包括金属、金属纳米颗粒的益生细菌和其应用
【专利说明】包括金属、金属纳米颗粒的益生细菌和其应用发明领域
[0001]本发明列入益生细菌领域内，并且更具体地涉及负载金属离子和/或金属纳米颗粒的益生细菌、这些益生细菌用于预防或治疗矿物质缺乏疾病的应用、这些细菌作为消化道成像造影剂的应用、和这些细菌用于癌症治疗的应用。
[0002]发明背景
[0003]矿物质是生命所需的五个基本组的养分之一。微量养分营养不良波及>50%的世界人口。具体而言，铁、锌和钙被认为是在大多数发展中国家中新出现的公众健康问题。在发达国家中，由于舒适和愉悦胜于健康的不正确饮食习惯，也存在严重的矿物质缺乏问题。缺铁是世界上最常见的营养问题。除了波及发展中国家的很多儿童和妇女外，其也是唯一的在工业化国家中明显普遍的养分缺乏。缺铁性贫血的后果非常严重。幼儿缺铁导致的贫血已非常普遍，因为一般婴幼儿饮食中可生物利用的铁的水平很低，而其快速生长需要远远更高水平的铁。缺铁性贫血(IDA)的后果非常严重，因为其与认知和精神运动发育受损、生长减少和感染抵抗力降低有关。
[0004]为增加这些矿物质的日摄入量，包含这些金属的不同无机和有机形式的多种食品补充剂可商业获得。无论如何，众所周知无机盐具有很低的生物利用度。有机盐一一通常基于葡萄糖酸盐、枸橼酸盐、或其他分子一一的特征在于全身性效果较高。为缺铁性贫血开处的铁补充剂的治疗剂量可引起胃肠道副作用如恶心、呕吐、便秘、腹泻、深色排便、和/或腹痛。因此，需要提供新型制剂以最小的胃肠道副作用用于金属补充，具体地用于铁补充。
[0005]发明概述
[0006]第一方面，本发明涉及细菌，该细菌选自乳酸细菌和双歧杆菌属(Bifidobacterium)细菌，包括结合于其表面的至少一种金属纳米颗粒。
[0007]第二方面，本发明涉及获得包括结合于其表面的至少一种金属的选自乳酸细菌和双歧杆菌属细菌的细菌的方法，包括使所述细菌与至少所述金属接触，其中所述接触在存在至少一种二价阳离子盐的情况下和在其中所述细菌的生长大幅(实质，substantial Iy)减少的温度下进行。
[0008]第三方面，本发明涉及通过根据第二方面的方法可获得的细菌。
[0009]第四方面，本发明涉及根据第一方面的细菌或根据第三方面的细菌的生物纯培养物。
[0010]第五方面，本发明涉及食品，其包括根据任何第一方面的细菌或根据第三方面的细菌或根据第四方面的生物纯培养物。
[0011 ]第六方面，本发明涉及药物组合物，其包括根据任何第一方面的细菌或根据第三方面的细菌或根据第四方面的生物纯培养物和药学上可接受的载体。
[0012]第七方面，本发明涉及细菌，其选自第一方面所述的细菌和第三方面所述的细菌、或根据第四方面的生物纯培养物，其用于治疗和/或预防与金属缺乏相关的疾病或状况，其中细菌包括在所述疾病或状况中缺乏的金属，并且其中细菌或培养物被口服给予。
[0013]第八方面，本发明涉及细菌，其选自第一方面所述的细菌和第三方面所述的细菌、或根据第四方面的生物纯培养物，其用于治疗癌症，其中金属被包含在磁性纳米颗粒中。
[0014]第九方面，本发明涉及在对象肠道中递送金属的非治疗方法，包括口服给予根据第一方面的细菌或第三方面所述的细菌或第四方面所述的生物纯培养物。
[0015]第十方面，本发明涉及根据任何第一方面的细菌或根据第三方面的细菌或根据第四方面的生物纯培养物作为造影剂用于磁共振成像的应用，其中金属被包含在磁性纳米颗粒中。
[0016]第^^一方面，本发明涉及对象消化道的磁共振成像方法，包括:
[0017](i) 口服给予所述对象根据第一方面的细菌、或根据第三方面的细菌、或根据第四方面的生物纯培养物、或造影剂一一其包括根据第一方面的细菌、或根据第三方面的细菌、或根据第四方面的生物纯培养物，其中金属被包含在纳米颗粒中，和
[0018](ii)检测对象消化道中的金属纳米颗粒。
[0019]附图简述
[0020]图1.嵌入无定形环氧树脂的人工磁性细菌微调层的透射电子显微镜图像。a)阳性和b)阴性磁赤铁矿(maghemi te)纳米颗粒，和c)无EPS生物膜的细菌。在细菌包含EPS生物膜和纳米颗粒为阳性时，注释为纳米颗粒接枝发生。d)含磁赤铁矿细菌的Fe作图显示铁在细菌外表面选择性积累。
[0021]图2.与阳性磁赤铁矿纳米颗粒一起温育后形成葡萄干布丁样的双歧杆菌的典型非造影TEM图像。
[0022]图3.(a)人工磁性细菌在含水介质中分散，然后(b)磁性细菌通过磁场分离。
[0023]图4.在存在外部磁体的情况下绿色SYT09染料标记的人工磁性细菌在聚赖氨酸上的沉积。
[0024]图5.铁从胃和肠模拟介质中的含氧化铁纳米颗粒细菌去除的时间依赖性。注意，肠介质中的铁去除水平显著高于胃。
[0025]图6.胃和肠模拟介质中钙去除细菌的时间依赖性。
[0026]图7.胃和肠模拟介质中锌去除细菌的时间依赖性。
[0027]图8.(A)SEM图像，显示与Ca2+—起温育后的细菌。(B)EDX光谱，显示Ca的3.8eV特征Ka峰。
[0028]图9.(A)SEM图像显示与一起磁赤铁矿和Ca2+温育后的细菌。(B)EDX光谱，分别显示Fe和Ca的6.2eV和3.8eV特征Ka峰。
[0029]图10.给予含磁赤铁矿纳米颗粒的细菌6h后的小鼠MRI全身图像。由于磁性纳米颗粒积累造成的阳性(深暗)造影，一些上肠道部分的形态明显。
[°03°]图11.给予含磁赤铁矿纳米颗粒的细菌12h后的小鼠MRI全身图像。由于磁性纳米颗粒积累造成的阳性(深暗)造影，一些下肠道部分的形态明显。
[0031 ]发明详述
[0032]本发明的发明人已观察到，乳酸细菌或双歧杆菌属细菌能够以pH依赖性方式使金属纳米颗粒结合至其表面。细菌和金属纳米颗粒之间的联合在纳米颗粒具有表面正电荷的那些PH条件下是稳定的(图1)。此外，发明人已观察到，金属纳米颗粒稳定联合细菌的pH条件与胃的酸性PH条件重叠，而肠道的pH条件允许金属纳米颗粒和细菌之间解离，和随后的金属纳米颗粒递送(实施例2)。基于这种性质，发明人已研发出通过口服给予根据本发明的包含金属和/或金属纳米颗粒的细菌来将金属补充剂给予对其有需要的对象的方法。这些细菌以及这些细菌的培养物也可被配制成药物组合物，或构成食品或营养产品的部分。此夕卜，基于乳酸细菌和双歧杆菌到达肿瘤低氧区域的能力，纳米颗粒联合型细菌还可用于将目标化合物祀向肿瘤D进一步，携载结合至其表面的磁性纳米颗粒的细菌能够在经历施加射频范围内的交变磁场时选择性增加肿瘤附近温度(体温过高)时破坏肿瘤细胞。
[0033]最后，发明人还观察到，金属纳米颗粒负载型细菌适于通过磁共振(MRI)成像胃肠道系统(实施例4)。因此，这些细菌也适于用作口服性MRI造影剂。
[0034]细菌和培养物
[0035]第一方面，本发明涉及细菌，下文“本发明的细菌”，其选自乳酸细菌和双歧杆菌属细菌，包括结合于其表面的至少一种金属纳米颗粒。
[0036]本发明的细菌选自乳酸细菌和双歧杆菌属细菌。
[0037]术语“乳酸细菌”或“LAB”，如本文所用，指代任何能够生成乳酸或其衍生物中的至少一种(包括但不限于，乙酸或丙酸)作为碳水化合物发酵的主要代谢终产物的细菌:因此该术语意图包括生成丙酸作为碳水化合物发酵产物的丙酸细菌(PAB)。乳酸细菌的示例性非限制性实例是下列属的细菌:乳杆菌属(LactobaciIlus)、明串珠菌属(Leuconostoc)、足球菌属(Ped1coccus)、乳球菌属(Lactococcus)、丙酸杆菌属(Prop1nibacterium)和链球菌属(Streptococcus);以及下列目属:乳杆菌目气球菌属(LactobacillalesAerococcus)、肉品杆菌属(Carnobacterium)、肠球菌属(Enterococcus )、酒球菌属(Oenococcus)、四联球菌属(Teragenococcus)、漫游球菌属(Vagococcus)和魏斯氏菌属(W e i s e I I a )。一般，乳酸细菌选自下列物种:明串珠菌属、乳脂乳球菌(Lactococcuscremoris)、乳酸乳球菌(Lactococcuslactis)、嗜酸乳杆菌(LactobaciIIusacidophilus)、干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)、开菲尔乳杆菌(Lactobacilluskefiri)、双叉乳杆菌(Lactobacillus bifidus)、短乳杆菌(Lactobacillus brevis)、瑞士乳杆菌(Lactobacillus helveticus)、副干酪乳杆菌(Lactobacillus paracasei)、鼠李糖乳杆菌(LactobaciIlus rhamnosus)、唾液乳杆菌(Lactobacillus salivarius)、弯曲乳杆菌(LactobaciIlus curvatus)、保加利亚乳杆菌(Lactobacillus bulgaricus )、清酒乳杆菌(Lactobacillus sake i )、罗伊乳杆菌(Lactobaci I Ius reuteri )、发酵乳杆菌(Lactobaci I Ius f ermentum)、香肠乳杆菌(Lactobacillus farciminis)、乳酸乳杆菌(LactobaciIIus Iactis)、戴耳布吕克氏乳杆菌(Lactobacillus delbreuckii)、胚牙乳杆菌(Lactobacillus plantarum)、副胚牙乳杆菌(Lactobacillus paraplantarum)、卷曲乳杆菌(Lactobacillus crispatus)、力口氏乳杆菌(LactobaciIIus gasseri)、约氏乳杆菌(LactobaciIIus johnsonii)和詹氏乳杆菌(Lactobacillus jensenii)ο
[0038]在优选的实施方式中，乳酸细菌是乳杆菌属细菌。术语“乳杆菌属”，如本文所用，指代NCBI数据库中通过分类学(TaxonomyHD 1578描述的属。在【具体实施方式】中，乳酸细菌选自发酵乳杆菌、加氏乳杆菌、罗伊乳杆菌、棒状乳杆菌(LactobaciIIus coryniformis) >干酪乳杆菌、副干酪乳杆菌、胚牙乳杆菌、唾液乳杆菌和保加利亚乳杆菌。在更优选的实施方式中，乳酸细菌是发酵乳杆菌术语“发酵乳杆菌” (“Lactobacillus fermentum”或“L.fermentum”)指代在NCBI数据库中通过分类学ID 1613描述的乳杆菌属的种。
[0039]术语“双歧杆菌属细菌”或“双歧杆菌”，如本文所用，指代在NCBI数据库中通过分类学(Tanoxonomy) ID 1678描述的细菌的属。适当的双歧杆菌的示例性非限制性实例是下列的种:乳酸双歧杆菌(Bifidobacterium Iact is)、两岐双岐杆菌(Bifidobacteriumbifidium)、长双歧杆菌、动物双歧杆菌(Bifi do bacterium animalis)、短双歧杆菌(Bifidobacterium breve)、婴儿双岐杆菌(Bifidobacterium inf antis)、链状双歧杆菌(Bifidobacterium catenulatum)、假链状双歧杆菌(Bifidobacteriumpseudocatenu latum)、青春双岐杆菌(Bif idobacterium adolescent is)和角形双歧杆菌(Bifidobacterium angulatum)。在【具体实施方式】中，双歧杆菌属细菌选自短双歧杆菌、长双歧杆菌、动物双歧杆菌、幼儿双歧杆菌(Bifidobacterium infantum)和动物双歧杆菌。在更优选的实施方式中，双歧杆菌属细菌是短双歧杆菌。术语“短双歧杆菌”(“Bif idobacteriumbreve”或“B.breve”)指代在NCBI数据库中通过分类学ID 1685描述的双歧杆菌属物种。
[0040]在另一【具体实施方式】中，本发明的乳酸细菌或双歧杆菌是能够在口服摄入后被转运至乳腺的细菌。关于检测转运至乳腺的能力，可利用W02004003235描述的用于检测微生物在口服摄入后至乳汁转运的试验。这种细菌的实例被公开于国际申请W02008145756。在更具体的实施方式中，能够在口服摄入后被转运至乳腺的乳酸细菌或双歧杆菌属细菌选自:
[0041 ]-在CECT中以登录号7263保藏的短双歧杆菌，
[0042]-在CECT中以登录号5716保藏的发酵乳杆菌，
[0043]-在CECT中以登录号5711保藏的棒状乳杆菌，
[0044]-在CECT中以登录号5713保藏的唾液乳杆菌，
[0045]-在CECT中以登录号5714保藏的加氏乳杆菌，
[0046]-在CECT中以登录号7264保藏的短双歧杆菌，
[0047]-在CECT中以登录号7260保藏的罗伊乳杆菌，
[0048]-在CECT中以登录号7262保藏的胚牙乳杆菌，
[0049]-在CECT中以登录号7265保藏的发酵乳杆菌，
[0050]-在CECT中以登录号7266保藏的罗伊乳杆菌，
[0051 ]-在CECT中以登录号7410保藏的海氏肠球菌(Enterococcus hirae)，
[0052]-在CECT中以登录号7412保藏的胚牙乳杆菌，