用离子液体增强生物材料的核酸扩增效率和灵敏度的方法
【专利摘要】本发明是用离子液体增强生物材料的核酸扩增效率和灵敏度的方法。用于核酸扩增的方法和装置、遏制核酸扩增抑制物的组合物和试剂盒，以及核酸扩增抑制物的遏制剂。可使用它们来高灵敏度地检测目标微生物、细胞或基因，和用于精确的分子诊断。
【专利说明】用离子液体增强生物材料的核酸扩增效率和灵敏度的方法
[0001]相关申请的交叉引用
[0002]本申请要求2012年7月26日向韩国知识产权局提交的韩国专利申请.10-2012-0081967号的权益，该申请通过引用而全文并入作为参考。
发明领域
[0003]本申请涉及用于核酸扩增的方法、遏制核酸扩增抑制物的组合物和试剂盒，以及核酸扩增抑制物的遏制剂。
【背景技术】
[0004]核酸扩增用于快速、准确地诊断生物材料的传染性疾病，并因此其重要性日益增大。然而，诊断性核酸扩增方法受以下因素影响:细胞裂解活动的干扰，复杂生物材料中各种核酸扩增抑制物对聚合酶和DNA稳定性的影响。因此，对于核酸扩增的分子诊断方法而言，期望有除去各种复杂生物材料中存在的核酸扩增抑制物的方法，以助于更准确和精确的诊断。
[0005]对于分子诊断而言，可使用多种生物物质，如粘液、血液、粪便和肉。在粪便的情况中，难以实施精确的分子诊断，因为不但样本差异很大，而且还存在血红素、胆红素、胆盐及多种复杂多糖。已进行了除去粪便样本中存在的多种核酸扩增抑制物的研究。
[0006]根据处理的顺序，可将除去核酸扩增抑制物的方法分为两条路线。一条路线是在样品制备的预处理期间除去核酸扩增抑制物。然而，该方法是有瑕疵的，因为其不但复杂，而且也受到反应、结合及洗脱缓冲液的严重影响，且其不能防止在大多数核酸扩增抑制物的预处理步骤中出现靶细胞的损失。另一种除去核酸扩增抑制物的路线是(样品制备的)后处理法；例如，将除去核酸扩增抑制物的物质加入到聚合酶链反应(PCR)主混合物中。在预处理步骤中观测到的靶细胞或DNA的损失未明显弱化是有优势的。然而，尽管已对除去核酸扩增抑制物的物质进行了研究，且已有多个产物实现了商业化，但它们的效果是不显著的。已研究了多种化学物质(乙酰胺、甜菜碱、葡聚糖、二甲基亚砜、甲酰胺、丙三醇、PEG、PVP-10等)、表面活性剂(吐温、SDS等)和生物分子(gp32单链结合蛋白、蛋白酶抑制因子等)，但它们的效果是不明显的。只有当加入BSA时，证实了轻微的除去核酸扩增抑制物的效果。然而，在该情况中，尽管材料之间的差异足够大以至于能施加BSA对核酸扩增抑制物的除去效应，但在少数样品中的效果是不明显的。
[0007]因此，仍然需要快速、准确的核酸扩增方法来检测来自于生物物质包括粪便样品中的痕量目标物质。
[0008]发明简述
[0009]本发明提供了使用离子液体的核酸扩增方法。
[0010]本发明提供了包含离子液体的核酸扩增特异性组合物。
[0011]本发明提供了包含离子液体的核酸扩增特异性试剂盒。
[0012]本发明提供了核酸扩增抑制物的遏制剂，其含有离子液体。[0013]本发明提供了核酸扩增方法，包括制备生物材料和核酸扩增混合物，并向所述生物材料和所述核酸扩增混合物的至少一个中加入离子液体；将所述生物材料与所述核酸扩增混合物混合，制备核酸扩增反应混合物；并扩增核酸，其中所述离子液体遏制了核酸扩增抑制物。
[0014]术语“反应效率”表示，在给定条件下，聚合酶链式反应(PCR)每一循环中目标核酸的扩增反应平均数(平均倍增/循环数)。PCR反应的效率受材料纯度、目标物质的量、反应条件、反应遏制剂的存在等的影响。PCR通过重复足够多的循环数来检测产物，所述循环通常如下组成:变性(其将DNA模板分离成单链)、结合引物与模板退火，以及聚合酶酶促延伸。扩增效率越高，扩增达到可检测水平所耗费的时间越少。例如，可将核酸扩增效率理解成重复整个循环所花的时间，或为了将目标核酸扩增至可检测水平以完成反应所必需的循环所花费的时间。
[0015]术语“反应灵敏度”或“检测极限(LOD) ”表示，在给定PCR条件下，能进行可靠的检测和定量的目标核酸的最低量或最少拷贝。在实时-PCR(RT-PCR)中，检测极限表示为最大反应单元(Max Rn)或循环阈值(Ct)。此外，Ct值表示循环数，是在分析了从PCR每个循环中发出的荧光信号后，发现荧光信号从估计的初步基线点(基础信号)开始显著增大的点，绘制每种材料的目标核酸拷贝数和Ct值之间的图像。
[0016]所述方法包括制备生物材料和核酸扩增混合物，以及向它们至少一个中加入离子液体。
[0017]术语“生物材料”表示可从活体生物获得的任何样品。所述生物材料可以是，哺乳动物(包括人)或微生物衍生的细胞、体液、或核酸。例如，它们可以是:粪便(feces)、尿、血液、粘液(mucus)、唾液、粘冻物(slime)、汗液、体液、组织、肉(flesh)或核酸中的任何一种，或是被稀释、洗涤、溶解 或冻干的样品。可使用从水环境(hydrosphere)或肉体(corporal)收集的样品作为生物材料，因为它们不涉及额外的核酸分离过程。使用未处理过的样品直接进行核酸扩增是有利的，因为在核酸分离期间可损失大量样品且需要耗时/费钱，尤其当所述样品量很少时。
[0018]术语“用于核酸扩增的混合物”或“用于核酸扩增的组合物”表示，除包括模板外，包括实施核酸扩增必需的所有组分的混合物，其经常称为“主混合物(master mix)”或“预混合物(pre mix)”。所述组合物可另外包括目标核酸扩增所需要的已知物质。例如，所述组合物可另外包括核酸聚合酶、其活化必需的缓冲液、辅因子和/或底物。所述核酸聚合酶可以是DNA聚合酶、RNA聚合酶、逆转录酶或它们的组合。逆转录酶合成了与RNA序列互补的DNA链作为模板。所述核酸聚合酶可具有链替换活性。例如，所述核酸聚合酶可以是至少一种来自于逆转录病毒如HIV，MMLV或AMV的逆转录酶。所述核酸聚合酶可不具有3’ 一5’核酸外切酶活性。所述混合物可包括逆转录或PCR扩增所必需的物质。例如，用于核酸扩增的混合物可包括用于聚合反应的每个约I μ Μ-50 μ M缓冲液的正向引物和反向引物，例如 pH 约 8.0-9.0 的 IOmM Tris HC1、约 40mM KC1、约 L 5mM MgCl2、每个约 250 μ M 的四种dNTP和约0.5-1U的DNA聚合酶。根据反应的量和速度，用于核酸扩增的混合物可以以高密度倍数(例如X2-X10)来使用。
[0019]术语“离子液体”表示在室温尽管与离子键合但以液态存在的物质。从化学上来分析其类似于盐；但与盐不同的是，其在室温下以液态存在且能很好地溶解多种物质。其也被评定为对环境友好的溶剂，因为在室温其不易气化从而不释放出气化的有毒物质，且因
为比有机溶剂更易于获取而可再生。其可以作为催化剂的电解质来用，或用于电池工业领
域。例如，离子液体的阳离子可以是下面的一种:
[0020]
【权利要求】
1.扩增核酸的方法，所述方法包含: 制备生物材料和核酸扩增混合物，是通过向它们中的至少一个加入离子液体来制备； 将生物材料和所述核酸扩增混合物混合，制备用于核酸扩增的反应混合物；和 扩增核酸， 其中所述离子液体遏制了核酸扩增抑制物。
2.权利要求1所述的方法，其中所述离子液体的阳离子是选自如下的至少一种:
3.权利要求1所述的方法，其中所述生物材料是选自如下的至少一种:粪便、尿、血液、粘液、唾液、粘冻物、汗液、体液、组织、肉和核酸，或被稀释、洗涤、溶解或冻干的样品。
4.权利要求1所述的方法，其中用于核酸扩增的所述反应混合物中的离子液体浓度在约 0.001%(v/v)-50%(v/v)范围内。
5.权利要求1所述的方法，其中所述核酸扩增抑制物是选自如下的至少一种:胆酸、胆盐、多糖、胆红素、肝素、蛋白水解酶、酚化合物、核酸酶、多胺、血红素、氯高铁血红素、胶原、黑色素、真黑素、肌红蛋白、蛋白酶、钙离子、脲、血红蛋白、乳铁蛋白、免疫球蛋白G、腐殖酸、手套粉末、氯化钙、乙二胺四乙酸(EDTA)和FeCl3。
6.权利要求1所述的方法，其中用于核酸扩增的所述反应混合物还包含选自如下的至少一种:牛血清清蛋白(BSA)、乙酰胺、甜菜碱、葡聚糖、二甲基亚砜(DMS0)、甲酰胺、丙三醇、聚乙二醇(PEG)、聚乙烯吡咯烷酮(PVP)-1O、Tween-20、Triton-X、十二烷基硫酸钠(SDS)、gp32单链结合蛋白、和蛋白酶抑制因子。
7.用于生物材料的核酸扩增的组合物，其包含遏制核酸扩增抑制物的离子液体。
8.权利要求7所述的组合物，其中所述离子液体的阳离子是选自如下的至少一种:
9.权利要求7所述的组合物，其中所述生物材料选自粪便、尿、血液、粘液、唾液、粘冻物、汗液、体液、组织、肉和核酸，或被稀释、洗涤、溶解或冻干的样品。
10.权利要求7所述的组合物，其中在用于核酸扩增的所述组合物中的离子液体浓度在 0.001% (v/v) -50% (v/v)范围内。
11.权利要求7所述的组合物，其中所述核酸扩增抑制物是选自如下的至少一种:胆酸、胆盐、多糖、胆红素、肝素、蛋白水解酶、酚化合物、核酸酶、多胺、血红素、氯高铁血红素、胶原、黑色素、真黑素、肌红蛋白、蛋白酶、钙离子、脲、血红蛋白、乳铁蛋白、免疫球蛋白G、腐殖酸、手套粉末、氯化钙、乙二胺四乙酸(EDTA)和FeCl3。
12.权利要求7所述的组合物，其中所述组合物还包含选自如下的至少一种:BSA、乙酰胺、甜菜碱、葡聚糖、DMSO,甲酰胺、丙三醇、PEG、PVP-10, Tween-20, Triton-X、SDS, gp32 单链结合蛋白、和蛋白酶抑制因子。
13.用于生物材料的核酸扩增的试剂盒，其包含遏制核酸扩增抑制物的离子液体。
14.权利要求13所述的试剂盒，其中所述离子液体的阳离子是选自如下的至少一种:
15.权利要求13所述的试剂盒，其中所述生物材料选自粪便、尿、血液、粘液、唾液、粘冻物、汗液、体液、组织、肉和核酸，或被稀释、洗涤、溶解或冻干的样品。
16.权利要求13的所述试剂盒，其中所述核酸扩增抑制物是选自如下的至少一种:胆酸、胆盐、多糖、胆红素、肝素、蛋白水解酶、酚化合物、核酸酶、多胺、血红素、氯高铁血红素、胶原、黑色素、真黑素、肌红蛋白、蛋白酶、钙离子、脲、血红蛋白、乳铁蛋白、免疫球蛋白G、腐殖酸、手套粉末、氯化钙、乙二胺四乙酸(EDTA)和FeCl3。
17.权利要求13所述的试剂盒，其中所述试剂盒还包含选自如下的至少一种:BSA、乙酰胺、甜菜碱、葡聚糖、DMSO,甲酰胺、丙三醇、PEG、PVP-10, Tween-20, Triton-X, SDS, gp32单链结合蛋白和蛋白酶抑制因子。
18.核酸扩增抑制物的遏制剂，包含离子液体。
19.权利要求18所述的遏制剂，其中所述离子液体的阳离子是选自如下的至少一种:
20.权利要求18所述的遏制剂，其中所述核酸扩增抑制物是存在于生物材料中的遏制剂。
21.权利要求18所述的遏制剂，其中所述核酸扩增抑制物是选自如下的至少一种:胆酸、胆盐、多糖、胆红素、肝素、蛋白水解酶、酚化合物、核酸酶、多胺、血红素、氯高铁血红素、胶原、黑色素、真黑素、肌红蛋白、蛋白酶、钙离子、脲、血红蛋白、乳铁蛋白、免疫球蛋白G、腐殖酸、手套粉末、氯化钙、乙二胺四乙酸(EDTA)和FeCl3。
【文档编号】C12Q1/68GK103571823SQ201310050007
【公开日】2014年2月12日 申请日期:2013年2月8日 优先权日:2012年7月26日
【发明者】权圣弘, 池圣敏, 黄奎渊, 金俊镐, 郑善玉, 郑盛旭, 郑元淙 申请人:三星电子株式会社