一种快速筛选分离异养硝化-好氧反硝化细菌的方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及菌株的分离筛选，具体涉及一种异养硝化-好氧反硝化细菌的分离筛选方法，属于环境微生物领域。
[0002]
【背景技术】
[0003]含氮废水的处理是目前环境污染治理中的重大问题。生物脱氮是目前被公认的废水脱氮中最经济、最有效的方法之一。传统氨氮废水是通过自养硝化细菌的硝化作用与异养反硝化细菌的反硝化作用的组合工艺将氨氮转化为氮气从而实现废水脱氮。由于硝化和反硝化的工艺条件不同，需分别在两个系统中完成，造成了两方面不足:首先是处理过程能耗大，其次是处理工程投资大，设备复杂、运行成本高。而且硝化细菌通常是自养硝化菌，增殖缓慢，容易在废水生物处理系统中被淘汰，从而影响废水生物处理系统脱氮效果的稳定性。因此国内外学者一直在寻找高效低耗的脱氮工艺。
[0004]为解决传统生物脱氮技术在实际操作中出现的高运行费用、高能耗、效果不稳定的问题，近年来，人们对高效、低能耗生物脱氮技术进行了研究，并在脱氮机理上做出新的探索。随着研究的深入，发现硝化过程可以由自养菌完成，也可以由异养菌完成，氮素的转化过程可以完全在好氧条件下进行。随着这些现象的不断发现，新型脱氮反应机理被提出，新型生物脱氮技术由此诞生。
[0005]虽然目前新型生物脱氮技术仍有很多机理未得到揭示，但异养硝化作用的重要性日益受到关注，特别是具有好氧反硝化特性的异养硝化细菌的发现，为污水脱氮引入了全新的概念，从理论上进一步增加了污水硝化与反硝化在一个单元内同步进行的可能性，有望克服传统处理工艺在处理效率与经济适用两方面的矛盾，实现废水高效而经济的脱氮。
[0006]但是如何筛选合适的异养硝化-好氧反硝化菌株成为这项新型脱氮技术的关键，现有的筛选该菌株的方法都存在不足之处。例如:马放、苏俊锋等异养硝化细菌的筛选方法(发明专利公开号CN 1884480A)存在筛选周期长、操作繁琐的缺点；陈微、贺月林等一种高效异养硝化细菌筛选方法、筛选的菌株及其菌剂的制备方法(发明专利公开号CN102277314A)存在分离菌株的纯化度不高，纯化代价高的缺点；张全、佟明友等一种异养硝化菌的筛选方法(发明专利公开号CN 101434905A)存在筛选条件控制苛刻、所加药品种类繁多的问题。因此寻找新的分离异养硝化-好氧反硝化菌株的方法势在必行。
[0007]
【发明内容】
[0008]针对现有技术存在的上述不足，本发明的目的是提供一种筛选分离具有异养硝化-好氧反硝化功能的菌株的方法，本发明的目的在于分离出同时具有异养硝化、好氧反硝化功能的脱氮菌株，该方法具有快速、简单、目标菌株纯度高、对实验条件要求不高的优点。
[0009]本发明的技术方案是这样实现的:
一种快速筛选分离异养硝化-好氧反硝化细菌的方法，步骤如下，
O目标微生物的富集培养:将从污水厂二沉池取来的水样震荡混匀后，取Iml接种于牛肉膏蛋白胨液体培养基中，在30?35°C、90?120rpm的条件下恒温震荡培育24?72h，得到培养液I;
2)目标菌种的初步筛选:对培养液I分别进行梯度为10_2、10_3、10_4、10_5、10_6、10_7、10_8、10_9倍的稀释；将稀释后得到的八个不同浓度的培养液分别接种于液体培养基I中，接种量为每200ml培养基中接种Iml稀释后的培养液I，在30?35°C、90?120rpm的条件下恒温震荡培育7?10d，得到培养液II，测试各培养液II培养前后的pH值；
3)目标菌种的进一步筛选:将PH值相对培养前降低幅度最大的培养液II样品取0.1?Iml涂布接种到固体培养基I平板中，平板倒置在30?35°C恒温培养箱培养2?4d ;挑取平板中菌落周围培养基颜色发生变化的单个菌落分别于装有液体培养基II的试管中，各自在30?35°C、90?120rpm的条件下恒温震荡培育3?5d，当试管内壁液体与空气接触部分形成明显的生物环时，得到培养液III，此时检测每个试管中氨氮和总氮的去除效果，将对氨氮和总氮有去除效果的培养液III稀释后采用平板划线的方法接种到固体培养基II平板中，平板倒置在30?35°C恒温培养箱培养2?4d ;挑取固体培养基II平板中的单个菌落分别于装有液体培养基III的试管中，在30?35°C、90?120rpm的条件下恒温震荡培育3?5d，当试管内壁液体与空气接触部分形成明显的生物环时，得到培养液IV，此时检测每个试管中硝态氮和总氮的去除效果；
4)目标菌种的纯化:将对硝态氮和总氮有明显去除效果的菌株进行纯化，利用平板划线的方法将稀释后的培养液IV接种到固体培养基II平板中，平板倒置在30?35°C恒温培养箱培养2?3d ;挑取固体培养基II平板中的单个菌落分别于装有液体培养基III的试管中，在30?35°C、90?120rpm的条件下恒温震荡培育3?5d，当试管内壁液体与空气接触部分形成明显的生物环时，得到培养液V，此时检测每个试管中硝态氮和总氮的去除效果；将对硝态氮和总氮有明显去除效果的培养液V稀释后利用平板划线的方法接种到固体培养基III平板中，平板倒置在30?35°C恒温培养箱培养2?3d ;挑取固体培养基III平板中的单个菌落分别于装有液体培养基II的试管中，在30?35°C、90?120rpm的条件下恒温震荡培育3?5d，当试管内壁液体与空气接触部分形成明显的生物环时，得到培养液VI，此时检测每个试管中氨氮和总氮的去除效果；重复以上操作，直至检测到的硝态氮、氨氮与总氮的去除效果达到稳定；
5)目标菌种纯度的验证:利用分子生物学中每个物种DNA的特异性，采用PCR-DGGE的技术手段对去除效果达到稳定的菌种进行检测；PCR扩增对象为细菌16S rRNA，上游引物为 341f-GC，5’ >CCTACGGGAGGCAGCAG〈3’，下游引物 907r，5’ >CCGTCAATTCCTTTGAGTTT〈3’；扩增程序:95°C预变性4min，然后按95°C变性30s ;低温退火45s ;72°C延伸Imin进行20个循环，该20个循环第一次退火温度为65°C，以后每个循环依次降低0.5°C，最终达到55°C的退火温度，再于该恒定退火温度下进行15个循环，该15个循环95°C变性30s ;55°C退火45s ;72°C延伸lmin，最终72°C延伸7 min ;对PCR产物进行变性梯度为40%?75%(以浓度为6%丙烯酰胺为底物配制)的变性梯度凝胶电泳实验检验，若在变性梯度凝胶电泳实验中出现单一条带，认为检测目标为单一菌种，即得到纯化目标菌种；若出现多条条带则检测目标不是单一菌种，则重复步骤4)进一步纯化，直到出现单一条带；
液体培养基I构成为=KNO3 0.5778g ;柠檬酸三钠-C 200mg ；C6H12O6-C 200mg ;琥珀酸钠-C 200mg ；乙酸钠-C 200mg ；NaCl 4g ;六种微量元素水溶液各3?5ml ；H201000ml ；pH=7.0?8.0,110°C高压蒸汽灭菌15min ；
固体培养基I构成为:NH4C1 0.3057g ；C6H1206-C 800mg ；NaCl 4g;溴百里酚蓝试剂Iml ;琼脂粉15?20g ;六种微量元素水溶液各3?5ml ；H201000ml ；pH=7.0?8.0，110°C高压蒸汽灭菌15min ;其中溴百里酹蓝试剂为0.1?0.3g溴百里酹蓝溶于10?15ml无水乙醇中制成；
液体培养基II构成为=NH4Cl 0.3057g ；C6H1206-C 800mg ；NaCl 4g ;六种微量元素水溶液各 3 ?5ml ；H20 1000ml ；pH=7.0 ?8.0,110°C高压蒸汽灭菌 15min ；
固体培养基 II 构成为=NH4Cl 0.3057g ；C6H12O6-C 800mg ；NaCl 4g ;琼脂粉 15 ?20g ;六种微量元素水溶液各3?5ml ；H20 1000ml ；pH=7.0?8.0,110°C高压蒸汽灭菌15min ；液体培养基III构成为=KNO3 0.5778g ；