工作的成功率；第二步投加混合碳源利用反硝化过程要消耗碱度这一特点对目标菌种进行初步筛选；第三步利用目标菌种使得溴百里酚蓝显色剂变色这一特点对目标菌种进行进一步分离；第四步利用氨氮和硝态氮交替使用的培养基对目标菌种进行纯化；第五步利用PCR-DGGE分子生物学技术手段对目标菌种的纯度进行鉴定。本发明有望成为实现短程硝化反硝化的先决条件之一，同时也是实现优化传统脱氮工艺需要克服诸多关键技术之一。
[0017]最后需要说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管申请人参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本技术方案的宗旨和范围，均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。
【主权项】
1.一种快速筛选分离异养硝化-好氧反硝化细菌的方法，其特征在于:步骤如下， O目标微生物的富集培养:将从污水厂二沉池取来的水样震荡混匀后，取Iml接种于牛肉膏蛋白胨液体培养基中，在30?35°C、90?120rpm的条件下恒温震荡培育24?72h，得到培养液I; 2)目标菌种的初步筛选:对培养液I分别进行梯度为10_2、10_3、10_4、10_5、10_6、10_7、10_8、10_9倍的稀释；将稀释后得到的八个不同浓度的培养液分别接种于液体培养基I中，接种量为每200ml培养基中接种Iml稀释后的培养液I，在30?35°C、90?120rpm的条件下恒温震荡培育7?10d，得到培养液II，测试各培养液II培养前后的pH值； 3)目标菌种的进一步筛选:将PH值相对培养前降低幅度最大的培养液II样品取0.1?Iml涂布接种到固体培养基I平板中，平板倒置在30?35°C恒温培养箱培养2?4d ;挑取平板中菌落周围培养基颜色发生变化的单个菌落分别于装有液体培养基II的试管中，各自在30?35°C、90?120rpm的条件下恒温震荡培育3?5d，当试管内壁液体与空气接触部分形成明显的生物环时，得到培养液III，此时检测每个试管中氨氮和总氮的去除效果，将对氨氮和总氮有去除效果的培养液III稀释后采用平板划线的方法接种到固体培养基II平板中，平板倒置在30?35°C恒温培养箱培养2?4d ;挑取固体培养基II平板中的单个菌落分别于装有液体培养基III的试管中，在30?35°C、90?120rpm的条件下恒温震荡培育3?5d，当试管内壁液体与空气接触部分形成明显的生物环时，得到培养液IV，此时检测每个试管中硝态氮和总氮的去除效果； 4)目标菌种的纯化:将对硝态氮和总氮有明显去除效果的菌株进行纯化，利用平板划线的方法将稀释后的培养液IV接种到固体培养基II平板中，平板倒置在30?35°C恒温培养箱培养2?3d ;挑取固体培养基II平板中的单个菌落分别于装有液体培养基III的试管中，在30?35°C、90?120rpm的条件下恒温震荡培育3?5d，当试管内壁液体与空气接触部分形成明显的生物环时，得到培养液V，此时检测每个试管中硝态氮和总氮的去除效果；将对硝态氮和总氮有明显去除效果的培养液V稀释后利用平板划线的方法接种到固体培养基III平板中，平板倒置在30?35°C恒温培养箱培养2?3d ;挑取固体培养基III平板中的单个菌落分别于装有液体培养基II的试管中，在30?35°C、90?120rpm的条件下恒温震荡培育3?5d，当试管内壁液体与空气接触部分形成明显的生物环时，得到培养液VI，此时检测每个试管中氨氮和总氮的去除效果；重复以上操作，直至检测到的硝态氮、氨氮与总氮的去除效果达到稳定为止； 5)目标菌种纯度的验证:利用分子生物学中每个物种DNA的特异性，采用PCR-DGGE的技术手段对去除效果达到稳定的菌种进行检测；PCR扩增对象为细菌16S rRNA，上游引物为 341f-GC，5’ >CCTACGGGAGGCAGCAG〈3’，下游引物 907r，5’ >CCGTCAATTCCTTTGAGTTT〈3’；扩增程序:95°C预变性4min，然后按95°C变性30s ;低温退火45s ;72°C延伸Imin进行20个循环，该20个循环第一次退火温度为65°C，以后每个循环依次降低0.5°C，最终达到55°C的退火温度，再于该恒定退火温度下进行15个循环，该15个循环95°C变性30s ;55°C退火45s ;72°C延伸lmin，最终72°C延伸7 min ;对PCR产物进行以浓度为6%丙烯酰胺为底物配制的梯度为40%?75%的变性梯度凝胶电泳实验检验；若在变性梯度凝胶电泳实验中出现单一条带，认为检测目标为单一菌种，即得到纯化目标菌种；若出现多条条带则检测目标不是单一菌种，则重复步骤4)进一步纯化，直到出现单一条带； 液体培养基I构成为=KNO3 0.5778g ;柠檬酸三钠-C 200mg ；C6H12O6-C 200mg ;琥珀酸钠-C 200mg ;乙酸钠-C 200mg ；NaCl 4g ;六种微量元素水溶液各3?5ml ；H20 1000ml ；pH=7.0?8.0,110°C高压蒸汽灭菌15min ； 固体培养基I构成为:NH4C1 0.3057g ；C6H1206-C 800mg ；NaCl 4g;溴百里酚蓝试剂Iml ;琼脂粉15?20g ;六种微量元素水溶液各3?5ml ；H20 1000ml ；pH=7.0?8.0，110°C高压蒸汽灭菌15min ;其中溴百里酹蓝试剂为0.1?0.3g溴百里酹蓝溶于10?15ml无水乙醇中制成； 液体培养基II构成为=NH4Cl 0.3057g ；C6H1206-C 800mg ；NaCl 4g ;六种微量元素水溶液各 3 ?5ml ；H20 1000ml ；pH=7.0 ?8.0,110°C高压蒸汽灭菌 15min ； 固体培养基 II 构成为=NH4Cl 0.3057g ；C6H12O6-C 800mg ；NaCl 4g ;琼脂粉 15 ?20g ;六种微量元素水溶液各3?5ml ；H20 1000ml ；pH=7.0?8.0,110°C高压蒸汽灭菌15min ；液体培养基III构成为=KNO3 0.5778g ；C6H12O6-C 800mg ；NaCl 4g ;六种微量元素水溶液各 3 ?5ml ；H20 1000ml ；pH=7.0 ?8.0,110°C高压蒸汽灭菌 15min ； 固体培养基III构成为=KNO3 0.5778g ；C6H12O6-C 800mg ；NaCl 4g ;琼脂粉 15 ?20g ;六种微量元素水溶液各3?5ml ；H20 1000ml ；pH=7.0?8.0,110°C高压蒸汽灭菌15min ；所述六种微量元素水溶液由 MgSO4.7H20 3.0135g、MnSO4.H2O 3.36g、H3BO3 1.12g、ZnSO4.7H20 3g、FeSO4.7H20 0.3g、CaCl20.6g 分别溶于 1000ml H2O 所得。
2.根据权利要求1所述的快速筛选分离异养硝化-好氧反硝化细菌的方法，其特征在于，所述牛肉膏蛋白胨液体培养基构成为:牛肉膏1g ;蛋白胨1g ；NaCl 5g ；H20 1000ml ；pH=7.0 ?-8.0,121 °C高压蒸汽灭菌 30min。
【专利摘要】本发明公开了一种快速筛选分离异养硝化-好氧反硝化细菌的方法，按照下述步骤进行：1、目标微生物的富集培养；2、利用目标微生物生理上的特性对目标菌种进行初步筛选；3、利用选择培养基对目标菌种进一步驯化筛选；4、利用平板划线的方法对目标菌株进行纯化；5、目标菌种纯度的验证。本发明能够筛选分离异养硝化-好氧反硝化菌种，该方法具有快速、简单、对实验条件要求不高的优点。本发明有希望成为实现短程硝化反硝化的先决条件之一，同时也是实现优化传统脱氮工艺需要克服诸多关键技术之一，在实际工程中有较大的发展潜力。
【IPC分类】C12Q1-68, C12N1-20, C12Q1-04
【公开号】CN104531595
【申请号】CN201510027377
【发明人】郭龙杰, 赵彬, 安强, 汪霞, 翟午琛
【申请人】重庆大学
【公开日】2015年4月22日
【申请日】2015年1月20日