一株产l-苯丙氨酸的重组谷氨酸棒状杆菌及其构建与应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一株产L-苯丙氨酸的重组谷氨酸棒状杆菌及其构建与应用，属于代 谢工程领域。
【背景技术】
[0002] 苯丙氨酸（Phenylalanine，Phe)，即D.L-a-氨基-13 -苯基丙酸，是一种芳香族 杂环、非极性、电中性的氨基酸，有外消旋DL-型、L-型和D-型三种，具有生物活性的光学 异构体为L-苯丙氨酸（L-Phe)，比旋光度为-35. 1°。L-Phe在生物体内可被辅酶四氢生物 喋呤不可逆地转化为L-酪氨酸（L-Tyrosine，L-Tyr)，后继续分解，经转氨基生成少量苯丙 酮酸。L-Phe广泛存在于自然界中，是人体和动物所必须的8种氨基酸之一，而D-Phe在自 然界中并不存在，只有通过合成的方法获得。
[0003] L-Phe的生产技术主要包括天然蛋白质水解法、化学合成法、酶法和微生物发酵 法。其中天然蛋白质水解法由于其生产工艺相对复杂，产品质量不稳定，难以用于工业化生 产。化学合成法因其生产路线长、副产物多且产物为消旋不宜推广使用等缺点，因而逐渐被 淘汰。由于酶法具有生产工艺简单、产物浓度高、纯化步骤简单等特点是目前工业化L-Phe 的主要生产方式之一，微生物发酵法具有原料廉价易得、环境污染较小，产物浓度高等优点 成为国内外工业化生产L-Phe的主要方法。
[0004] 谷氨酸棒杆菌中L-Phe合成途径主要分为三个部分：1、中心碳源代谢途径提供两 个前体物质，来源于糖酵解途径的磷酸稀醇式丙酮酸（Phophoenolpyruvate,PEP)以及来 源于磷酸戊糖途径的4-磷酸-赤藓糖（Erythrose-4-phosphate,E4P) ;2、莽草酸途径是芳 香族氨基酸合成的共同代谢途径；3、分支酸路径，以分支酸（Chorismate)为节点通过不同 的酶作用分别流向三种不同的芳香族氨基酸L-Phe，L-酪氨酸和L-色氨酸。
[0005] 虽然大肠杆菌发酵生产L-苯丙氨酸能到很高的水平，但大肠杆菌由于其自身的 特点而在大工业化生产中受到了限制，尤其在制备食品级的大工业化生产中。这是因为大 肠杆菌本身是一种条件致病菌，所生产的重组蛋白、有机酸等产物中残留有大肠杆菌的相 关抗原，从而易引起人或其他动物的免疫反应，这是公众卫生所不能接受的；此外，大肠杆 菌是一种很好的噬菌体宿主菌，在大工业化发酵生产中极易遭受噬菌体的感染。
[0006] 谷氨酸棒杆菌是一种食品级的微生物，本发明旨在提供一种L-苯丙氨酸产量提 高的重组谷氨酸棒状杆菌。
【发明内容】
[0007] 本发明要解决的第一个技术问题是提供一株产L-苯丙氨酸的重组谷氨酸棒状杆 菌，是在谷氨酸棒状杆菌（Corynebacteriumglutamicum)中过量表达了八个L-Phe合成 途径的八个关键酶基因：aroF^G-脱氧-D阿拉伯庚酮糖-7磷酸合酶），aroE(莽草酸脱 氢酶），PPsA(磷酸稀醇式丙酮酸合成酶）、tktA(转酮酶）、pheA^V双功能酶分支酸变位 酶/预苯酸脱水酶），aroA(5-烯醇丙酮酸莽草酸-3-磷酸合酶），tyrB(氨基转移酶）和ar〇L(莽草酸激酶）。
[0008] 在本发明的一种实施方式中，所述谷氨酸棒状杆菌是谷氨酸棒状杆菌ATCC 13032。
[0009] 在本发明的一种实施方式中，aroFfbl:的核苷酸序列如SEQIDNO. 1所示，aroE的 核苷酸序列如GeneID: 3343183所示，ppsA的核苷酸序列如GeneID: 14791674所示，tktA 的核苷酸序列如GeneID:3343601所示，pheAfbl:的核苷酸序列如SEQIDNO. 2所示，aroA 的核苷酸序列如GeneID: 3345010,tyrB的核苷酸序列如GeneID: 12933673所示，aroL的 核苷酸序列如GeneID: 12930837所示。
[0010] 在本发明的一种实施方式中，aroFfbI，aroE，ppsA和tktA与pEC-XK99E连接后转 化谷氨酸棒状杆菌；pheAfte，aroA，tyrB和aroL与pXMJ19连接后转化谷氨酸棒状杆菌。
[0011] 在本发明的另一种实施方式中，aroFfbI^aroE融合，ppsA与tktA融合，连接表达 载体PEC-XK99E后，在aroF^-aroE、ppsA-tktA前分别插入启动子Ptac和Plac构建重组 质粒pEC-XKggE-Ptac-aroF^r-aroE-Plac-ppsA-tktA，简写为pSUTL;pheAfbr与aroA融合， tyrB与aroL融合，连接表达载体pXMJ19后，在pheAM-aroAUyrB-aroL前分别插入启动子 Ptac和Plac构建重组质粒pXMJ19-Ptac-pheAfbr-aroA-Plac-tyrB_aroL，简写为pSDTL〇
[0012] 所述启动子Ptac由Trp启动子和Plac启动子杂合而成，受IPTG诱导，具有更高 的转录效率。
[0013] 所述启动子Plac受IPTG诱导，其强度约为Ptac启动子强度的1/11。
[0014] 本发明要解决的第二个技术问题是提供一种构建所述产L-苯丙氨酸的谷氨酸棒 状杆菌的方法，是将aroFfto、aroE、ppsA、tktA连接到一个表达载体，将pheA11'aroA、tyrB和aroL连接到一个表达载体，共同转化谷氨酸棒状杆菌。
[0015] 在本发明的一种实施方式中，aroFfbI，aroE，ppsA和tktA与pEC-XK99E连接后转 化谷氨酸棒状杆菌；pheAfte，aroA，tyrB和aroL与pXMJ19连接后转化谷氨酸棒状杆菌。
[0016] 在本发明的另一种实施方式中，aroE融合，ppsA与tktA融合，连接表达 载体PEC-XK99E后，在aroF^-aroE、ppsA-tktA前分别插入启动子Ptac和Plac构建重组 质粒pEC-XKggE-Ptac-aroF^r-aroE-Plac-ppsA-tktA，简写为pSUTL;pheAfbr与aroA融合， tyrB与aroL融合，连接表达载体pXMJ19后，在pheAM-aroAUyrB-aroL前分别插入启动子 Ptac和Plac构建重组质粒pXMJ19-Ptac-pheAfbr-aroA-Plac-tyrB_aroL，简写为pSDTL〇
[0017] 本发明要解决的第三个技术问题是提供一种应用所述产L-苯丙氨酸的重组谷氨 酸棒状杆菌发酵生产L-Phe的方法，是将种子培养基接入发酵培养基中，同时加入1.OmM IPTG诱导质粒表达重组酶，置于巡回式摇床（200-300r/min)上，30°C发酵培养60-80h。
[0018] 种子活化培养基（LBG) (g/L):蛋白胨10. 0,酵母膏5. 0,氯化钠10. 0,葡萄糖5. 0， 装液量 20mL/250mL。
[0019] 种子活化培养基（LBG固体）（g/L):葡萄糖5.0,酵母粉5.0,蛋白胨10.0,氯化钠 10. 0,营养琼脂15. 0?20. 0。
[0020] 发酵种子培养基（g/L):葡萄糖25. 0,玉米浆干粉17. 5,硫酸铵5. 0,硫酸镁0. 5， 磷酸二氢钾 1. 〇,尿素 2. 0,pH6. 8-7. 0。装液量 20mL/250mL。
[0021] 发酵培养基（g/L):葡萄糖100. 0,玉米浆干粉6. 0,硫酸铵25. 0,硫酸镁0. 5,磷酸 二氢钾1. 0,柠檬酸钠2. 0,碳酸钙20. 0,pH6. 8-7. 0。装液量20mL/250mL。
[0022] 谷氨酸棒杆菌培养基根据需要添加对应的抗生素：氯霉素（17mg/L);硫酸卡那霉 素（25mg/L)，IPTG添加量终浓度为1.OmM，发酵诱导时间为Oh诱导。
[0023] 种子培养：接种一环LBG平板种子于发酵种子培养基，置于巡回式摇床（200r/ min)上，30°C培养 18h。
[0024] 发酵培养：按10%接种量将种子培养基接入发酵培养基中，同时加入1.OmMIPTG 诱导质粒表达重组酶，置于巡回式摇床（200r/min)上，30°C发酵培养72h。
[0025] 本发明的有益效果：本发明在谷氨酸棒杆菌模式菌株C.glutamiucmATCC 13032中，采用两个质粒pEC-XK99E和pXMJ19对L-Phe合成途径不同来源的八个关键 酶基因（aroF1^，tktA，ppsA，aroL，pheA1^，aroE，aroA，tyrB)结合两个启动子Ptac 和Plac进行调控