纳米细菌感染动物前列腺引起慢性炎症的动物模型复制方法
【技术领域】
[0001]本发明属于生物医学领域，尤其涉及一种纳米细菌感染动物前列腺引起慢性炎症的动物模型复制方法。
【背景技术】
[0002]根据国际前列腺炎合作网1998年提出的前列腺炎分类方法，前列腺炎共分为四型。I型:急性细菌性前列腺炎，指前列腺急性细菌感染；II型:慢性细菌性前列腺炎，指前列腺慢性复发性细菌感染；111型:慢性前列腺炎/慢性盆腔疼痛综合症(CP/CPPS)，其定义为病史在3个月以上，骨盆区疼痛或不适，不同程度的排尿或性交时不适，此型根据前列腺按摩液、精液中白细胞计数又分为炎症性和非炎症性两种亚型；IV型无临床炎症性前列腺炎，没有症状，只是在病理检查或检查其他症状时发现前列腺按摩液中存在白细胞才偶然被诊断。其中I型、II型患者数量少，IV型前列腺炎因无任何症状，勿须处理，亦无重要临床意义。只有III型前列腺炎患者因常规检查及培养未能发现明确的病原体，病因不明，发病机制不清，不能进行针对性治疗，临床疗效差，而且患者数量占临床慢性前列腺炎患者的60%以上。
[0003]研宄发现纳米细菌能分泌钙化脂多糖生物膜，具有较强的毒性。人体内感染的纳米细菌，主要经泌尿系统排出体外。排尿时尿道高压可引起尿液返流进入前列腺导管和腺胞内，在此过程中，尿液中的纳米细菌容易被伴随转移，进入到前列腺内，这可能在纳米细菌感染前列腺过程中发挥主要和积极的作用。此外，前列腺导管细长、弯曲、开口处口径小，与尿道成直角或斜行向上进入尿道，也有利于尿道病原体进入腺体，不利于腺体炎性渗出物排除和引流，病原体可长期寄生在其中。以上诸多因素为纳米细菌在前列腺内感染和致病提供了条件和可能。
[0004]关于纳米细菌与III型前列腺炎和前列腺结石可能存在的病因学关系，目前国内外只有少数学者在临床方面进行了探索。Jones等最初研宄结果显示，前列腺炎患者血清中纳米细菌抗原经过ELISA分析检出率显著高于正常男性及前列腺增生患者。Shoke等通过对顽固性III型前列腺炎伴结石患者用四环素抗纳米细菌治疗后，发现患者临床症状显著改善，结石变小或消失；还有人分别从III型前列腺炎患者的EPS及前列腺结石中分离、培养出纳米细菌细菌，并发现其中纳米细菌具有较高感染率，分别达62.5%、65%。在针对性治疗后，EPS中纳米细菌阳性率明显下降。因此推断纳米细菌与III型前列腺炎和前列腺结石之间存在着较密切关系，考虑为其重要病因。
【发明内容】
[0005]本发明实施例的目的在于提供一种纳米细菌感染动物前列腺引起慢性炎症的动物模型复制方法，旨在探索III型前列腺炎及结石的病因和发病机制，解除患者痛苦，减少病患和社会医疗机构的资金支出，节约更多的医疗资源。
[0006]本发明是这样实现的，一种纳米细菌感染动物前列腺引起慢性炎症的动物模型复制方法包括:
[0007]步骤一、将经鉴定的纳米细菌的菌种进行培养并收集培养出的细菌，将所收集的细菌用PH为7.2的PBS液冲洗，用生理盐水稀释后，经ATB浊度仪比色后配制成
3.0X 108cfu/ml的纳米细菌菌液混悬液备实验用。
[0008]步骤二、大鼠分组处理:
[0009]将40只大鼠平均随机分为5组，被分养在5个笼中，能自由获取食物和水，在使用之前，适应新环境至少一周，其中对照组和模型组各16只，治疗组8只，治疗组在4周后，予四环素胃饲，按10mg/(kg 〃 d)剂量灌胃治疗4周；
[0010]步骤三、大鼠前列腺感染模型制作:
[0011]1%戊巴比妥钠溶液约1.2ml注射入大鼠腹腔全麻后，碘伏消毒大鼠尿道外口和会阴部，随后插入直径0.9mm，长2.5cm的无菌润滑聚乙烯尿管，一个胰岛素注射器抽吸0.2ml配制好的I标准麦氏单位的纳米细菌悬浮液注入雄性SD大鼠前列腺部尿道，对照组SD大鼠给予生理盐水同样方法注入；
[0012]步骤四、标本的收集:
[0013]大鼠尿道被注射细菌为O周，在相同条件下饲养，在4周将对照组和模型组大鼠各处死8只，其余3组动物在第8周后处死，分别称量大鼠的体重，无菌条件下，切取腹侧和被侧叶前列腺组织，将前列腺包膜完全清除，留下纯的前列腺组织，并分别对应其称取重量；
[0014]步骤五、前列腺组织中细胞因子检测和纳米细菌再培养标本的收集。
[0015]进一步，所述的纳米细菌的菌种的培养与收集的具体方法为:
[0016]将经鉴定的纳米细菌的菌种接种于3ml RPMI 1640培养基或含10%热灭活γ —FBS的RPMI 1640培养基中悬浮，置于37°C、5% C02和95%空气条件下培养4?5周，整个操作中严格遵循无菌技术；每周观察标本的生长情况；分别用不加标本的RPMI 1640、含10%热灭活γ — FBS的不加标本的RPMI 1640、生理盐水加入RPMI 1640作阴性对照，然后在无菌条件下4°C、2000转速离心30分钟，收集培养出的细菌，置于4°C冰箱保存备用。
[0017]进一步，前列腺组织中细胞因子检测和纳米细菌再培养标本的收集的具体方法为:
[0018](I)在无菌条件下，将每组动物腹侧半叶组织称重，按重量加入冰盐水后，分别制成10%组织匀浆，在4°C低温条件、3000转/分下超速离心15分钟后，提取上清液1ml，置低温下(-20 0C )保存备测;
[0019](2)将离心管内的多余的液体移出，剩余管底的组织和液体约Iml用生理盐水稀释5倍，经0.45 μπι滤器过滤，4°C离心40min(20, OOOXg)，弃上清，留取管底Iml充分混勾，再用无菌生理盐水稀释5倍，经0.22 μπι滤器过滤，4°C离心40min(20, OOOXg)，弃上清，留取管底Iml充分混匀。加入3ml RPMI 1640培养基或含10%热灭活γ — FBS的RPMI1640培养基中悬浮，然后按纳米细菌培养的方法进行培养。
[0020]本发明为研宄纳米细菌对前列腺的致病作用的动物实验提供的实验材料，对于探索III型前列腺炎及结石的病因和发病机制，解除患者痛苦，减少病患和社会医疗机构的资金支出，节约更多的医疗资源有重要意义。
【附图说明】
[0021]图1是本发明实施例提供的纳米细菌感染动物前列腺引起慢性炎症的动物模型复制方法的流程图。
【具体实施方式】
[0022]为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
[0023]下面结合附图及具体实施例对本发明的应用原理作进一步描述。
[0024]如图1所示，本发明是这样实现的，一种纳米细菌感染动物前列腺引起慢性炎症的动物模型复制方法包括:
[0025]S101、将经鉴定的纳米细菌的菌种进行培养并收集培养出的细菌，将所收集的细菌用PH为7.2的PBS液冲洗，用生理盐水稀释后，经ATB浊度仪比色后配制成3.0X 18Cfu/ml的纳米细菌菌液混悬液备实验用；
[0026]S102、大鼠分组处理:
[0027]将40只大鼠平均随机分为5组，被分养在5个笼中，能自由获取食物