一种细菌纤维素的制备方法与流程

本发明属于工业生物技术领域，具体涉及一种高效发酵生产生物纳米纤维素的方法。

背景技术：

生物纳米纤维素与植物纤维素相比有许多独特的性质，如高持水性、高结晶度、较高的生物相容性、超精细网状结构、高抗张强度和弹性模量等，由于这些特性使其广泛应用于食品、生物医学、声学器材、造纸、燃料电池、离子交换膜及膜分离等领域。例如，在医学材料领域，它可以被制成人造皮肤、纱布、绷带和“创可贴”等伤口辅料商品。

目前生物纳米纤维素发酵方式有动态和静态两种，发酵方式的不同导致其聚合度差、结构等性质异较大，也影响了其应用方向。而且，相对静态发酵，常规的动态发酵方法产量较低，其中一个重要的原因是由于动态发酵剪切力大，使部分菌株突变成非生产性菌株。在产生纤维素的醋杆菌中也发现有引起遗传不稳定性的插入序列的存在。

崔思颖等在“不同培养方式制备的细菌纤维素性质的比较“(崔思颖等，《造纸科学与技术》，2010年第29卷第1期)中对比研究了静态发酵制得的细菌纤维素凝胶和动态发酵制得的细菌纤维素凝胶的纤维素结构、吸水\复水性能、灰分等性质，发现动态发酵制得的细菌纤维素凝胶的纤维结构更加疏松，并具有相对更好的吸水\复水性能。在提高产量方面，主要是通过优化工艺条件，降低剪切力。钟春燕公开了一种动态发酵制备细菌纤维素凝胶产品的方法，即在动态发酵之前，在细菌纤维素液体发酵培养基中加入0.2-1.0％重量的琼脂。该方法能够大幅提高细菌纤维素凝胶的产量，得到呈小球形，纤维结构更疏松、具有优良吸水\复水性能的细菌纤维素凝胶产品。兰水(2014)等人别以木薯酶解液和糖蜜处理液作为发酵碳源，在机械搅拌式发酵罐中生产细菌纤维素(BC)。通过考察纤维素产量、活菌增殖、耗糖量以及溶氧率等参数研究添加0-0.8％(w/y)琼脂对BC产量的影响。结果表明，未添加琼脂时，木薯酶解液的BC产量为6.8g/L，发酵效果优于糖蜜的4.8g/L。添加琼脂可以显著提高BC产量。Cheng等人(2011)在培养基中加了1.5％的CMC(羧甲基纤维素)，得率比对照提高了70％。Song和Kim等以Acetobacter xylinum KJl为试验用菌株，利用廉价的糖化废弃物(SFW)和经改良后具有高传氧率的生物反应器来探讨果胶的加入量和生物反应器的搅拌速率对BC产量的影响，结果表明：在SFM为原料的培养基中加入0.4％的果胶和反应器的搅拌线速为0.93cm/min时，能有效提高BC的产量。

虽然已经在研究上取得了一定的成果，但是真正将研究转化为生产的还很不够成熟。

技术实现要素：

本发明要解决的技术问题是，提供一种高效发酵生产生物纳米纤维素的方法。

为解决上述技术问题，本发明采用如下技术方案：

一种细菌纤维素的制备方法，包括如下步骤：

(1)摇瓶菌种制备：将木醋杆菌ATCC 700178接种到种子培养基中，28～33℃培养12～24h，得到一级种子液；

(2)种子液扩大培养：将一种种子液接种到种子培养基中，进行扩大培养得到二级种子液；

(3)发酵：将二级种子液接种到装有糖蜜培养基的发酵罐中，所述发酵罐中装有固定化介质，发酵6～8天；

(4)提取：从发酵液中提取生物纳米纤维素。

步骤(1)和(2)中，所述的种子培养基包括如下组分：葡萄糖20～50g/L、酵母膏1～10g/L、蛋白胨1～10g/L、CaCO₃ 0.5～5g/L，溶剂为水。

步骤(2)中，扩大培养的培养条件如下：温度28～33℃，温度优选30℃；搅拌转速80～150r/min，搅拌转速优选120r/min；通气量0.5～2.0vvm，通气量优选1.5vvm。

步骤(3)中，所述的糖蜜培养基包括如下组分：还原糖20～50g/L、甘油0.5～5g/L、玉米浆5～30g/L、硫酸铵0.5～5g/L、柠檬酸0.5～3g/L、磷酸氢二钠0.5～3g/L、硫酸镁0.2～2g/L，pH4.0～6.0，溶剂为水；糖蜜培养基优选：还原糖30g/L、甘油3g/L、玉米浆20g/L、硫酸铵3g/L、柠檬酸1.8g/L、磷酸氢二钠3g/L、硫酸镁1g/L，pH4.5。

步骤(3)中，糖蜜为甘蔗糖蜜或甜菜糖蜜，所述还原糖的制备方法如下：将原糖蜜预先稀释2～10倍，用硫酸调pH值为1.0～3.0，90～120℃下水解15～30min，静置，取上清液，再稀释5～25倍，即得还原糖溶液。

步骤(3)中，发酵条件如下：搅拌转速50～150rpm，搅拌转速优选100rpm；发酵温度28～33℃，发酵温度优选30℃；通气量0.5～2.0vv/min，通气量优选1.2vvm，罐压0.05～0.15Mpa，罐压优选0.1Mpa。

步骤(3)中，所述的固定化介质为：聚氨酯、棉纤维织物、活性炭纤维、聚酯纤维织物、丝绸织物、竹纤维织物、聚乙烯醇纤维织物、涤纶织物、丙纶织物、锦纶织物、氨纶织物或腈纶织物，所述的固定化介质可拆卸地固定在发酵罐内部。

步骤(4)中，从发酵液中提取生物纳米纤维素的方法如下：过滤步骤(3)得到的发酵液，将细菌纤维素投入储罐加水搅拌，分别经过热浸、碱煮、热浸、漂泊循环处理，当样品呈乳白色透明状，pH值呈中性，再进行干燥，即得细菌纤维素成品。

其中，所述的热浸的条件：为将细菌纤维素在50℃～100℃的水中浸泡1～10小时，再抽滤，如此循环2-4次。

其中，所述的碱煮的条件为：将细菌纤维素在0.1～1mol/L的氢氧化钠水溶液中煮沸0.5～3小时，抽滤，清洗，如此循环热浸2～4次。

有益效果：

(1)本发明中发酵所用碳氮源均为工业常用原料，成本低廉，大幅降低生产BC的发酵成本；

(2)本发明的所用工艺较为简单，常用发酵罐进行简单改造即可；

(3)反应器内填装吸附介质可明显降低发酵过程中搅拌和鼓气剪切力对菌体生长造成的影响，介质上吸附的菌体可更快产生BC膜；

(4)通过改变载体种类和数量可控制BC聚合度，以实现不同用途。

附图说明

图1为支撑物钢丝网和多孔介质。

图2为装有吸附介质的生物反应器简易图。

具体实施方式

根据下述实施例，可以更好地理解本发明。然而，本领域的技术人员容易理解，实施例所描述的内容仅用于说明本发明，而不应当也不会限制权利要求书中所详细描述的本发明。

实施例1：7L NBS罐发酵

1)摇瓶菌种制备：刮取一环斜面种子接于灭菌后的种子培养基(葡萄糖20、酵母膏2、蛋白胨2、CaCO3 0.5，单位g/L，pH值自然)，28℃、100r/min培养16小时后扩陪培养；

2)糖蜜制备:将原甘蔗糖蜜预先稀释2倍，用硫酸调pH值为2.0，90℃水解30分钟，静置一夜后离心或过滤取上清液再稀释10倍，pH值为6.0；

3)发酵：将种子按5％接种于装有一定量的甘蔗糖蜜培养基(糖蜜25，甘油0.5，玉米浆10g/L，硫酸铵0.5，柠檬酸1.0，磷酸氢二钠2.0，硫酸镁0.2，单位g/L)的发酵罐进行搅拌发酵8天；其中，搅拌罐是装有纱布的生物反应器，纱布挂于反应器挡板上；搅拌转速为50r/min；发酵温度为28℃，通气量为0.5vv/min，罐压0.05Mpa。

4)发酵后处理：将发酵液用纱布过滤掉发酵液后，将生物纳米纤维素用80℃热水浸泡2小时，循环3次。所述换碱煮为加0.1M的氢氧化钠煮沸2小时，过滤后用同样的热水清洗，循环热浸2次；加次氯酸钠0.2％，温度维持在50℃，浸泡1小时，抽滤后用热水清洗，循环若干次至pH值为中性。最后进行冻干处理，所得产品产量为3.9g/L，相比对照组(未填装载体，其他条件一致)增加了1.3倍，产品聚合度为1690。

实施例2：50升搅拌罐发酵

1)菌种制备：刮取一环斜面种子接于灭菌后的种子培养基(葡萄糖40、酵母膏5、蛋白胨5、CaCO3 1，单位g/L，pH值自然)，32℃、150r/min培养24小时后移至实施例1中的NBS罐扩陪，装液量为3L，培养基与摇瓶类似，转速100r/min、通气量1.0vvm、温度32℃搅拌培养20小时；

2)糖蜜制备:将甜菜糖蜜预先稀释5倍，用硫酸调pH值为2.5，100℃水解20分钟，静置一夜后离心或过滤取上清液再稀释2倍，pH值为5.5；

3)发酵：将种子接种于装有30L糖蜜培养基(糖蜜50，甘油0.2，玉米浆20g/L，硫酸铵1.5，柠檬酸1.5，磷酸氢二钠3.0，硫酸镁0.6，单位g/L)的发酵罐进行搅拌发酵7天；其中，发酵罐中载体填装与实施例1类似；搅拌转速为100r/min；发酵温度为30℃，通气量为1.0vv/min，罐压0.05Mpa。

4)发酵后处理：将发酵液用纱布过滤掉发酵液后，将生物纳米纤维素用70℃热水浸泡3小时，循环2次。所述换碱煮为加0.5M的氢氧化钠煮沸1.5小时，过滤后用同样的热水清洗，循环热浸2次；加次氯酸钠0.5％，温度维持在40℃，浸泡2小时，抽滤后用热水清洗，循环若干次至pH值为中性。最后进行烘干处理，所得产品产量为3.3g/L，产品聚合度为1490。

实施例3：2吨搅拌罐发酵

1)菌种制备：刮取一环斜面种子接于灭菌后的装有100mL的种子培养基(葡萄糖25、酵母膏2.5、蛋白胨2.5、CaCO₃ 3，单位g/L，pH值自然)500mL三角瓶，30℃、150r/min培养20小时后用装有1L培养基的5L三角瓶，同样条件培养20小时。移至装有100L培养基的200L种子罐扩陪，培养基与摇瓶类似，转速90r/min、通气量1.5vvm、温度30℃搅拌培养24小时；

2)糖蜜制备:将甘蔗糖蜜预先稀释4倍，用硫酸调pH值为3.0，120℃水解15分钟，静置一夜后离心或过滤取上清液再稀释2.5倍，pH值为4.8；

3)发酵：将种子移至接种于装有1200L糖蜜培养基(糖蜜50，甘油0.8，玉米浆15g/L，硫酸铵2.5，柠檬酸1.2，磷酸氢二钠2.2，硫酸镁1.0，单位g/L)的发酵罐进行搅拌发酵8天；其中，发酵罐中填装圆筒状的聚氨酯载体；搅拌转速为80r/min；发酵温度为28℃，通气量为0.6vv/min，罐压0.12Mpa。

4)发酵后处理：将发酵液通过板框过滤掉发酵液后，将生物纳米纤维素投入储罐加70℃热水搅拌3小时，再泵到抽滤缸进行抽滤，循环3次。换0.8M的氢氧化钠煮沸2小时，再泵入抽滤缸，抽滤后再次投入储罐，用同样的热水清洗，循环热浸3次；加次氯酸钠0.6％，温度维持在45℃，浸泡3小时，再泵入抽滤缸，抽滤后再次投入储罐，用热水清洗，循环若干次至pH值为中性。最后进行烘干处理，所得产品产量为1.9g/L，产品聚合度为1220。

实施例4：2吨搅拌罐发酵

1)菌种和糖蜜制备及发酵条件：与实施例3相同。

2)发酵罐中填装3层圆筒状的竹纤维纱布载体(纱布固定于钢丝网表面上)，间距为8cm；搅拌转速为100r/min；发酵温度为30℃，通气量为0.4vv/min，罐压0.10Mpa。

4)发酵后处理：将发酵液通过板框过滤掉发酵液后，将生物纳米纤维素投入储罐加65℃热水搅拌2小时，再泵到抽滤缸进行抽滤，循环4次。换1.0M的氢氧化钠煮沸1.5小时，再泵入抽滤缸，抽滤后再次投入储罐，用同样的热水清洗，循环热浸2次；加次氯酸钠0.3％，温度维持在55℃，浸泡2小时，再泵入抽滤缸，抽滤后再次投入储罐，用热水清洗，循环若干次至pH值为中性。最后进行打浆喷干处理，所得产品产量为2.7g/L，产品聚合度为1362。