专利名称：一种反硝化细菌及其用于水体植物-微生物联合修复方法
技术领域：
本发明属于环境(水体)污染治理技术领域，涉及ー种反硝化细菌及其用于水体植物-微生物联合修复方法，具体涉及ー种反硝化细菌及其用于水体氮素富营养化的植物-微生物联合修复方法。
背景技术：
随着社会经济的发展，河流污染是世界上各国都面临的问题。对城市污染水体进行治理是保护城市水资源、改善生态环境的基本措施。但常用的物理和化学修复方法一般投资昂贵、设备复杂且不适用于大面积水体污染的修复治理。而微生物(反硝化细菌)修复技术则因菌落生长受水体中含氧量、可利用碳源种类等限制不能得到广泛应用。截至目前，从自然环境中分离出的反硝化细菌大部分属兼性厌氧菌，在无氧或低氧状态下以硝酸根离子(NO3-)作为最终电子受体进行反硝化作用；在氧气浓度较高状态下其反硝化作用受 到抑制甚至停止。植物根系的呼吸作用可以降低根系区域水体或土壌的含氧量，促进反硝化细菌进行反硝化作用。此外，环境中可利用的碳源种类是影响反硝化细菌存活的重要因素，植物根系能够分泌多种碳源(糖类、氨基酸、蛋白质、有机酸)，其中含有反硝化细菌生存所必须的营养物质。大量研究表明位于植物根际区的反硝化细菌种类和数量明显高于其他区域。目前针对水体污染开展的植物或微生物修复工作已经进行了大量研究，但通过植物-微生物联合修复技术对水体氮素富营养化的治理工作研究较少。
发明内容
本发明的目的是提供一种用于水体氮素富营养化治理的反硝化细菌。本发明的另ー目的是提供该反硝化细菌的应用。本发明的又一目的是提供该反硝化细菌用于水体氮素富营养化的植物-微生物联合修复方法。本发明的目的可通过如下技术方案实现一株反硝化细菌LR，分类命名为假单胞菌LR (Pseudomonas sp. LR)，于2011年5月3日保藏于中国典型培养物保藏中心，菌种保藏号为CCTCC N0:M2011159。该假单胞菌LR从江苏省南京市富营养化河水植物根际区土壤分离得到。主要生物学特性为G_，菌体杆状。吲哚试验、葡萄糖发酵、乳糖发酵和淀粉水解试验为阴性，V. P试验为阳性；抗生素抗性试验表明LR菌株对氨苄、红霉素、氯霉素、链霉素有抗性；可利用碳源有柠檬酸钠、醋酸钠、麦芽糖、琥拍酸钠和淀粉，不可利用碳源有乳糖和鹿糖。其16S rDNA的Genbank登录号为JQ652571。所述的保藏号为CCTCC N0:M2011159的反硝化细菌LR在氮素富营养化水体污染
治理中的应用。所述的保藏号为CCTCC N0:M2011159的反硝化细菌LR联合伞草(CyperusalternifoliusL.)在氮素富营养化水体污染治理中的应用。
一种对氮素富营养化水体进行植物-微生物联合修复的方法，在氮素富营养化的水体中种植伞草，接种所述的保藏号为CCTCC NO M2011159的反硝化细菌LR ;其中每升水体种植伞草7 15株，每升水体接种浓度为106cFu/ml的保藏号为CCTCC NO M2011159的反硝化细菌LR菌液10ml。一种治理氮素富营养化水体污染的方法，在氮素富营养化的水体中添加伞草根系分泌物，并接种保藏号为CCTCC NO M2011159反硝化细菌LR，每升水体添加50ml伞草根系分泌物，每升水体接种浓度为106cFu/ml的保藏号为CCTCC NO M2011159的反硝化细菌LR菌液10ml，接种后每两天添加一次伞草根系分泌物，每次每升水体添加40 60ml，优选每次每升水体添加50ml ；其中，伞草根系经去离子水淋洗后，在相対湿度为75-80%，温度为25°C，光照强度为3000Lx 5000Lx的气候室内使用去离子水浸泡植物根系4 7h，并用旋转蒸发仪浓缩至1/10/体积；所述的伞草根系与用于浸泡根系的去离子水的质量体积比为Ig 10 30ml，优选 Ig 20ml ο
本发明所述的N素富营养化液体的标准是由国际卫生组织(WHO)于2004年公布的，其标准是 11. 3mg-N/1 (Horing, H. and Chapman, D. :Nitrates and nitritesin drinking water:World Health Organization Drinking Water Series. , IffAPublishing, London (2004).);即含氮量大于或等于11. 3mg-N/l的液体称为N素富营养化液体，含氮量大于或等于11. 3mg-N/l的水体称为N素富营养化水体。有益效果本发明从江苏省南京市富营养化河水植物根际区土壤分离得到筛选出一株具有高效反硝化细菌——假单胞菌LR，该菌株对柠檬酸盐为碳源的培养基中硝酸盐的最終降解率达90%以上，而且在较高的氮素水平下也有一定的脱氮能力将该菌株扩大培养，用于处理高N02_或高N03_的废水，将具有重要意义。在此基础上，本发明将假单胞菌LR与伞草或伞草根系分泌物联合用于修复氮素富营养化水体，菌株LR对伞草修复氮素污染水体具有促进作用。本发明提供的假单胞菌LR与伞草或伞草根系分泌物联合用于修复氮素富营养化水体的方法特别适用于自然界的氮素富营养化水体治理。该方法使得污水中反硝化细菌存活率显著提高，大幅度提高了修复系统的去氮率，节省了外源添加碳源的成本。
图I菌株LR产气测定照片。图2菌株LR在BTB平板上的菌落照片。图3菌株LR硝态氮的去除情况。图4不同碳源对菌株反硝化脱氮的影响。图5不同氮源对菌株LR生长的影响。图6C/N对菌株LR的反硝化脱氮(A)及生长(B)的影响。图7以Hoagland营养液为N素富营养化液体不同处理组的去氮率。图8以外界污水为N素富营养化液体不同处理组的去氮率。图9以外界污水为N素富营养化液体外源添加伞草根系分泌物去氮实验。
生物材料保藏信息反硝化细菌LR,分类命名为假单胞菌LR (Pseudomonas sp. LR)保藏于中国典型培养物保藏中心，简称CCTCC，保藏地址是中国武汉武汉大学，保藏日期为2011年5月3日，保藏编号为 CCTCC N0:M2011159o
具体实施例方式实施例I菌种筛选及鉴定I. I菌种分离及筛选试验所用土壤样品采自南京市若干河道边、湖泊边的水生植 物根系、污水处理厂底泥、以及连云港水稻田土壌。选取生长旺盛的植株，抖落表层大块土壌后，剰余部分作为植物根际土壌。称取采集的植物根系土壤样品10g，放入90mL含玻璃珠的无菌水中，振荡20min，静置20-30s，制成菌悬液。以10%的接种量将该菌悬液接到DM培养基中，28°C培养。无菌条件下取ImL菌悬液放入盛9mL无菌水玻璃管中，混匀，再依次制成10_2、10' 10_4、10_5、10_6各种浓度稀释液。取O. ImL上述不同浓度的稀释液分别涂布于BTB鉴别培养基上，每个浓度分别设置三个重复。28°C培养l-3d，挑取周围有蓝色晕圈的不同形态的单菌落，经多次划线进行纯化。挑取分离出来的菌株，在平板上多次划线纯化，直至显微镜下观察显示无杂菌为止，此时可认为菌株已纯化完毕。分离出的菌株在含有硝酸盐的固体培养基上生长良好，具有潜在的反硝化特性，即为待筛菌株，均接种至斜面培养基保存备用。将纯化的菌株后分别接入Giltay培养基进行复筛，28°C培养2_14d。挑选产气快、气泡多的菌株，进ー步检测培养基中亚硝态氮和总氮的含量。将筛选出反硝化活性强的菌株斜面保存。上述分离、筛选过程中使用的培养及配方为反硝化基础(DM)培养基(李妍等，2008)KN032. OgjK2HPO4L Og7MgSO4 ·7Η20 O. 2g，柠檬酸钠5g，蒸馏水lOOOmL，pH值7. 2。溴百里酚兰(BTB)鉴别培养基(TAKAYA等，2003) :L_天门冬酰胺酸I. Og,KNO3L 0g, KH2PO4L 0g, FeCl3 · 6H20 0. 05g, CaCl2 · 2H20 0. 2g, MgSO4 · 7H20 I. Og,琼脂 20g，1%溴百里酚兰ImL,蒸馏水IOOOmL, pH值7. 0-7. 3。Giltay培养基(土壤微生物研究会，1983)A溶液ΚΝ032· 0g, L-天门冬酰胺酸I. Og, 1%溴百里酹兰5mL,蒸懼水500mL ；B 溶液柠檬酸钠 8. 5g，KH2PO4L 0g, FeCl3 · 6H20 0. 05g, CaCl2 · 2H20 0. 2g,MgSO4 · 7H201. Og,蒸馏水 500mL ；混合A、B两溶液，调pH值7· 0-7. 2。通过富集分离、BTB鉴别培养基初筛及Gailty培养基复筛，最终从从江苏省南京市富营养化河水植物根际区土壤样品中分离出ー株反硝化活性最強产气反硝化细菌，菌株命名为LR，并将LR送交中国典型培养物保藏中心保藏，菌种保藏号为CCTCC NO: Μ2011159。产气照片如图I。
I. 2反硝化细菌生理生化指标测定菌株的鉴定參照《常见细菌系统鉴定手册》(东秀珠等，2001)和《Bergey’s Manualof Determinative Bacteriology〉〉(Buchanan 和 Gibbons, 1986)进打。菌株LR为革兰氏阴性杆菌，BTB固体培养基平板上形成白色圆形，扁平不透明，边缘略显突起，干燥无光泽的菌落。菌落照片如图2。菌株LR属于兼性厌氧菌，在无氧条件下，反硝化菌以硝态氮作为最终电子受体，完成硝酸盐代谢，革兰氏阴性菌，VP阳性，能使石蕊牛乳胨化。菌株LR能够利用蔗糖发酵。具体结果见表I。
表I菌株LR的生理生化特征
权利要求
1.一株反硝化细菌LR，分类命名为假单胞菌LR(Pseudomonas sp. LR)，于2011年5月3日保藏于中国典型培养物保藏中心，菌种保藏号为CCTCC NO :M2011159。
2.权利要求I所述的保藏号为CCTCCNO M2011159的反硝化细菌LR在氮素富营养化水体污染治理中的应用。
3.权利要求I所述的保藏号为CCTCCN0:M2011159的反硝化细菌LR联合伞草(Cyperus alternifolius L.)在氮素富营养化水体污染治理中的应用。
4.一种对氮素富营养化水体进行植物-微生物联合修复的方法，其特征在于在氮素富营养化的水体中种植伞草，接种所述的保藏号为CCTCC NO M2011159的反硝化细菌LR ；其中每升水体种植伞草7 15株，每升水体接种浓度为106cFu/ml的保藏号为CCTCC NO M2011159的反硝化细菌LR菌液10ml。
5.一种治理氮素富营养化水体污染的方法，其特征在于在氮素富营养化的水体中添加伞草根系分泌物，并接种保藏号为CCTCC NO M2011159反硝化细菌LR，每升水体添加50ml伞草根系分泌物，每升水体接种浓度为106cFu/ml的保藏号为CCTCC NO M2011159的反硝化细菌LR菌液10ml，接种后每两天添加一次伞草根系分泌物，每次每升水体添加40 60ml ;其中，所述的伞草根系分泌物通过如下方法收集制备伞草根系经去离子水淋洗后，在相対湿度为75%-80%，温度为25V，光照强度为3000Lx 5000Lx的气候室内使用去离子水浸泡植物根系4 7h，并用旋转蒸发仪浓缩至1/10/体积；所述的伞草根系与用于浸泡根系的去离子水的质量体积比为Ig 10 30ml。
6.根据权利要求5所述的对氮素富营养化水体进行植物-微生物联合修复的方法，其特征在于所述的伞草根系与用于浸泡根系的去离子水的质量体积比为Ig :20ml。
全文摘要
本发明公开了一种反硝化细菌及其用于水体植物-微生物联合修复方法。反硝化细菌LR，于2011年5月3日保藏于中国典型培养物保藏中心，菌种保藏号为CCTCC NO:M2011159。一种对氮素富营养化水体进行植物-微生物联合修复的方法，在氮素富营养化的水体中种植伞草，接种反硝化细菌LR。本发明将反硝化细菌LR与伞草或伞草根系分泌物联合用于修复氮素富营养化水体，菌株LR对伞草修复氮素污染水体具有促进作用。本发明提供的反硝化细菌LR与伞草或伞草根系分泌物联合用于修复氮素富营养化水体的方法特别适用于自然界的氮素富营养化水体治理。
文档编号C02F3/34GK102676431SQ20121014816
公开日2012年9月19日 申请日期2012年5月14日 优先权日2012年5月14日
发明者冯志航, 夏妍, 李星惠, 毛颖, 沈振国, 王桂萍, 陆辰晨, 陈亚华 申请人:南京农业大学