一种以葡萄糖酸作唯一碳源进行发酵生产细菌纤维素的优化方法
【专利摘要】本发明公开了一种以葡萄糖酸作唯一碳源进行发酵生产细菌纤维素的优化方法，步骤如下：确定木醋杆菌以葡萄糖酸作唯一碳源需要考虑的发酵参数，所述发酵参数包括发酵液pH、气液比以及接种量；利用Design Expert8.0.6.1软件根据Box?Behnken Design确定实验方案；按照所确定的Box?Behnken Design实验方案完成各组实验，得到对应的各组细菌纤维素产量；根据各组细菌纤维素的产量，采用Design Expert8.0.6.1软件建立响应面模型，确定优化的发酵参数组合。本发明提高了葡萄糖酸的利用率从而提高葡萄糖利用率，进而提高了细菌纤维素最终产量，对于减少资源浪费、降低发酵成本有很大意义。
【专利说明】
-种从葡萄糖酸作唯一碳源进行发酵生产细菌纤维素的优化 方法
技术领域
[0001] 本发明属于微生物发酵技术领域，特别是一种W葡萄糖酸作唯一碳源进行发酵生 产细菌纤维素的优化方法。
【背景技术】
[0002] 细菌纤维素 (Bacterial Cellulose,简称BC)是由W木醋杆菌为代表的少数微生 物发酵而成的具有广阔开发前景的生物材料，自1886年被发现W来，学者对其的研究从未 间断。细菌纤维素的诸多特异性使其可用在食品、生物医学材料及造纸等诸多领域。
[0003] 目前，国内外对细菌纤维素研究的重点集中在细菌纤维素产量的提高和改性研究 方面，提高细菌纤维素产量的途径主要包括选育高产菌种、优化工艺条件、改进发酵方式与 设备及探讨代谢机理等。
[0004] 在细菌纤维素的工业生产中，葡萄糖酸作为副产物会大量的生成。由于来自发酵 罐中的机械揽拌或气升罐较高的气含率（gas hold叩）和比气液接触介面化igher gas holdup and specific gas-liquid inte;rface)的良好溶氧条件，使得运种现象在发酵罐 中尤其明显。因此，经摇瓶实验或浅盘静态培养优化的培养基组成或一系列工艺参数所获 得的较高细菌纤维素产量在中式发酵罐中会被大打折扣。减少葡萄糖酸的生成，使葡萄糖 更多的流向目的产物细菌纤维素是提高细菌纤维素产量及葡萄糖利用率的根本出发点，运 似乎已经成为业内共识。事实上，即便对于变异菌株，葡萄糖酸的大量生成仍然是不可避 免，更不必说当其在发酵罐中培养。
[0005] 目前，产生细菌纤维素的方法中的发酵培养基大都是W葡萄糖或者是W葡萄糖和 薦糖为碳源的发酵前期的优化，葡萄糖酸由葡萄糖氧化生成，并作为副产物大量的残留于 发酵液中，不仅降低了细菌纤维素的产量，而且造成了葡萄糖利用率的降低。
【发明内容】
[0006] 本发明的目的在于提供一种W葡萄糖酸作唯一碳源进行发酵生产细菌纤维素的 优化方法，通过模拟W葡萄糖酸作为唯一碳源的发酵情况并对其工艺参数进行优化，通过 提高葡萄糖酸利用率来提高葡萄糖利用率，进而提高细菌纤维素最终产量，减少资源浪费、 降低发酵成本。
[0007] 实现本发明目的的技术解决方案为:一种W葡萄糖酸作唯一碳源进行发酵生产细 菌纤维素的优化方法，步骤如下：
[000引步骤1，确定木醋杆菌W葡萄糖酸作唯一碳源需要考虑的发酵参数，所述发酵参数 包括发酵液pH、气液比W及接种量；
[0009] 步骤2,利用Design Experts.0.6.1软件根据Box-Beh址en Design确定实验方案； [0010]步骤3,按照步骤2所确定的Box-Behnken Design实验方案完成各组实验，得到对 应的各组细菌纤维素产量；
[0011] 步骤4,根据各组细菌纤维素的产量，采用Design Experts.0.6.1软件建立响应面 模型，确定优化的发酵参数组合。
[0012] 优选地，步骤1所述发酵参数的范围如下：发酵液pH为4.60~6.60,气液比为 13.30 % ~20.00 %，接种量为8.00 % ~25.00 %。
[0013] 优选地，步骤3所述按照步骤2所确定的Box-Behnken Design实验方案完成各组实 验，得到对应的各组细菌纤维素产量，具体如下：
[0014] (3.1)根据步骤2中的实验方案，配制所需种子培养液，灭菌冷却完成接种操作后， 摇床30 °C下恒溫培养3天，摇床转速为16化/min;
[0015] (3.2)根据步骤2中的实验方案，配制所需发酵培养液，分别分装至各个锥形瓶中， 调至各所需抑，灭菌冷却后，按照步骤2实验方案中数据，分别取相应体积的接种量于对应 发酵液中，于摇床30°C下恒溫培养5天来发酵细菌纤维素，摇床转速为16化/min;
[0016] (3.3)对步骤(3.2)中由木醋杆菌发酵生成的细菌纤维素膜或团块取出后，先用自 来水冲洗，再浸泡于85°C的3%〇的化0H溶液中煮化，然后用4%〇的HAc溶液中和，最后用去离 子水漂洗直至溶液成中性为止，然后将细菌纤维素膜和团块置于冷冻干燥下冷冻10小时， 最后置于8(TC烘箱中干燥至恒重，于室溫称重得到对应的各组细菌纤维素产量。
[0017] 优选地，步骤4所确定优化的发酵参数组合为：发酵液pH = 5.65,气液比= 20.00%，接种量= 16.72%。
[001引优选地，步骤（3 . 1)中所述种子培养液为葡萄糖2.0 %、（ N H 4 ) 2 S 0 4 0.6 %、 K出P040. 1 %、MgS040. 04%、蛋白腺0.3%、酵母浸粉0.225%、簇甲基纤维素钢0.04%。
[0019] 优选地，步骤（3.2)中所述发酵培养液为葡萄糖酸4.5 %、薦糖2.75%、玉米浆 2.0 %、（NH4)2S040.1 %、K出P〇4〇 . 5 %、MgS〇4〇 . 07 %、乳酸巧0.02 %、HAcO . 15 %、巧樣酸 0.06 %、簇甲基纤维素钢0.04 %。
[0020] 本发明与现有技术相比，其显著优点为：（1)在细菌纤维素发酵后期大量的葡萄糖 酸作为碳源被木醋杆菌利用，寻求葡萄糖酸作唯一碳源时的最佳发酵工艺条件，通过提高 葡萄糖酸利用率来提高葡萄糖利用率，进而提高细菌纤维素最终产量；（2)采用响应面优化 法，可W确定发酵液抑、气液比W及接种量之间对细菌纤维素产量的交叉影响，继而确定最 优的参数组合，实现低成本发酵，减少资源浪费。
【附图说明】
[0021] 图1为本发明pH、接种量对响应值的=维响应面影响图。
[0022] 图2为本发明气液比、接种量对响应值的S维响应面影响图。
[0023] 图3为本发明实施例10W葡萄糖酸作唯一碳源产生的细菌纤维素的SEM图。
[0024] 图4为本发明实施例10W葡萄糖酸作唯一碳源产生的细菌纤维素的红外谱图。
[0025] 图5为本发明实施例10W葡萄糖酸作唯一碳源产生的细菌纤维素的XRD图。
【具体实施方式】
[0026] 本发明W葡萄糖酸作唯一碳源进行发酵生产细菌纤维素的优化方法，步骤如下：
[0027] 步骤1，确定木醋杆菌W葡萄糖酸作唯一碳源需要考虑的发酵参数，所述发酵参数 包括发酵液pH、气液比W及接种量;所述发酵参数的范围如下:发酵液pH为4.60~6.60，气 液比为13.30 %~20.00 %，接种量为8.00 %~25.00 %。
[00巧]步骤2,利用Desi即Expert8.0.6.1软件根据Box-Beh址en Desi即确定实验方案；
[0029] 步骤3,按照步骤2所确定的Box-Behnken Design实验方案完成各组实验，得到对 应的各组细菌纤维素产量，具体如下：
[0030] (3.1)根据步骤2中的实验方案，配制所需种子培养液，灭菌冷却完成接种操作后， 摇床30°C下恒溫培养3天，摇床转速为16化/min;所述种子培养液为葡萄糖2.0%、（NH4) 2S〇4〇. 6 %、K出P〇4〇. 1 %、MgS〇4〇 . 04 %、蛋白腺0.3 %、酵母浸粉0.225 %、簇甲基纤维素钢 0.04%。
[0031] (3.2)根据步骤2中的实验方案，配制所需发酵培养液，分别分装至各个锥形瓶中， 调至各所需抑，灭菌冷却后，按照步骤2实验方案中数据，分别取相应体积的接种量于对应 发酵液中，于摇床30°C下恒溫培养5天来发酵细菌纤维素，摇床转速为16化/min;所述发酵 培养液为葡萄糖酸4.5 %、薦糖2.75 %、玉米浆2.0 %、（NH4)2S040.1 %、KH2P040.5 %、 MgS〇4〇. 07 %、乳酸巧0.02%、HAcO. 15 %、巧樣酸0.06%、簇甲基纤维素钢0.04%。
[0032] (3.3)对步骤(3.2)中由木醋杆菌发酵生成的细菌纤维素膜或团块取出后，先用自 来水冲洗，再浸泡于85°C的3%〇的化0H溶液中煮化，然后用4%〇的HAc溶液中和，最后用去离 子水漂洗直至溶液成中性为止，然后将细菌纤维素膜和团块置于冷冻干燥下冷冻10小时， 最后置于8(TC烘箱中干燥至恒重，于室溫称重得到对应的各组细菌纤维素产量。
[0033] 步骤4,根据各组细菌纤维素的产量，采用Design Experts.0.6.1软件建立响应面 模型，确定优化的发酵参数组合为:发酵液抑=5.65，气液比=20.00%，接种量=16.72%。
[0034] W下结合实施例和附图对本发明作进一步详述。
[0035] 本发明W葡萄糖酸作唯一碳源进行发酵生产细菌纤维素并采用响应面法优化其 工艺的方法，具体步骤如下：
[0036] (1)确定木醋杆菌W葡萄糖酸作唯一碳源需要考虑的发酵参数：
[0037] 本发明中，木醋杆菌W葡萄糖酸作唯一碳源考虑到的发酵参数为PH、气液比W及 接种量。
[0038] (2)利用Desi即Expert8.0.6.1软件根据Box-Beh址en Desi即确定实验方案。
[0039] (3)按照B抓实验方案完成实验。
[0040] (4)建立响应面模型，分析实验结果，确定优化参数组合。
[0041] (5)将木醋杆菌W葡萄糖酸作唯一碳源发酵产生的细菌纤维素进行红外吸收、 SEM、XRD表征，并与木醋杆菌W葡萄糖作碳源发酵产生的细菌纤维素的结构进行对比。
[0042] 步骤（1)中所述木醋杆菌为Acetobacter xylinum NUST6.2由本实验室筛选并保 藏。
[0043] 步骤(2)中所述pH为4.60-6.60,气液比为13.30 %-20.00 %，接种量为8.00 %- 25.00%。在此范围内，利用Design E邱e;rt软件进行实验设计，表1为Box-Behnken设计实验 因数水平设计表。
[0044] 步骤(4)中所述的建立响应面模型，分析实验结果，确定优化参数是指，将响应值 mBC(g/l)输入Design Ewed软件，根据软件来分析结果，输出响应面S维图并判断各参数 对响应值的影响情况，最终根据优化结果得到木醋杆菌W葡萄糖酸为唯一碳源的最佳发酵 工艺。
[0046]
[0045] 亲 IBox-Beh 址 en 巧计亲
[0047]
[0048] 本实验中为了尽量减少由于偶然因素引起的误差，统一使用250ml的锥形瓶进行 发酵实验，根据表1Box-Behnken设计计算得出具体的实验数据(具体的种子液体积W及发 酵液体积)如表2所示。
[0049] 亲2Rr)X-RAhnkAn^H+且化违胳擲据亲
[(K)加]
[0化1 ]
[0052]步骤(3)具体实施步骤如下：
[005；3] 根据表格，按照种子培养液：葡萄糖2.0 %、（NH4)2S040.6 %、KH2P040.1 %、 MgS〇4〇. 04 %、蛋白腺0.3 %、酵母浸粉0.225 %、簇甲基纤维素钢0.04 %，配制100ml种子培 养液，于灭菌锅中在12rC下灭菌20分钟后，冷却后于超净台中完成接种操作，放于摇床 (16化/min) 30 °C下恒溫培养3天。
[0化4]根据表格，按照发酵培养液：葡萄糖酸4.5 %、薦糖2.75 %、玉米浆2.0 %、（NH4) 2S〇4〇. 1 %、K也P〇4〇. 5 %、MgS〇4〇. 07 %、乳酸钙0.02%、HAcO. 15 %、巧樣酸0.06 %、簇甲基纤 维素钢0.04%，配制610ml发酵培养液液，按照表1中数据分别分装17个250ml锥形瓶中，调 至各所需抑后，于灭菌锅中在121°C下灭菌20分钟。待冷却后，按照表1中数据，分别取相应 体积的种子培养液于对应发酵培养液中，于摇床（160r/min)3(rC下恒溫培养5天来发酵细 菌纤维素。
[0055] 步骤(4)中，将响应值mBC(g/l)输入Design Ewed软件中得到表3,响应面优化结 果见表4
[00日6] 亲!RpVmkpn城选3無娃里
[00日7]
[0化引
[0059] 表中响应值通过W下方式得到：
[0060] 将4.巧111111111^516.2发酵生成的膜或团块取出后，先用自来水冲洗，再浸泡于 85°C的3%〇的化0H溶液中煮化，此时产物成乳白色半透明，然后用4%〇的HAc溶液中和，最后 用去离子水彻底漂洗直至溶液成中性为止，然后将膜和团块(保持平整)置于冷冻干燥下冷 冻10小时，最后置于8(TC烘箱中干燥至恒重，于室溫称重。纤维素产量表示为：g/L(培养 液)。
[0061 ] 表4B抓响应面优化结果分析 [0062；
[0063；
[0064]由表4知，C、C2的P值<0.05,说明C(接种量)对模型显著，模型P值为0.0002<0.05， 表明该拟合模型差异显著，可接受;失拟项P值〉0.05,失拟项不显著，说明模型在整个回归 区域的拟合度很好，接近真实的响应面曲线情况，模型建立合理;R2 = 0.8936,矫正系数Adj R2 = 0.8297，表明预测值与实际值之间有较高的相关性，能解释82.97 %的响应值变化，精 密度Adeq Precision = 10.243M，故可W用此模型对细菌纤维素的产量进行预测。
[0065] 经过回归拟合之后，得到相应的拟合方程来表示实验参数对响应值的影响。该二 次方程模型为mBC(g/l)二 + 19.15-0.54*A+0.63地+1.89*C+0.78*A*C-0.74地*C-7.49*c2， 式中A为抑，B为气液比，C为接种量。
[0066] 根据上述方程绘出响应面分析图，研究抑、气液比、接种量对响应值mBC(g/l)的影 响，响应面见图1、2。
[0067] 通过软件计算得，PH = 5.65,气液比= 20.00%，接种量=16.72%，mBC(g/l)的理 论最大值为20.9384。
[006引实施例1
[0069] 步骤1种子培养液的配制：根据葡萄糖2.0%、（NH4)2S040.6%、KH2P040.1 %、 MgS〇4〇. 04 %、蛋白腺0.3 %、酵母浸粉0.225 %、簇甲基纤维素钢0.04 %，配制100ml种子培 养液。
[0070] 步骤巧中子培养液的接种与摇床培养:首先将步骤1中已配好的种子液于灭菌锅中 在12TC下灭菌20min，灭菌结束待其冷却后于超净台中完成接种（本实验所用菌种为 A.xylinum NUST 6.2)操作，最后于摇床(16〇1'/111；[]1)30°[下培养3天。
[0071] 步骤3发酵培养液的配制及发酵:按照发酵培养液:葡萄糖酸4.5 %、薦糖2.75%、 玉米浆2.0%、（NH4)2S040.1 %、K出P〇4〇. 5%、MgS〇4〇. 07%、乳酸巧0.02%、HAcO. 15%、巧樣 酸0.06%、簇甲基纤维素钢0.04%，配审化10ml发酵液，用量筒配合移液枪(枪头已灭菌)量 取35.73ml发酵液于1号250ml锥形瓶中，用抑电极将发酵液抑调至5.60，同样于灭菌锅中在 12rC下灭菌20min，灭菌结束待其冷却后，用移液枪(枪头已灭菌)在超净台中量取5.90ml 种子液加入1号250ml锥形瓶中，于摇床(160;r/min)30°C下恒溫培养5天来发酵细菌纤维素。
[0072] 步骤4产物的提纯与称量:将4.巧1111皿抓516.2发酵生成的膜或团块取出后，先 用自来水冲洗，再浸泡于85°C的3%〇的化0田容液中煮化，此时产物成乳白色半透明，然后用 4%〇的HAc溶液中和，最后用去离子水彻底漂洗直至溶液成中性为止，然后将膜和团块(保持 平整)置于冷冻干燥下冷冻10小时，最后置于80°C烘箱中干燥至恒重，于室溫称重。纤维素 产量表示为:g/L(培养液）。
[0073] 实施例2
[0074] 步骤巧巾子培养液的配制:不需要重复。
[0075] 步骤巧巾子培养液的接种与摇床培养:不需要重复。
[0076] 步骤3发酵培养液的配制及发酵：用量筒配合移液枪(枪头已灭菌)从剩余的发酵 液量取28.54ml发酵液于3号250ml锥形瓶中，用抑电极将发酵液抑调至6.60，同样于灭菌锅 中在12TC下灭菌20min，灭菌结束待其冷却后，用移液枪（枪头已灭菌）在超净台中量取 4.71ml种子液加入3号250ml锥形瓶中，于摇床（IGOr/min) 30 °C下恒溫培养5天来发酵细菌 纤维素。
[0077] 步骤4产物的提纯与称量:将4.巧1111皿抓516.2发酵生成的膜或团块取出后，先 用自来水冲洗，再浸泡于85°C的3%〇的化0田容液中煮化，此时产物成乳白色半透明，然后用 4%〇的HAc溶液中和，最后用去离子水彻底漂洗直至溶液成中性为止，然后将膜和团块(保持 平整)置于冷冻干燥下冷冻10小时，最后置于80°C烘箱中干燥至恒重，于室溫称重。纤维素 产量表示为:g/L(培养液）。
[007引实施例3
[0079] 步骤巧巾子培养液的配制:不需要重复。
[0080] 步骤巧巾子培养液的接种与摇床培养:不需要重复。
[0081] 步骤3发酵培养液的配制及发酵：用量筒配合移液枪(枪头已灭菌)剩余的发酵液 量取38.54ml发酵液于5号250ml锥形瓶中，用pH电极将发酵液P的周至4.60，同样于灭菌锅中 在12TC下灭菌20min，灭菌结束待其冷却后，用移液枪（枪头已灭菌）在超净台中量取 3.08ml种子液加入5号250ml锥形瓶中，于摇床（IGOr/min) 30 °C下恒溫培养5天来发酵细菌 纤维素。
[0082] 步骤4产物的提纯与称量:将4.巧1111皿抓516.2发酵生成的膜或团块取出后，先 用自来水冲洗，再浸泡于85°C的3%〇的化0田容液中煮化，此时产物成乳白色半透明，然后用 4%〇的HAc溶液中和，最后用去离子水彻底漂洗直至溶液成中性为止，然后将膜和团块(保持 平整)置于冷冻干燥下冷冻10小时，最后置于80°C烘箱中干燥至恒重，于室溫称重。纤维素 产量表示为:g/L(培养液）。
[0083] 实施例4
[0084] 步骤巧巾子培养液的配制:不需要重复。
[0085] 步骤巧巾子培养液的接种与摇床培养:不需要重复。
[0086] 步骤3发酵培养液的配制及发酵：用量筒配合移液枪(枪头已灭菌)剩余的发酵液 量取42.92ml发酵液于7号250ml锥形瓶中，用pH电极将发酵液P的周至6.60，同样于灭菌锅中 在12TC下灭菌20min，灭菌结束待其冷却后，用移液枪（枪头已灭菌）在超净台中量取 7.08ml种子液加入7号250ml锥形瓶中，于摇床（IGOr/min) 30 °C下恒溫培养5天来发酵细菌 纤维素。
[0087] 步骤4产物的提纯与称量:将4.巧1111皿抓516.2发酵生成的膜或团块取出后，先 用自来水冲洗，再浸泡于85°C的3%〇的化0田容液中煮化，此时产物成乳白色半透明，然后用 4%〇的HAc溶液中和，最后用去离子水彻底漂洗直至溶液成中性为止，然后将膜和团块(保持 平整)置于冷冻干燥下冷冻10小时，最后置于80°C烘箱中干燥至恒重，于室溫称重。纤维素 产量表示为:g/L(培养液）。
[0088] 实施例5
[0089] 步骤巧巾子培养液的配制:不需要重复。
[0090] 步骤巧巾子培养液的接种与摇床培养:不需要重复。
[0091] 步骤3发酵培养液的配制及发酵：用量筒配合移液枪(枪头已灭菌)剩余的发酵液 量取26.60ml发酵液于9号250ml锥形瓶中，用pH电极将发酵液P的周至5.60，同样于灭菌锅中 在12TC下灭菌20min，灭菌结束待其冷却后，用移液枪（枪头已灭菌）在超净台中量取 6.65ml种子液加入9号250ml锥形瓶中，于摇床（IGOr/min) 30 °C下恒溫培养5天来发酵细菌 纤维素。
[0092] 步骤4产物的提纯与称量:将4.巧1111皿抓516.2发酵生成的膜或团块取出后，先 用自来水冲洗，再浸泡于85°C的3%〇的化0田容液中煮化，此时产物成乳白色半透明，然后用 4%〇的HAc溶液中和，最后用去离子水彻底漂洗直至溶液成中性为止，然后将膜和团块(保持 平整)置于冷冻干燥下冷冻10小时，最后置于80°C烘箱中干燥至恒重，于室溫称重。纤维素 产量表示为:g/L(培养液）。
[0093] 实施例6
[0094]步骤巧巾子培养液的配制:不需要重复。
[00%]步骤巧巾子培养液的接种与摇床培养:不需要重复。
[0096] 步骤3发酵培养液的配制及发酵：用量筒配合移液枪(枪头已灭菌)剩余的发酵液 量取28.54ml发酵液于11号250ml锥形瓶中，用抑电极将发酵液抑调至4.60，同样于灭菌锅 中在12TC下灭菌20min，灭菌结束待其冷却后，用移液枪（枪头已灭菌）在超净台中量取 4.71ml种子液加入11号250ml锥形瓶中，于摇床（IGOr/min) 30 °C下恒溫培养5天来发酵细菌 纤维素。
[0097] 步骤4产物的提纯与称量:将4.巧1111皿抓516.2发酵生成的膜或团块取出后，先 用自来水冲洗，再浸泡于85°C的3%〇的化0田容液中煮化，此时产物成乳白色半透明，然后用 4%〇的HAc溶液中和，最后用去离子水彻底漂洗直至溶液成中性为止，然后将膜和团块(保持 平整)置于冷冻干燥下冷冻10小时，最后置于80°C烘箱中干燥至恒重，于室溫称重。纤维素 产量表示为:g/L(培养液）。
[009引实施例7
[0099] 步骤巧巾子培养液的配制:不需要重复。
[0100] 步骤巧巾子培养液的接种与摇床培养:不需要重复。
[0101] 步骤3发酵培养液的配制及发酵：用量筒配合移液枪(枪头已灭菌)剩余的发酵液 量取42.92ml发酵液于12号250ml锥形瓶中，用抑电极将发酵液抑调至4.60，同样于灭菌锅 中在12TC下灭菌20min，灭菌结束待其冷却后，用移液枪（枪头已灭菌）在超净台中量取 7.08ml种子液加入12号250ml锥形瓶中，于摇床（IGOr/min) 30 °C下恒溫培养5天来发酵细菌 纤维素。
[0102] 步骤4产物的提纯与称量:将4.巧1111皿^516.2发酵生成的膜或团块取出后，先 用自来水冲洗，再浸泡于85°C的3%〇的化0田容液中煮化，此时产物成乳白色半透明，然后用 4%〇的HAc溶液中和，最后用去离子水彻底漂洗直至溶液成中性为止，然后将膜和团块(保持 平整)置于冷冻干燥下冷冻10小时，最后置于80°C烘箱中干燥至恒重，于室溫称重。纤维素 产量表示为:g/L(培养液）。
[0103] 实施例8
[0104] 步骤巧巾子培养液的配制:不需要重复。
[0105] 步骤巧巾子培养液的接种与摇床培养:不需要重复。
[0106] 步骤3发酵培养液的配制及发酵：用量筒配合移液枪(枪头已灭菌)剩余的发酵液 量取46.30ml发酵液于14号250ml锥形瓶中，用抑电极将发酵液抑调至5.60，同样于灭菌锅 中在12TC下灭菌20min，灭菌结束待其冷却后，用移液枪（枪头已灭菌）在超净台中量取 3.70ml种子液加入14号250ml锥形瓶中，于摇床（IGOr/min) 30 °C下恒溫培养5天来发酵细菌 纤维素。
[0107] 步骤4产物的提纯与称量:将4.巧1111皿^516.2发酵生成的膜或团块取出后，先 用自来水冲洗，再浸泡于85°C的3%〇的化0田容液中煮化，此时产物成乳白色半透明，然后用 4%〇的HAc溶液中和，最后用去离子水彻底漂洗直至溶液成中性为止，然后将膜和团块(保持 平整)置于冷冻干燥下冷冻10小时，最后置于80°C烘箱中干燥至恒重，于室溫称重。纤维素 产量表示为:g/L(培养液）。
[010引实施例9
[0109] 步骤巧巾子培养液的配制:不需要重复。
[0110] 步骤巧巾子培养液的接种与摇床培养:不需要重复。
[0111] 步骤3发酵培养液的配制及发酵：用量筒配合移液枪(枪头已灭菌)剩余的发酵液 量取30.79ml发酵液于15号250ml锥形瓶中，用抑电极将发酵液抑调至5.60，同样于灭菌锅 中在12TC下灭菌20min，灭菌结束待其冷却后，用移液枪（枪头已灭菌）在超净台中量取 2.46ml种子液加入15号250ml锥形瓶中，于摇床（IGOr/min) 30 °C下恒溫培养5天来发酵细菌 纤维素。
[0112] 步骤4产物的提纯与称量:将A.xylinumNUST6.2发酵生成的膜或团块取出后，先 用自来水冲洗，再浸泡于85°C的3%〇的化0田容液中煮化，此时产物成乳白色半透明，然后用 4%〇的HAc溶液中和，最后用去离子水彻底漂洗直至溶液成中性为止，然后将膜和团块(保持 平整)置于冷冻干燥下冷冻10小时，最后置于80°C烘箱中干燥至恒重，于室溫称重。纤维素 产量表示为:g/L(培养液）。
[011引实施例10
[0114] 步骤巧巾子培养液的配制:不需要重复。
[0115] 步骤巧巾子培养液的接种与摇床培养:不需要重复。
[0116] 步骤3发酵培养液的配制及发酵：用量筒配合移液枪(枪头已灭菌)剩余的发酵液 量取40.00ml发酵液于16号250ml锥形瓶中，用抑电极将发酵液抑调至5.60，同样于灭菌锅 中在12TC下灭菌20min，灭菌结束待其冷却后，用移液枪（枪头已灭菌）在超净台中量取 10.00ml种子液加入16号250ml锥形瓶中，于摇床（IGOr/min)30°C下恒溫培养5天来发酵细 菌纤维素。
[0117] 步骤4产物的提纯与称量:将A.xylinumNUST6.2发酵生成的膜或团块取出后，先 用自来水冲洗，再浸泡于85°C的3%〇的化0田容液中煮化，此时产物成乳白色半透明，然后用 4%〇的HAc溶液中和，最后用去离子水彻底漂洗直至溶液成中性为止，然后将膜和团块(保持 平整)置于冷冻干燥下冷冻10小时，最后置于80°C烘箱中干燥至恒重，于室溫称重。纤维素 产量表示为:g/L(培养液）。
[011引表征
[0119] I'SEM
[0120] 结合图3,由实施例10制备得到的细菌纤维素的沈M图可W看出，木醋杆菌W葡萄 糖酸作唯一碳源所得到的细菌纤维素膜为=维网状结构，纤维粗细均匀，与传统发酵液制 得的细菌纤维素在形态上类似，说明此方法可W应用于工业生产。
[0121] 2、红外光谱
[0122] 结合图4,由实施例10制备得到的细菌纤维素的红外光谱图可W看出，3343cnfi处 反映了分子间氨键引起的0-H基的伸缩振动，在1559cnfi处的吸收峰是由C-H键伸缩振动引 起的，深度与纤维素结晶度有关，在l〇54cnfi处的吸收峰，是由碳氧键的伸缩振动引起的，是 纤维素分子的特征峰，与传统发酵液制得的细菌纤维素结构一致。
[0123] 3、邸 D
[0124] 结合图5,由实施例10制备得到的细菌纤维素的XRD图可W看出，木醋杆菌W葡萄 糖酸作唯一碳源所得到的细菌纤维素膜具有较高的结晶度，布拉格角为14.62、22.82处 有较宽的衍射峰出现，为典型的纤维素 I晶体，与传统发酵液所制备的纤维素一致。
【主权项】
1. 一种以葡萄糖酸作唯一碳源进行发酵生产细菌纤维素的优化方法，其特征在于，步 骤如下： 步骤1，确定木醋杆菌以葡萄糖酸作唯一碳源需要考虑的发酵参数，所述发酵参数包括 发酵液pH、气液比以及接种量； 步骤2,利用Design Expert8.0.6.1软件根据Box-Behnken Design确定实验方案； 步骤3,按照步骤2所确定的Box-Behnken Design实验方案完成各组实验，得到对应的 各组细菌纤维素产量； 步骤4,根据各组细菌纤维素的产量，采用Design Expert8.0.6.1软件建立响应面模 型，确定优化的发酵参数组合。2. 根据权利要求1所述的以葡萄糖酸作唯一碳源进行发酵生产细菌纤维素的优化方 法，其特征在于，步骤1所述发酵参数的范围如下：发酵液pH为4.60~6.60，气液比为 13 · 30 % ~20 · 00 %，接种量为8 · 00 % ~25 · 00 %。3. 根据权利要求1所述的以葡萄糖酸作唯一碳源进行发酵生产细菌纤维素的优化方 法，其特征在于，步骤3所述按照步骤2所确定的Box-Behnken Design实验方案完成各组实 验，得到对应的各组细菌纤维素产量，具体如下： (3.1) 根据步骤2中的实验方案，配制所需种子培养液，灭菌冷却完成接种操作后，摇床 30°C下恒温培养3天，摇床转速为160r/min; (3.2) 根据步骤2中的实验方案，配制所需发酵培养液，分别分装至各个锥形瓶中，调至 各所需PH，灭菌冷却后，按照步骤2实验方案中数据，分别取相应体积的接种量于对应发酵 液中，于摇床30°C下恒温培养5天来发酵细菌纤维素，摇床转速为160r/min; (3.3) 对步骤(3.2)中由木醋杆菌发酵生成的细菌纤维素膜或团块取出后，先用自来水 冲洗，再浸泡于85 °C的3%。的NaOH溶液中煮2h，然后用4%。的HAc溶液中和，最后用去离子水 漂洗直至溶液成中性为止，然后将细菌纤维素膜和团块置于冷冻干燥下冷冻10小时，最后 置于80°C烘箱中干燥至恒重，于室温称重得到对应的各组细菌纤维素产量。4. 根据权利要求1所述的以葡萄糖酸作唯一碳源进行发酵生产细菌纤维素的优化方 法，其特征在于，步骤4所确定优化的发酵参数组合为:发酵液pH= 5.65，气液比=20.00 %， 接种量= 16.72%。5. 根据权利要求3所述的以葡萄糖酸作唯一碳源进行发酵生产细菌纤维素的优化方 法，其特征在于，步骤（3. 1)中所述种子培养液为葡萄糖2.0%、（NH4)2S040.6 %、 KH2P〇4〇. 1 %、MgS〇4〇. 04%、蛋白胨0.3%、酵母浸粉0.225%、羧甲基纤维素钠0.04%。6. 根据权利要求3所述的以葡萄糖酸作唯一碳源进行发酵生产细菌纤维素的优化方 法，其特征在于，步骤（3.2)中所述发酵培养液为葡萄糖酸4.5%、蔗糖2.75%、玉米浆 2.0%、（冊4)23〇4〇.1%、1(!12?〇4〇.5%、]\^5〇4〇.07%、乳酸钙0.02%、似(3〇.15%、柠檬酸 0.06 %、羧甲基纤维素钠0.04 %。
【文档编号】C12P19/04GK106047960SQ201610584286
【公开日】2016年10月26日
【申请日】2016年7月22日 公开号201610584286.1, CN 106047960 A, CN 106047960A, CN 201610584286, CN-A-106047960, CN106047960 A, CN106047960A, CN201610584286, CN201610584286.1
【发明人】孙东平, 梁光芸, 自强, 顾焱, 陈春涛, 孙汴京, 杨加志
【申请人】南京理工大学