一株异养硝化细菌菌株的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一株异养硝化细菌菌株，该菌株命名为克雷伯氏菌属细菌(Klebsiella?sp.)HLNR02，其于2013年10月保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，保藏编号为：CGMCC?No.8397；其有益效果是，该异养硝化菌株对富营养化水体中氨氮和总氮有较强的降解效果；为进一步利用该菌株对治理被氨氮类废水污染的水体进行生物法治理提供了良好的微生物材料。
【专利说明】一株异养硝化细菌菌株
【技术领域】：
[0001] 本发明涉及微生物领域的一种细菌菌株，具体涉及一株异养硝化细菌菌株。
【背景技术】：
[0002] 氮素形态转化与污水污泥脱氮效率、脱氮工艺的改良、水体富营养化的解决等密 切相关。目前解决水体的氮素富营养化的方法有物理、化学和生物方法。随着氮素污染的 不断加剧和人们对环境问题的日益重视，除氮技术，特别是生物脱氮技术已经成为控制水 体污染的重要方向和手段。
[0003] 氨氮是造成水体富营养化的污染物之一。目前普遍认为，在生物脱氮过程中，废水 中的氨氮首先被自养硝化菌在好氧条件下氧化为NCV。然后NCV在缺氧条件下被反硝化细 菌还原为气态氮如N 2等从水中逸出。传统的生物脱氮技术如生物滤池、氧化沟、生物膜处 理系统和流化床等大多采用的硝化菌群，硝化菌多为自养菌。自养菌增殖速度慢且难以维 持较高生物浓度，需先经曝气处理以降低有机物浓度，菌株才能生长并表现生物学活性，抗 冲击能力弱；高浓度氨氮和亚硝酸盐又会抑制硝化菌的生长，使硝化作用不完全，导致总氮 去除率很低。
[0004] 异养硝化细菌能够在利用有机碳源生长的同时将含氮化合物硝化生成羟胺、亚硝 酸盐、硝酸盐等产物，多数还能同时进行好氧反硝化作用，直接将硝化产物转化为含氮气 体。因此，这类细菌已成为废水处理中生物脱氮新工艺的重要研究对象。与自养型硝化菌 比较，异养硝化菌的生长速率快，细胞产量高，需要的溶解氧浓度低，能耐受酸性环境且活 性高，并且能够代谢各种形态的氮化合物。由于异养硝化菌的出现，工艺上可以实现在一个 反应器里完成硝化反硝化，不仅可以降低运行成本，减少工艺上繁琐的操作，还可以扩大自 养硝化菌所不能处理的水质范围。
【发明内容】
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[0005] 本发明要解决的技术问题是，分离筛选出一株异养硝化细菌菌株。
[0006] 本发明的技术解决方案是，从富营养化水体中分离和筛选出异养硝化菌株，该菌 株命名为克雷伯氏菌属细菌（Klebsiella sp.)HLNR02,其于2013年10月28日保藏于中国 微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（CGMCC)，地址为北京市朝阳区北辰西路1号 院3号，中国科学院微生物研究所，保藏编号为：CGMCC No. 8397。
[0007] 该菌株的生物学特性为：革兰氏阴性，异养生长，最佳碳源葡糖糖，最适宜pH值为 7. 2,最适温度28 °C。
[0008] 本发明所涉及的异养硝化细菌菌株是通过以下方法分离筛选得到的：
[0009] (1)于江西省吉安县将军湖中采集水样，取水样中的水体1L用0. 22 μ m的滤膜过 滤，用10mL无菌水冲洗滤膜，待藻沉淀后取上层清液lmL于99mL灭菌的含氨氮的富集培养 基中，将该培养基置入28°C温度，振动频率为200rpm/min的振荡培养箱中培养4d。4d后取 lmL菌液于99mL灭菌的含氨氮的富集培养基中，在上述培养条件培养4d。按同样的操作重 复3次，进行4个周期的富集培养。
[0010] (2)取步骤（1)中富集至第4周期获得的菌液lmL，加到氨氮浓度提高50%的驯化 培养基中，进行4个周期的驯化培养，接种量和培养条件同富集培养。获得驯化培养液。 [0011] ⑶从步骤（2)中获得的驯化培养液中取菌液5份，每份为lmL，分别进行梯度稀 释，选用梯度为10_3、10_4、10_5、10_6、10_ 7;从每份中分别取〇. lmL所得的稀释菌液分别涂布 于含有含氨氮的固体平板培养基中，37°C培养2d。
[0012] (4)用已灭菌的移液枪头从步骤（3)的平板培养基上挑取较大而且独立的菌落， 采用划线法接种于LB固体培养基上，于28°C培养。通过3次划线获得单菌落。单菌落在新 鲜LB培养基中再进行扩大培养，扩大培养后的菌种，部分置于-80°C冰箱内保种，部分置于 4 °C保存备用。
[0013] 本发明的有益效果在于：经多次反复试验，该异养硝化菌株对富营养化水体中氨 氮和总氮有较强的降解效果。为进一步利用该菌株对治理被氨氮类废水污染的水体进行生 物法治理提供了良好的微生物材料。
【专利附图】
【附图说明】：
[0014] 图1为菌种16S rDNA PCR-RFLP酶切电泳图；
[0015] 图2为菌株HLNR02同相近序列采用N-J法构建的系统进化树；
[0016] 图3为菌株HLNR02在模拟富营养化废水中的解氮效果。
【具体实施方式】：
[0017] 1.菌株HLNR02的分离
[0018] (1)于江西省吉安市吉安县将军湖中采集水样，取水样中的水体1L用0. 22μπι的 滤膜过滤，用10mL无菌水冲洗滤膜，待藻沉淀后取上层清液lmL于99mL灭菌的含氨氮的富 集培养基中，将该培养基置入28°C温度，振动频率为200rpm/min的振荡培养箱中培养4d。 4d后取lmL菌液于99mL灭菌的含氨氮的富集培养基中，在上述培养条件培养4d。按同样 的操作重复3次，进行4个周期的富集培养。
[0019] (2)取步骤（1)中富集至第4周期获得的菌液lmL，加到氨氮浓度提高50%的驯化 培养基中，进行4个周期的驯化培养，接种量和培养条件同富集培养。获得驯化培养液。
[0020] (3)从步骤⑵中获得的驯化培养液中取菌液5份，每份为lmL，分别进行梯度稀 释，选用梯度为1〇_ 3、1〇_4、1〇_5、1〇_6、1〇_7;从每份中分别取〇. lmL所得的稀释菌液分别涂布 于含有含氨氮的固体平板培养基中，37°C培养2d。
[0021] (4)用已灭菌的移液枪头从步骤（3)的平板培养基上挑取40株较大而且独立的菌 落，采用划线法接种于LB固体培养基上，于28°C培养。通过3次划线获得单菌落。取该单 菌落在新鲜LB培养基中再进行扩大培养。扩大培养后菌种，部分置于-80°C冰箱内保种，部 分于4°C保存，为后续试验备用。
[0022] 上述富集培养基，是指以氨氮（NH4+-N)为氮源的富集培养基，该培养基包含以下 物质组份和条件：葡萄糖58，（順 4)2304]^，1(2即040.58，1((]16311^、]\%30 42311^、无水03(]122311^、 NaHC0365mg、KH2P0423mg、微量元素溶液 2mL，蒸馏水 lOOOmL，ρΗ7· 2。
[0023] 上述LB培养基：包含有蛋白胨10g，酵母提取物10g，NaC15. 0g，ρΗ7· 2。
[0024] 上述固体培养基为液体培养基加1. 5 %琼脂粉。
[0025] 上述微量元素溶液，其配方（g· Γ1)为：ZnS042. 2, CaCl25. 5, MnCl2 · 4H205. 06， FeS04 · 7Η205· 0, CuS04 · 5Η201· 57, C0C12 · 6Η201· 61。
[0026] 2.菌株的 PCR-RFLP 分析
[0027] (1)运用巢式PCR(nested-PCR)对上述40株菌的16S rDNA进行扩增。方法如下：
[0028] 第一轮反应（体积25 μ L)含1 μ L (大约lng) DNA为模板,0. 5 μ L引物 (10μΜ)，2μ? 的 dNTP 混合物（2.5禮)，1.541^，]\%(：12(251111)，2.541^0\?〇?反应 缓冲液和〇. 2yL Taq DNA聚合酶（5U/yL，Takara公司）。第一轮反应的引物为： 27f(5， -AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-S')和 1492r(5， -TACCTTGTTACGACTT-3， hPCR 反 应程序为：94°C预变性5min，94°C 30s，55°C 40s，72°C lmin，共10个循环，最后72°C延伸 10min〇
[0029] 第二轮反应以第一轮反应的PCR产物为模板，引物为：63f (5 ' -CAGGCCTAAC ACATGCAAGTC-3')和 1389r(5' -ACGGGCGGTGTGTACAAG-3')。在这一轮反应中，设置 30 个循环，反应条件同第一轮反应。PCR结束后，产物用含1%溴化乙锭的琼脂糖凝胶电泳、检 测（大约1300bp长度的片段为目标片段）。
[0030] (2)将PCR产物分别用限制性内切核酸酶Rsal和Hhal消化（37°C，lh)。酶切DNA 片段用2%的琼脂糖凝胶电泳分离，经溴化乙锭染色和凝胶成像系统成像（见附图1菌种 16S rDNA PCR-RFLP酶切电泳图）后，所得DNA带型图谱在GIS凝胶分析软件辅助下进行 人工比较分析。以基因片段多态图谱为基础进行聚类，聚合到一起的具有相同图谱的克隆 视为相同的基因型。每一个基因型作为一个分类操作单位（OTU，Operational Taxonomic Unit)或称为唯一基因型，获得11种不同菌株，编号分别为1、2、4、12、16、22、23、27、29、37、 39 〇
[0031] 3.菌株的硝化活性检测
[0032] (1)从上述菌株的PCR-RFLP分析的步骤（2)中获得的11株菌菌液，各取lmL，用无 菌水清洗3次后分别接种于100mL新鲜的以氨氮（NH4+-N)为氮源的硝化培养基中，置于 28°C，振动频率为200rpm/min的振荡培养箱中培养ld，且每隔4小时检测培养基中氨氮浓 度（NH/-N)、亚硝酸盐氮（Ν0 2_-Ν)、硝酸盐氮（Ν03_-Ν)、总N浓度以及细菌生长的0D值；以此 同时设置空白对照组。其中，NH/-N采用钠氏试剂分光光度法；NCV-N采用N-(l-萘胺）-乙 二胺光度法；NCV-N采用盐酸-萘乙二胺分光光度法；ΤΝ采用过硫酸钾-紫外分光光度法； 细菌0D值采用利用分光光度计测定菌悬液在600nm的吸光值。
[0033] 上述氨氮（NH4+-N)为氮源的硝化培养基：葡萄糖169mg，（NH 4) 2S0437. 7lmg, KC163mg、MgS0423mg、无水 CaCl223mg、NaHC0365mg、KH2P0423mg、微量元素溶液 2mL(配方同 上），蒸馏水 1000mL，pH7.2。
[0034] (2)检测结果：11株菌在以葡萄糖为碳源，硫酸铵为唯一氮源的异养培养液中培 养生长时，氨氮初始浓度约为10. lmg/L，经检测比较份折，37号菌为脱氮效果最好的菌株 (见下表1，菌珠硝化活性，mg/L)。
[0035] 表1.菌株硝化活性
[0036]
【权利要求】
1. 一株异养硝化细菌菌株，该菌株命名为克雷伯氏菌属细菌（Klebsiella sp.) HLNR02,其于2013年10月28日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心 (CGMCC)，地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，保藏编号 为：CGMCC No. 8397。
【文档编号】C12R1/22GK104152367SQ201310750912
【公开日】2014年11月19日 申请日期:2013年12月27日 优先权日:2013年12月27日
【发明者】贺根和, 张宇燕, 梁亮亮, 李一弘 申请人:井冈山大学