉样蛋白-β 沉禾只(B-Vitamin Deprivation Induces Hyperhomocysteinemia and Brain S-adenosylhomocsyteine, Depletes Brain S-adenosylmethionine, and Enhances PSl and BACEExpression and Amyloid-β Deposition in Mice). Mice. Mo1. Ce11. Neurosci. 37 :731_746。Fuso A. , Cavallaro R. A. , Zampelli A. , D' Anselmi F. ,Piscopo P. , Confaloni A.和Scarpa S. 2007.在成神经细胞瘤和成胶质细胞瘤细胞中通过同型半胱氨酸循环 W ^M^^iftilY - Bl (y -secretase is differe ntially modulated by alterations of Homocysteine cycle in neuroblastoma and glioblastoma cells). J. Alz. Dis. 11 :275-290。Cavallaro R. A. , Fuso A. ,D'Anselmi F.和 Scarpa S. 2006.通过 cDNA 微阵列分 析研究S-腺苷甲硫氨酸对CNS基因表达的影响(The effect of S-adenosylmethyonine on CNS gene expression studied by cDNA mycroarrays analysis). J. Alz. Disease. 9 415-419。Scarpa S.，Cavallaro R. Α.，D，Anselmi F.和 Fuso A. 2006.通过甲基化使 基因沉默对阿尔茨海默病的外遗传干预(Gene silencing through methylation :an epigenetic intervention on Alzheimer Disease) · J. Alz. Disease. 9 :407_414o
Fuso Α.，Seminara L，Cavallaro R. Α.，D’ Anselmi F.禾口 Scarpa S. 2004.同 型半胱氨酸/s-腺苷甲硫氨酸循环的改变使DNA甲基化状态失衡，随后上调β-淀粉样 蛋白产生(Homocysteine/S-adenosylmethionine CycleAlterations Unbalance DNA Methylation Status with Consequent Up-regulation of Beta-amyloid Production). Mol. Cell. Neurosci. 28(1) :195_204。Scarpa S.，Fuso Α.，D，Anselmi F.，Cavallaro R. A. 2003. S-腺苷甲硫氨酸使早 老蛋白1基因沉默对阿尔茨海默病的治疗？(S-adenosylmethionine :a treatment for Alzheimer disease ？ )FEBS Letters541(1-3) :145_148。Fuso A.，Cavallaro R. Α.，OrruL.，Buttarelli F. R.禾口 Scarpa S. 2001.在肌肉 分化中通过S-腺苷甲硫氨酸使基因沉默(Gene silencing by S-adenosylmethionine in muscle differentiation). FEBS Letters 508(3) :337_340o
US 2002/025926和US 2004/0048827中也提出SAM治疗AD的用途。后一文献证 明SAM干扰分泌酶、早老蛋白1和2以及淀粉样蛋白前体基因表达的能力。如下 报告，在所述专利申请后用标记的(氚化的)SAMe进行的研究证明该分子具有在口服施用 后到达中枢神经系统的能力。在US 5519058和CN 1099224中提出了 SOD在治疗AD中的有益作用。在US 2003/129261和WO 2005/041996中公开了包含SAM和SOD以及数种活性成 分的药物组合物，用于除AD之外的病症。发明概述现在已经发现，当S-腺苷甲硫氨酸与超氧化物歧化酶(SOD)组合施用时，其活性 可以令人惊讶地得到提高。这种酶不仅被证明能够促进S-腺苷甲硫氨酸通过血脑屏障，而 且能与SAM协同地相互作用以减少由于维生素B缺乏而引起过表达的PSl和BACE基因的表达。因此，本发明的一个方面涉及包含S-腺苷甲硫氨酸或其衍生物和超氧化物歧化 酶的产品，该产品为用于在阿尔茨海默病治疗中同时、分开或相继施用的组合制剂的形式。由于SAM和SOD的毒性极低，所以剂量可在较大范围内变化，并且将取决于多种因 素，例如患者的体重、性别和年龄。但是，一般来说，对于SAM，剂量可为200至2000mg/天， 对于SOD则可为50至IOOOmg/天。SAM可以就此或以其稳定盐的形式(例如甲苯磺酸盐、丁烷二磺酸盐、甲苯磺酸二 硫酸盐、二甲苯磺酸二硫酸盐或单甲苯磺酸二硫酸盐)施用，优选口服施用。一种有利的施 用形式是在WO 2006/131382中描述的富含SAM的酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae) 细胞。通过发酵自酿酒酵母菌株获得(如申请人提交的WO 2006/131382中描述)的 S0D，也可以支撑在麦醇溶蛋白薄膜上或者使用其它胃保护技术而口服施用。作为口服途径 的替代，可以胃肠外施用，例如通过肌内注射，SAM和S0D。这些制剂的实例包括用丙烯酸或甲基丙烯酸聚合物薄膜包衣的片剂、肠溶胶囊 (gastroresistant capsules)、—·。SAM和SOD可以存在于同一剂量单位中或分开配制和施用在此情况下，可以提供 以分开的剂型包含两种药物以及包含有关其相继、同时或分开使用的说明书的试剂盒。
附图概述图Ia和Ib显示SAM和SOD在小鼠中对由剥夺了维生素B的饮食诱导的PSl和 BACE过表达的影响。图2显示在SK-N-BE系成神经细胞瘤细胞中SOD和谷胱甘肽(GSH)，单独和与SAM 组合，对PSl和BACE过表达的影响。图3显示口服施用SAM 400 μ g/天后在小鼠脑中氚标记的SAM的水平。图4显示在处理一周后对人成神经细胞瘤细胞中淀粉样蛋白-β产生的测量。图5显示SAM和SOD对用维生素B剥夺饮食处理的小鼠的红细胞和脑中氧化状态 的影响。现在借助于下述举例说明性药理学试验更详细地描述本发明。实施例1-基因表达具体来说，测试药理学浓度(400 μ g/天)的SAM对TgCRND8小鼠和相应的野生型 对照的作用。基因表达通道从细胞培养物和均浆的脑中提取RNA，并合成cDNA。0. 5 μ g总cDNA用于每个实 时反应，使用SYBR-Green试剂在0pticon2DNA Engine (MJResearch)上进行。通过标准线 性扩增曲线，先前已经确定了每对引物的扩增效率。将实验样品与特定基因的标准曲线比 较来确定存在于标准反应中的特定cDNA的量。标准获自通过阳性对照扩增的高度纯化的 PCR产物。将总cDNA水平相对于β-肌动蛋白对照(管家基因)标准化。结果表明，SAM也可以体内逆转由剥夺性饮食诱导的PSl和BACE过表达(
图1)， 并且甚至可以使其减至比对照饮食还低的水平。由于同型半胱氨酸代谢与甲基化和氧化还原反应两者均有关，所以我们测试了 各种抗氧化剂对两种基因表达的影响。用SK-N-BE系成神经细胞瘤细胞获得的第一数据 表明，SOD和谷胱甘肽(GSH)两者均抑制由维生素剥夺诱导的PSl和BACE过表达，尽管 比SAM的抑制程度低。但是，有趣的是注意到，当一起施用SOD和SAM时，它们呈现协同效 应(图2)，其进一步使两种基因的表达减至比单独用SAM观察到的水平更低的水平(低 15-20% )。实施例2-SAM摄取在细胞和小鼠上进行实验以证明SAM跨过血脑屏障。对于细胞培养物，将100 μ M SAM加至F14细胞培养基(根据试验设计，完全培养 基或剥夺维生素B的培养基)中，在96小时后终止培养。对于小鼠，通过饲喂探测针(probe needle)而口服施用400 μ g/天的SAM，并在2 个月后处死动物；根据试验设计，用完全饮食或剥夺了维生素B的饮食喂养动物。通过具有 Varian HPLC系统的HPLC来分析SAM水平。将细胞和勻浆的脑在蒸馏水中裂解，并用1. 5M PCA沉淀大分子。在实验样品之前和之后计算了标准SAM曲线。对于氚标记的SAM的分析， 如上所述处理细胞，但是处理小鼠4天以使放射性药物暴露最小化。将细胞和勻浆的脑在 蒸馏水中裂解。对裂解的脑的一部分进行超声处理，并进行离心以分离膜和细胞器；另一部 分在超声处理后用高氯酸(PCA)处理，从而分离大分子。用β计数器通过闪烁法来测量放 射性SAM的摄取。
发现SAM的胞内水平由1 μ M(对照)增至2. 5-3 μ Μ。为了确定这种增长是否是由 于外源性SAM的摄取引起的而不是在该分子的升高胞外浓度存在下内源储备物的增加，用 放射性SAM进行了试验。将100 μ M氚标记的SAM (SAM [3H])加至SK-N-BE细胞培养物中， 通过细胞裂解物和放射性计数来评价摄取。在细胞裂解物中得到1. 5 μ M的SAM放射性计 数；此值相当于使用非氚标记的SAM得到的值的1至2. 5倍增加，清楚地表明该胞内增长是 由于外源性SAM的摄取引起的。在用400 μ g/天SAM 口服处理的小鼠的脑裂解物中发现了 SAM水平的类似增长； 再次，用400和800 μ g/天浓度的SAM[3H]进行了另外的试验。在用400 μ g SAM处理的小 鼠中，总脑裂解物中增长的放射性相当于0. 5ngSAM/脑，而在用800 μ g SAM处理的小鼠中 为 Ing SAM/ 脑(图 3)。也对总脑裂解物的一部分进行超声处理，并离心获得澄清裂解物(细胞质)，该澄 清裂解物的再一部分用高氯酸(PCA)沉淀以除去蛋白质(可溶性裂解物)。有趣的是注意 至IJ，得自用SOOyg SAM处理的小鼠的可溶裂解物显示相当于0.5ng SAM的放射性水平(而 总裂解物和澄清裂解物呈现更高的水平)，说明键合外源性SAM的过量甲基官能团与其它 细胞分子缀合。实施例3-成神经细胞瘤细胞系中的淀粉样蛋白产生方法培养基和细胞培养物将成神经细胞瘤SK-N-BE人细胞系维持在具有10% FCS的F14培养基中，并转移 至完全分化培养基(对照培养基，具有FCS+ΙΟμΜ视黄酸)或转移至缺少叶酸、维生素 B12和维生素B6的分化培养基(B缺乏)。每隔一天对培养物进行再喂养，并96天后终止。动物和饮食在约3周龄时，将小鼠有系统地分配至对照饮食组或不足饮食组，随意获取食物 和水。对照(AIN-93M ；饮食A 叶酸mg 1. 98 ；维生素B12mg0. 025 ；维生素B6mg 7)和实验 饮食(AIN-93M B ；饮食B，缺少叶酸、维生素B12和维生素B6)购自Mucedola (意大利)。两 种饮食均含有磺胺噻唑以便借助于肠细菌抑制叶酸生成，并确保唯一的叶酸来源是饮 食。而且，其它三个动物组接受SAM(800g/天)或SOD (10U/天)或两种药物(SAM400g/天 和SOD 5U/天)的组合。处理一周后，将小鼠麻醉并处死，得到脑和血液。通过心穿刺将血 液收集于含有EDTA 2g/dl的试管中，并立即离心，分离出血浆和红细胞，然后贮存于-80°C 下。用PBS灌注脑，然后移出。淀粉样蛋白分析用50mM TRIS-HCl pH 7.4、150mM NaCl、0· 2 % Nonidet P_40、l % CHAPS、 2mM EDTA, PMSF (200 μ Μ)、亮抑酶肽(1 μ Μ)、抑胃酶肽A (1 μ Μ)和钙蛋白酶抑制剂 Ι(5μΜ)对勻浆的脑进行裂解。蛋白质提取物使用Αβ 1-42免疫测定试剂盒(BioSource International, Belgium)用于 ELISA 试验；ELISA 试剂盒保证在 10pg/mL(1-42)之前的良 好线性灵敏性。所有测量均进行一式三次。统计分析计算单向AN0VA，并使用Bonferroni事后 检验来评价所报告的任何显著性差异(ρ < 0. 05)。结果
从图4中所报告的数据，SAM与SOD之间的协同作用是显而易见的，并被下文报告 的统计分析所确证(总是参考图4)。B def.相对于 Ctrl :p < 0. 001B def. +SAM 和 B def. +SOD 相对于 B def. :p < 0. 001B def. +SAM+S0D 相对于 B def. :p < 0. 001B def. +SAM+SOD 相对于 B def. +SAM 和 B def. +SOD :p < 0. 00权利要求
S 腺苷甲硫氨酸(SAM)和超氧化物歧化酶(SOD)组合在制备用于治疗阿尔茨海默病的药物中的用途。
2.如权利要求1所要求的用途，其中所述药物抑制PSl和BACE的过表达。
3.如权利要求1或2所要求的用途，其中所述药物是口服施用的。
4.产品，包含(i)S-腺苷甲硫氨酸或其衍生物和(ii)超氧化物歧化酶作为唯一的活性 成分，所述产品为用于在阿尔茨海默病治疗中同时、分开或相继施用的组合制剂的形式。
5.如权利要求4所要求的产品，其中SAM为甲苯磺酸盐、丁烷二磺酸盐、甲苯磺酸二硫 酸盐、二甲苯磺酸二硫酸盐或单甲苯磺酸二硫酸盐的形式，或包含于富含SAM的酿酒酵母 细胞中。
全文摘要
本发明公开了S-腺苷甲硫氨酸(SAM)和超氧化物歧化酶(SOD)组合在制备用于治疗阿尔茨海默病的药物中的用途。
文档编号A61K45/06GK101965197SQ200980106484
公开日2011年2月2日 申请日期2009年2月25日 优先权日2008年2月29日
发明者A·富索, M·罗西尼, R·达米亚尼, S·斯卡尔帕 申请人:诺西斯有限公司