专利名称：用于治疗炎症的新组合物的制作方法
技术领域：
本发明涉及新的药物组合物。
背景技术：
心血管病，比如冠心病和中风是死亡、残疾和卫生保健费用损失的主 因，特别是在工业化国家中。这些病症常常是动脉粥样硬化症的直接后遗 症，在抽烟的对象中优先产生的多因素病症和/或目前危险因素比如高血
压、糖尿病mellitus、高胆固醇血症、高血浆低密度脂蛋白(LDL)和甘油三 酯。
通常经过几年，有时经过数十年产生动脉粥样硬化病变(或者动脉粥 样斑)。通常涉及诸如在动脉壁中的胆固醇累积量、泡沬细胞形成、炎症和 细胞增生的病理过程。
高密度脂蛋白(HDL)、 LDL、总胆固醇和甘油三酯的水平是决定产生 动脉粥样硬化症和相关的心血管病症比如冠状动脉病(例如心绞痛，心肌 梗死等)、中风(包括大脑中枢神经血管病和瞬间局部缺血性发作)和末梢动 脉阻塞性疾病的风险的全部指标。
具有高的总胆固醇和/或甘油三酯水平的患者的风险是相当大的，与他 们是否还具有有利的HDL水平无关。具有正常的总胆固醇水平但是具有 较低的HDL水平的患者的风险也在增加。近来，还己经指出与高水平的 阿朴脂蛋白B (ApoB;其在极低密度脂蛋白(VLDL)和LDL)中携带类脂) 和/或低水平的阿朴脂蛋白A-I (ApoA-I;其在HDL中携带类脂)相关的心 血管病的风险水平是极高的。
降低血清中的LDL水平的药物可以降低动脉粥样硬化动脉粥样斑的 累积量，并且可以降低(长期)动脉粥样斑破裂和相关的血栓栓塞并发症的 风险。有几种药物可以有助于降低血液胆固醇水平。最通常开出的处方是 羟甲基戊二酰基-CoA(HMG-CoA)还原酶抑制剂(以下不管它们的类名而一起定义为"他汀")，包括辛伐他汀和阿托伐他汀。这些药物直接防止肝中形 成胆固醇，因此降低心血管病的风险。
其它处方药类包括树脂(resins)(比如消胆胺和降脂树脂2号)，其通过 结合胆汁酸起作用，因而使肝产生更多的胆汁酸，并且在该过程中耗尽胆 固醇。此外，维生素B尼克酸已经被报道除增加HDL水平以外，还在高 的剂量时降低甘油三酯和LDL水平。已知Fibrate (比如吉非贝齐和非诺贝 特)降低甘油三酯并且可以增加HDL水平。
胆固醇降低药物比如他汀的引入显著地降低冠心病和中风的死亡率。 然而，这些药物所遇到的缺点在于它们对于所有患者的效果并不是相同 的，并且已知具有某种负面效应(例如肝功能变化，肌病和横纹肌溶解)， 以及动脉粥样硬化症仍然是死亡和残疾的主要原因。事实上，最近的评论 文章(Briel等，WM4， 295， 2046(2006))提出他汀在具有严重的冠状综合 症的患者治疗的第一个4月过程中并不降低严重的心血管病。
因此对动脉粥样硬化症和相关的心血管病症的更安全和/或更有效的 治疗，特别是对具有严重冠状综合症的那些患者存在实际临床需要。
吡嘧司特是用于治疗比如哮喘、过敏性鼻炎和结膜炎的病症的口服活 性抗过敏性药物。参见例如美国专利4,122,274、欧洲专利申请EP316 174 禾口 EP 1 285 921， Yanagihara等，c/a/ aw&se Jowrwa/(^/"尸/zarmaco/ogy， 51， 93 (1989)和Z)n^yo/7b^y， 28, 29(1992)。该药物目前在例如日本以钾盐 的形式销售。
已经报道涉及吡嘧司特在防止再狭窄方面的潜在应用的研究 (Miyazawa等, / Can^ovasc.尸/zarmaco/. ， 30， 157 (1997)禾口 Ohsawa等， 爿m. T/eaW7:， 136， 1081(1998)和J CaW/o/. 42， 13(2003))。还参见欧洲专 利申请EP766 693，其公开了吡嘧司特对动脉平滑肌细胞的增生表现出抑 制作用。
美国专利申请US 2006/0024365公开了双倍延迟药物剂量形式，其包 括与立即释放低剂量活性成分组合的改性的释放高剂量高溶解度活性成 分。包括一些本文中提及的那些在内的许多药物都被列举为用于低剂量活 性成分的潜在候选者。
美国专利申请US 2007/0014733 Al公开了用于治疗心血管病症的药物组合物，其包含奈必洛尔的代谢产物。在可以与这种组合物中这样的代 谢产物组合的许多活性成分中，列举了各种活性化合物，包括本文中所提 及的那些中的一些。
美国专利申请US 2006/0148830 Al公开了用于^"^)f泌尿系统的病 症、炎症等的LPA受体(尤其是EDG-2受体)的新对抗剂。在可以与这种 新型化合物组合的许多不同活性成分之中，单独地提及某些活性化合物， 包括本文中所提及的那些中的一些。
美国专利申请US 2006/0084695公开了用于治疗心血管病，比如动脉 粥样硬化症等的MAP激酶和/或HMG-CoA还原酶的抑制剂。
最后，美国专利申请US 2005/0181023 Al公开了包括用于抑制或者防 止组织和/或器官表面之间的粘附的吡嘧司特的药物组合物。
具体包含吡嘧司特和他汀的组合产品的应用在上述任何一个文献中 均没有具体被公开。此外，这种组合产品在治疗动脉粥样硬化症和相关的 心血管病症，特别是具有严重的冠状综合症的患者的用途在这些文献的任 何一个中均没有被公开。
发明内容
根据本发明，提供一种组合产品，其包含
(a) 吡嘧司特(pemirolat)或者其药学可接受的盐或者溶剂化物；禾口
(b) 他汀或其药学可接受的盐或者溶剂化物， 所述组合产品以下被称为"根据本发明的组合产品"。
术语"他汀"包括一种或多种他汀。术语"他汀"和"HMG-CoA还原酶抑 制剂"在本发明的范围内同义使用，并且包括氟伐他汀、辛伐他汀、洛伐 他汀、罗苏伐他汀、匹伐他汀、格仑伐他汀、西立伐他汀、普伐他汀、美 伐他汀、柏伐他汀、达伐他汀和阿托伐他汀。
可以提及的其它他汀包括阿昔替酯、苯氟雷司、Clestin、考来酮、二 氢洛伐他汀、美格鲁托、mwsonol以及具有下列代号的化合物ATI-16000、 BAY-10陽2987 、 BAY-x-2678 、 BB-476 、 BIO-002 、 BIO-003 、 BIO-2 、 BMS-180431、 CP-83101、 DMP-565、 FR-901512、 GR陽95030、 HBS-107、 KS-01-019、 L-659699、 L-669262、 NR誦300、 P-882222、 PTX-023595、 RP61969、 S-2468、 SC-32561、 sc-45355、 SDZ-265859、 SQ-33600、 U-20685 以及NO-增强/释放他汀，比如NC X -6560 (硝基普伐他汀)。
更优选的他汀包括匹伐他汀(例如Livalo , Pitava ),并且更优选氟 伐他汀(例如Lescol )、辛伐他汀(例如Zocor , Lipex )、洛伐他汀(例如 Mevacor , Altocor )、罗苏伐他汀(例如Crestor )、普伐他汀(例如 Pravachol , Selektine , Lipostat②)以及阿托伐他汀(例如Lipitor , Torvast )。 特别优选的他汀包括辛伐他汀、更优选罗苏伐他汀并且特别是阿托伐他 汀。
可以提及的药学可接受的盐包括酸加成盐和碱加成盐。这样的盐可以 通过常规的方法形成，例如通过活性成分的游离酸或游离碱的形式与1当 量以上适合的酸或碱任选在溶剂中，或者在其中盐不溶解的介质中反应， 随后使用标准技术(例如在真空中，通过冷冻干燥或者通过过滤)除去所述 的溶剂或者所述的介质。盐还可以通过例如使用适合的离子交换树脂将盐 形式的活性成分的抗衡离子与另一种抗衡离子交换而制备。
优选的吡嘧司特盐包括吡嘧司特钠，更优选吡嘧司特钾。
优选的他汀盐包括钠、钾和钙盐，比如匹伐他汀钙、氟伐他汀钠、普 伐他汀钠、罗苏伐他汀钙和阿托伐他汀钙。
在根据本发明的组合产品中使用的活性成分可以以非对映异构体富 含形式和/或对映异构体富含形式使用。发明人的用意是通过"非对映异构 体富含"和"对映异构体富含"分别表示活性成分的非对映异构体/对映异构 体的任意混合物，其中一种同分异构体以比另一种更大的比率存在。例如， 可以使用具有大于90%的光学杂质(对映异构体过量；e.e.)的对映异构体。
根据本发明的组合产品提供与他汀结合的如下限定的吡嘧司特的给 药，因此可以以分开的多种制剂存在，其中这些制剂中的至少一种包括吡 嘧司特，并且至少一种包括他汀，或者可以以组合的制剂形式存在(即，配 制的)(即，以包含吡嘧司特和他汀的单一制剂的形式存在)。
因此，进一步提供 (l)药物制剂，其包含吡嘧司特或其药学可接受的盐或者溶剂化物；他汀或 其药学可接受的盐或者溶剂化物；以及药学可接受的助剂、稀释剂或载体 (所述制剂以下被称为"组合制剂")；以及
7(2)包含以下组分的多个部分的试剂盒(akit of parts):
(A) 包含与药学可接受的助剂、稀释剂或载体混合的吡嘧司特或其药学可 接受的盐或者溶剂化物的药物制剂；以及
(B) 包含与药学可接受的助剂、稀释剂或载体混合的他汀或其药学可接受的 盐或者溶剂化物的药物制剂
所述组分(A)和(B)各自是以适于彼此结合给药的形式提供的。
根据本发明的另一个方面，提供一种制备如上限定的多个部分的试剂 盒的方法，所述方法包括使如上限定的组分(A)与如上限定的组分(B)结合，
从而使两种组分适于相互结合给药。
使两种组分相互"结合"，发明人认为(include)试剂盒的组分(A)和(B) 可以为
(i) 以单独制剂的形式(即相互独立地)提供，随后相互混合在一起以彼此结 合用于组合治疗；或
(ii) 以"组合包装"的单独组分形式包装并且放置在一起，以相互结合用于组 合治疗。
因此，进一步提供一种多个部分的试剂盒，其包含
(I) 如本文中限定的组分(A)和(B)中的一种；以及
(II) 将两种组分中的组分彼此结合使用的说明。
本文中所述的试剂盒可以包括多于一种的包含适合量/剂量的吡嘧司 特/盐/溶剂化物的制剂，和/或多于一种的包含适合量/剂量的他汀/盐/溶剂 化物的制剂，以提供重复配制。如果多于一种制剂(包括活性化合物)存在， 则这些的制剂可以相同，或者可以在任何一种化合物的剂量方面、化学组 成和/或物理形式方面不同。
优选用于根据本发明的组合产品的他汀不是所谓的"他汀内酯"形式。 然而，根据本发明的组合产品可以包括匹伐他汀内酯和美伐他汀内酯，优 选氟伐他汀内酯，罗苏伐他汀内酯，普伐他汀内酯和阿托伐他汀内酯，特 别是洛伐他汀内酯和辛伐他汀内酯。
根据本发明的组合产品找到了治疗炎症的用途。炎症通常的特征在于 免疫防护机制的激活，从而对宿主导致弊大于利的后果。这种病通常伴随 有不同程度的组织发红或充血、肿胀、高热症、疼痛、瘙痒、细胞死亡和组织破坏，细胞增生和/或丧失机能。可以提及的炎症包括膀胱炎、前列腺 炎、糖尿病血管并发症、偏头风，更优选敏感症(包括过敏性结膜炎和过敏 性鼻炎)、关节强硬性脊椎柱炎、哮喘、特异性皮炎、慢性阻塞性肺病、接 触性皮炎、痛风性关节炎、炎症性肠病(比如局限性回肠炎和溃疡性结肠 炎)、多发性硬化、骨关节炎、胰腺炎、牛皮痫、牛皮癣关节炎、类风湿性
关节炎、腱炎、粘液囊炎、Sjogren综合症、全身性红斑狼疮、葡萄膜炎、
风疹、血管炎、动脉粥样硬化症和相关的心血管病症。可以提及的病包括 偏头风更优选哮喘、慢性阻塞性肺病、局限性回肠炎、多发性硬化、牛 皮痫、类风湿性关节炎、全身性红斑狼疮、溃疡性结肠炎，更特别是动脉 粥样硬化症和相关的心血管病症。
本领域技术人员应理解术语"动脉粥样硬化症"包括特征在于在血管、 特别是动脉壁中的胆固醇累积量、泡沫细胞形成、炎症和细胞增生的任何 疾病。与动脉粥样硬化症"相关"的心血管病症包括主动脉瘤(包括异常和/ 或动脉粥样硬化主动脉瘤)，更优选动脉硬化、末梢动脉阻塞性疾病、冠状 动脉病(例如心绞痛，心肌梗死心脏病发作等)、冠心病(包括心脏病和心脏
疾病，比如缺血性心脏病)，并且还可以包括动脉粥样斑破裂(plaque rupture) 或粉瘤破裂和/或不稳定、脉管或动脉疾患，缺血性疾病/局部缺血和中风 (包括脑血管意外和瞬间局部缺血性发作)。
优选的患者群包括具有严重的冠状综合症的患者。本领域技术人员应 理解术语"严重的冠状综合症"包括任何异常的心肌和缺血状态，但通常不 独有地与例如胸部疼痛(例如强心性)和/或异常心电图(ECG)的产生相关。
这样的综合症是心肌梗死(心脏病发作)的最普通表现。技术人员应理解该 术语很大程度上同与"稳定心绞痛"相反的术语"不稳定心绞痛"同义(即在 用力时产生并且在休息时减轻的绞痛)。在恶化状态发生的产生的绞痛("渐 强绞痛")类似地被技术人员视为在"不稳定"的定义之内。
根据本发明的另一个方面，提供一种治疗炎症，特别是动脉粥样硬化 症和/或相关的心血管病症的方法，所述方法包括将根据本发明的组合产品 对需要这种治疗的患者给药。
为了避免疑义，在本发明的上下文中，术语"处理"、"治疗"和"治疗方 法"包括需要的患者的治疗或者缓解治疗，以及易于炎症比如动脉粥样硬化症和相关的心血管病症的患者的预防性治疗和/或诊断。
对于如本文中所述的多部分的试剂盒，发明人认为"结合给药"包括 在相关疾病的治疗过程中按序、单独和/或同时地将包含吡嘧司特(或者其 盐/溶剂化物)和他汀(或其盐/溶剂化物)的相应制剂给药。
因此，对于根据本发明的组合产品，术语"结合给药"包括将组合产品 的两种组分(吡嘧司特和他汀)一起或者时间上非常接近地给药(任选重复 地)，以在相关疾病的治疗过程中能够为患者提供有利的作用，而非在治疗 的相同过程中将包含吡嘧司特的制剂或者包含他汀的制剂在没有另一种 组分的情况下单独地(任选重复地)给药。确定组合是否提供对特殊疾病和 其治疗过程提供更大的有利作用将取决于治疗或者预防的条件，但是可以 由技术人员常规地实现。
此外，在根据本发明的多部分的试剂盒的上下文中，术语"与......结合"
包括可以将两种制剂中的一种或另一种给药(任选重复地)，在其后、之前 和/或同时将另一种组分给药。当在本上下文中使用时，术语"同时给药" 和"与....同时给药"包括在48小时(例如24小时)内将各个剂量的吡嘧司特
和他汀相互给药。
"患者"包括哺乳动物(包括人)患者。
根据本发明，优选将吡嘧司特和他汀以药学可接受剂型的包含所述化 合物的药物制剂的形式局部地或系统地给药，例如，口服、静脉内或动脉
内(包括血管内扩张(stent)和其它血管周围装置/剂型)、肌肉、皮肤、皮下、 转化粘液质(transmucosally)(例如舌下或者口腔)、直肠、皮肤 (transdermally)、鼻子、肺部(例如气管或者支气管)、局部地、或者任何其 它的肠胃外路线给药。优选的供给模式包括口服(很大程度上)、静脉内、 皮肤或者皮下、鼻子、肌肉、腹膜内供给。
通常将吡嘧司特和他汀一起或者分别以一种或多种与药学可接受的 助剂、稀释剂或载体混合的药物制剂形式给药，所述药学可接受的助剂、 稀释剂或载体可以是在应有考虑给药和标准药物实践的预期路线的情况 下选择。这种药学可接受的载体对活性化合物可以是化学惰性的，并且在 使用条件下可以没有不利的负面影响或者毒性。这些药学可接受的载体还 可以赋予任一种活性成分的即时或者改进的释放，而不论是以组合制剂还是以多部分的试剂盒的形式一起给药。
适合的药物制剂可以是商购的，或者另外描述于文献，例如，
Remington T7 e 6"c/ewce iVac&'ce o/户/zarw"qy， 第19版，Mack Printing Company, Easton， Pennsylvania (1995)禾卩M"r"'"cfcjf/e - 7Tze C麵/ /ete ZVwg i^/^e"ce (第34版)以及其中所引用的文献，所有这些文献的相关内容通 过引用结合在此。另外，包含吡嘧司特和他汀的适合的制剂并且特别是组 合制剂的制备可以由技术人员采用常规技术非创造性地实现。
在一种或多种制剂中的活性成分的量将取决于要治疗的疾病的严重 性以及要治疗的患者，以及所使用的一种或多种化合物，但是可以由技术 人员非创造性地确定。
根据要治疗的病症以及要治疗的患者，以及给药路线，活性成分可以 以对需要它的患者在治疗上有效的不同剂量给药。
然而，在本发明的范围内，对哺乳动物、特别是对人给药的剂量应当 足以在合理的时帧(timeframe)内实现哺乳动物的治疗响应。本领域技术人 员应认识到精确剂量和组合物以及最适合的供给体系的选择也受到以下 因素的影响尤其是制剂的药物性质、治疗的疾病的性质和严重性和接受 者的身体状态和精神敏感性以及特殊化合物的潜能、要治疗的患者的年 龄、状态、体重、性别和反应，和疾病的阶段/严重性以及患者之间的基因 差别。
活性成分的给药可以是连续或者间歇的(例如通过快速浓注)。剂量还 可能决定于给药的时机和频率。
适合的活性成分剂量包括在医学文献比如Ma^Mcfa/e - 77ze Comptoe />唯i e/e簡ce (第34版)和其中所提及的文献中所提及的那些，所有这些 文献的相关内容都通过引用结合在此。因此，适合的活性成分剂量在约 0.01mg/kg体重 约1，000mg/kg体重的范围内。在以口服形式给药时，更 优选的范围是每天约0.1 mg/kg至约20 mg/kg。
然而，适合的吡嘧司特剂量对于本领域技术人员是已知的。例如，每 日剂量范围的适合下限是约2mg，例如约5mg，比如约10mg，并且更优 选约20mg;而每日剂量范围的适合上限是约200mg，例如约100mg,比 如约80mg，并且更优选约60mg。因此，每日口服剂量可以在约2 mg至
ii约50mg之间，比如在约5mg至约40mg之间，并且优选在约10mg至 约30mg之间。适合的个人剂量可以是约20mg/天，或者约40mg/天。上 述剂量/剂量范围全部与所用制剂是如上所述的组合制剂还是多部分的试 剂盒无关。
类似地，适合的他汀剂量对于本领域技术人员是巳知的。因此，每天 的口服剂量典型地在约2mg至约150mg，比如约5 mg至约100 mg，优 选约8 mg至约90 mg，例如约10 mg至约80 mg的范围内，与所用制剂 是如上所述的组合制剂还是多部分的试剂盒无关。适合的匹伐他汀剂量按 每天计在约0.5 mg/至约10 mg，比如约0.75 mg至约5 mg，优选约1 mg 至约4 mg，例如约2 mg的范围内，与所用制剂是如上所述的组合制剂还 是多部分的试剂盒无关。
无论如何，医学专业人员或者其它技术人员能够常规地确定最适合个 人患者的实际剂量。上述剂量是平均情况的示例；当然，可能存在更高或 者更低的剂量范围是有利的个别情况，并且这些都在本发明的范围内。
无论在本文中是否使用单词"约"，例如在活性成分剂量的上下文中， 都应当理解这些变量是近似的，并且同样地，可以从本文中规定的数值变 化±10%，例如±5%，优选±2%(例如± 1%)。
本文中所述的组合产品/方法可以具有的优点在于，在上述病的治疗 中，与本领域中已知用于治疗炎症(比如动脉粥样硬化症和相关的心血管病) 的类似方法(治疗)或者其它方法相比，它们对于医生和/或患者可以更方 便、更有效、毒性更小、具有更宽的活性范围、更有效力、产生更少的负 面影响，或者它可以具有其它有用的药物性质。
本发明参考附图
(图l)通过下列实施例进行说明，其中腹腔灌洗液中 按每mL计的多形核白细胞(PMN)的平均数量来自没有(基线)和具有由腹 膜内注射的酵母聚糖A(酵母聚糖)的5小时刺激所导致的腹膜炎的老鼠。 显示了在未治疗动物(未治疗)和用单独的吡嘧司特(Pemiro)、单独的阿托伐 他汀(Atorva)或与阿托伐他汀组合的吡嘧司特(Pemiro+Atorva)治疗的动物 的酵母聚糖诱导的发炎PMN白细胞累积量。
实施例莫诺美地-6 (monoMac-6)细胞发炎介体释放化验
在补充有lmM丙酮酸钠、lx非必需的氨基酸、1-100 pg/mL胰岛素、 lmM草乙酸、100单位/mL青霉素、100 (ig/mL链霉素和10%(体积/体积) 牛胎儿血清的RPMI-1640培养基中培养(37。C/5。/。C02)莫诺美地-6 (MM6) 细胞(Ziegler-Heitbrock等，/"A / Ca騰r， 41， 456 (1988))。添力口 TGF(3 (2 ng/ml)和l,25(OH)2D3 (50 nM)以进行分化，通常要约2-4天。
为了刺激发炎介体白细胞三烯B4 (LTB4)的释放，使用25-50 pM花生 四烯酸和2-10pM钙离子载体A23187 (还可以在没有花生四烯酸的情况下 使用A23187)，将分化或者未分化的MM6细胞(在l-15xl06/mL; 0.5-1 mL) 培育5-30分钟(在37°C，在含钙的PBS中)。还可以在有或没有上述的 A23187和/或花生四烯酸的情况下利用经证明的生物活性浓度的腺苷二 磷酸(ADP)和/或血栓烷类似物U-46619刺激MM6细胞。MM6培育/刺激 也可以人血小板(来自健康捐赠者血液)的存在下进行，其中MM6:血小板 比率为1:10至1:10000。使用2体积的冷甲醇和作为内标添加的前列腺素 B2 (PGB2)停止培育/刺激。将样品离心，并且用水稀释上层清液，以达到 30%的最终甲醇浓度，并且将pH调节至3-4。在预调节的(lmL甲醇，随 后是1 mLH20) C18固相柱子(英国的SorbentTechnology)上萃取上清液中 的花生四烯酸代谢产物。使用甲醇洗脱代谢产物，之后将l体积的水添加 到洗出液中。对于反相HPLC，将76 pL的每一个样品与39 pLH20混合(也 可以使用其它体积比)。使用甲醇/乙腈氾20/乙酸(30:35:35:0.01体积/体积) 以1.2 mL/min洗脱Waters RCM 8x 10柱子。在270 nm监测洗出液的吸光 度以以检测并且量化PGB2和LTB4。还可以根据来自试剂盒生产商的说明 使用用于测量LTB4的可商购酶免疫化验试剂盒(EIA/ELISA试剂盒)。根据 来自生产商的说明使用可商购酶免疫化验试剂盒(EIA/ELISA试剂盒)，还 可以分析来自上述MM6培育/刺激的上清液中发炎介体前列腺素E2(PGE2) 和/或血栓烷B2(TxB》的含量。
利用超声、加热和根据需要的pH调节(还可以使用其它手段)，在乙 醇、DMSO、 N-甲基-2-吡咯烷酮、PEG 400、丙二醇和/或去离子水或生理盐溶液中制备吡嘧司特和他汀(匹伐他汀、氟伐他汀、洛伐他汀、普伐他汀 或优选地辛伐他汀、罗苏伐他汀或阿托伐他汀)的储备溶液。在用于发炎介 体释放的MM6刺激之前，使用一种或多种试验药物(与他汀组合的吡嘧
司特，单独的吡嘧司特和单独的他汀)将细胞培育(在37。C/5y。C02，在不含 钙的PBS中，或者在含1-10%牛胎儿血清的RPMI-1640中，在有或者没 有补充物的情况下)l分钟至24小时(还可以与MM6剌激同时添加一种或 多种试验药物)。添加药物以达到lnM至100pM的最终浓度(为了比较， 一些实验在没有药物的情况下进行)。
为了刺激发炎细胞因子和趋化因子比如IL-ip、 IL-6、 TNF、 IL-8、 IL-10、IL-12p70、MCP-l的释放，使用脂多糖(LPS，最终浓度l-100ng/mL)、 佛波醇-12-肉豆蔻酸酯-13-乙酸酯(PMA，最终浓度1-100 ng/mL)或 LPS/PMA混合物，将分化或者未分化的MM6细胞(在l-10xl0VmL)培育 (37°C/5%C02)4-24小时(在具有1-10%牛胎儿血清的RPMI-1640中，具有 或者没有补充物)。还可以在有或没有上述的PMA和/或LPS的情况下利 用经证明的生物活性浓度的腺苷二磷酸(ADP)、花生四烯酸、钙离子载体 A23187和/或血栓烷类似物U-46619刺激MM6细胞。MM6培育/刺激也 可以在人血小板(来自健康捐赠者血液)的存在下进行，其中MM6:血小板 比率为1:10至1:10000。在MM6刺激之前，使用一种或多种试验药物(与 他汀组合的吡嘧司特，单独的吡嘧司特和单独的他汀；对于储备溶液和浓 度，同上)将细胞培育(在37°C/5%C02，在含1-10%牛胎儿血清的 RPMI-1640中，有或者没有补充物的情况系下)l分钟至24小时(为了比较， 一些实验在没有药物的情况下进行；还可以与MM6刺激同时添加一种或 多种试验药物)。在培育/刺激后离心分离出(spinningdown)细胞之后，使用 Cytometric Bead Array(美国圣地亚哥的BD Biosciences Pharmingen)，根据 生产商的说明，量化上层清液中的人细胞因子和趋化因子浓度。还可以根 据生产商的说明使用用于测量细胞因子和趋化因子的可商购酶免疫化验 试剂盒(EIA/ELISA试剂盒)。将细胞血小板冷冻保存(-80。C)在RLT缓冲液 (QIAGEN， Valencia, CA)中，直至用于微阵列(microarray)实验的进一步 处理(参见下面的实施例12)。实施例2
人的末梢血细胞发炎介体释放化验
采用建立的方案，通过Lymphoprep或Ficoll-Paque分离(使用或者不 使用Polymorphoprep分离和/或右旋糖酐沉降)，从健康捐赠者血液中分离 人末梢血液单核细胞(PBMC)或多形核细胞(PMN)。
为了剌激发炎介体白细胞三烯B4(LTB4)的释放，使用25-50 花生 四烯酸和2-10)aM钙离子载体A23187 (还可以在不使用花生四烯酸的情况 下使用A23187)，将PBMC或PMN(在l-15xl06/mL; 0.5-1 mL)培育5-30 分钟(在37°C，在含钙的PBS中)。还可以在有或没有上述的A23187禾口/ 或花生四烯酸的情况下利用经证明的生物活性浓度的腺苷二磷酸(ADP)和 /或血栓垸类似物U-46619刺激PBMC/PMN。上述PBMC/PMN培育/刺激 也可以在人血小板(来自健康捐赠者血液)的存在下进行，其中PBMC/PMN: 血小板比率为1:10至1:10000。使用2体积的冷甲醇和作为内标添加的前 列腺素B2停止培育/刺激。将样品离心，并且用水稀释上层清液，以达到 30%的最终甲醇浓度，并且将pH调节至3-4。在预调节的(lmL甲醇，随 后是l mLH20)C18固相柱子(英国的SorbentTechnology)上萃取上层清液 中的花生四烯酸代谢产物。使用甲醇洗脱代谢产物，之后将l体积的水添 加到洗出液中。对于反相HPLC，将76 的每一个样品与39 )iL H20混 合(也可以使用其它体积比)。使用甲醇/乙腈/1120/乙酸(30:35:35:0.01体积/ 体积)以1.2 mL/min洗脱Waters RCM 8x10柱子。在270 nm监测洗出液的 吸光度以检测并且量化PGB2和LTB4。还可以根据来自试剂盒生产商的说 明使用用于测量LTB4的可商购酶免疫化验试剂盒(EIA/ELISA试剂盒)。根 据来自生产商的说明使用可商购酶免疫化验试剂盒(EIA/ELISA试剂盒)， 还可以分析来自上述PBMC/PMN培育/刺激的上层清液中的发炎介体前 列腺素E2(PGE2)和/或血栓垸B2(TXB2)的含量。在用于发炎介体释放的 PBMC/PMN刺激之前，使用一种或多种试验药物(与他汀(匹伐他汀、氟伐 他汀、洛伐他汀、普伐他汀或者优选地，辛伐他汀、罗苏伐他汀或阿托伐 他汀)组合的吡嘧司特，单独的吡嘧司特和单独的他汀)将细胞培育(在 37°C，在不含钙的PBS中，或者在含0-10%牛胎儿血清的RPMI-1640中)l 分钟至24小时(对于关于药物储备溶液和浓度的细节，参见上述实施例1;还可以与PBMC/PMN刺激同时添加一种或多种试验药物)。为了比较，一
些实验在没有药物的情况下进行。
为了刺激发炎细胞因子和趋化因子比如IL-1P、 IL-6、 TNF、 IL-8、 IL-10、IL-12p70、MCP-l的释放，使用脂多糖(LPS，最终浓度l-100ng/mL)、 佛波醇-12-肉豆蔻酸酯-13-乙酸酯(PMA，最终浓度1-100 ng/mL)或 LPS/PMA混合物，将PBMC/PMN(在l-10xl()6/mL)培育(37。C/5。/。CO2)4-24 小时(在具有1-10%牛胎儿血清的RPMI-1640中)。还可以在有或没有上述 的PMA和/或LPS的情况下，利用经证明的生物活性浓度的腺苷二磷酸 (ADP)、花生四烯酸、钙离子载体A23187和/或血栓烷类似物U-46619刺 激PBMC/PMN细胞。PBMC/PMN培育/刺激也可以在人血小板(来自健康 捐赠者血液)的存在下进行，其中PBMC/PMN:血小板比率为1:10至 1:10000。在用于细胞因子/趋化因子释放的PBMC/PMN刺激(为了比较， 一些实验在没有药物的情况下进行；还可以与PBMC/PMN刺激物同时添
加一种或多种试验药物)之前，使用一种或多种试验药物(与他汀组合的吡 嘧司特，单独的吡嘧司特和单独的他汀，同上)将细胞培育(在37°C/5%C02， 在含1-10%牛胎儿血清的RPMI-1640中)l分钟至24小时。在培育/刺激后 离心分离出该细胞之后，使用Cytometric Bead Array(美国圣地亚哥的BD Biosciences Pharmingen)，根据生产商的说明，量化上层清液中的人细胞因 子和趋化因子浓度。还可以根据生产商的说明使用用于测量细胞因子和趋 化因子的可商购酶免疫化验试剂盒(EIA/ELISA试剂盒)。将细胞血小板冷 冻保存(-80。C)在RLT缓冲液(QIAGEN， Valencia, CA)中，直至用于微阵 列实验的进一步处理(参见下面的实施例12)。
实施例3
老鼠肥大细胞发炎介体释放化验
通过培养来自C57BL/6老鼠的骨髓细胞而得到由骨髓得到的培养的 老鼠肥大细胞(mMC)。将骨髓细胞(来自用PBS冲洗过的老鼠大腿骨)在 10% WEHI-3或X-63富含的经调节的RPMI 1640(37。C/5。/。C02)中培养，其 中补充有10%热减活的牛胎儿血清、4 mM L-谷氨酰胺、50 2-巯基乙 醇、1 mM丙酮酸钠、0.1 mM非必需的氨基酸、10 mM Hepes以及100pg/mL青霉素/链霉素。通过试剂盒在细胞表面上的表达(通过流动血细胞
计数)和/或通过甲苯胺蓝染色(通常在培养至少3-5周之后)证实肥大细胞
(在悬浮液中生长)的发展。
通过培养来自C57BL/6老鼠的骨髓细胞获得由骨髓得到的经培养的 结缔组织型(CT型)老鼠肥大细胞。将骨髓细胞在RPMI 1640培养基中培 养(37。C/5。/。C02)，所述RPMI 1640培养基含有10%经过滤的FCS、4 mM L-谷氨酰胺、1 mM丙酮酸钠、100 IU/mL青霉素G、 100 pg/mL链霉素、 0.1 mM MEM非必需的氨基酸和50 pM 2-ME，补充有50 ng/mL的重组体 鼠科干细胞因子和1 ng/mL鼠科重组体IL-4。通过试剂盒在细胞表面上的 表达(通过流动血细胞计数)和/或通过甲苯胺蓝染色(通常在培养至少3-5 周之后)证实肥大细胞的发展。
还可以使用老鼠肥大细胞系MC/9 (由ATCC得至U，产品号CRL-8306) 和C1.MC/C57.1 (Young等，iVoc. A^/.」cad 夷嵐，84， 9175 (1987))。 根据来自ATCC (http:〃www.atcc.om)的说明培养MC/9细胞，并且如在 Rumsaeng等0//mww"o/. 158， 1353 (1997))中所述培养C1.MC/C57.1细胞。
对于通过IgE-受体的交联的激活/刺激，首先使用被用作15%杂交瘤 上层清液的单克隆老鼠抗-TNPIgE-抗体(IgEl-b4,ATCC， Rockville， MD， 美国)将经培养的肥大细胞在37°C (5。/。C02)敏化90分钟。然后在通过添加 100 ng/mL偶联比率为9/1的TNP-BSA(Biosearch Technologies, San Francisco, CA)激活细胞(在0.5-10xloVmL)之前，使用PBS将用于N-乙酰 基-P-D-氨基已糖苷酶(或组胺)或细胞因子/趋化因子释放化验(参见下面) 的细胞进行两次洗涤，并且在补充有0.2。/o牛血清白蛋白(BSA)(Sigma)的 RPMI-1640培养基中重新悬浮。使用TNP-BSA的培育(37。C/5。/。C02)对于 卩-氨基已糖苷酶(或组胺)释放的分析进行30分钟，而对于细胞因子和趋化 因子释放的分析进行6-24小时。在添加TNP-BSA之前，使用一种或多种 试验药物(与他汀(匹伐他汀、氟伐他汀、洛伐他汀、普伐他汀或者优选地， 辛伐他汀、罗苏伐他汀或阿托伐他汀)组合的吡嘧司特，单独的吡嘧司特和 单独的他汀)将细胞培育(在37。C/5。/。C02)l分钟至24小时(对于关于药物储 备溶液和浓度的细节，参见上述实施例1;还可以与TNP-BSA刺激同时 添加一种或多种试验药物)。为了比较， 一些实验在没有药物的情况下进行。在培育/刺激之后，将样品离心，并且如下所述分析上层清液的P-氨基已 糖苷酶(或组胺)和/或细胞因子/趋化因子的含量。将细胞血小板冷冻保存
(-80。C)在RLT缓冲液(QIAGEN， Valencia, CA)中，直至用于微阵列实验 的进一步处理(参见下面的实施例12)。
为了检测粒状肥大细胞酶p-氨基已糖苷酶的IgE依赖性释放，使用 酶比色分析化验。将每一个令人满意的(well)上层清液的60 pL转移到96 孔板，并且与等体积的底物溶液(7.5mM对硝基苯基-N-乙酰基-b-D-氨基 葡糖苷溶解在80 mM柠檬酸中，pH4.5)混合。将该混合物在摇摆器平台 上于37。C培育2小时。在培育之后，将120 nL甘氨酸(0.2 M， pH 10.7) 添加至每 一 个孔内，并且使用Emax精确微板读取器(Emax Precision Microplate Reader)(分子装置，Sunnyvale, CA)测量在405和490 nm的吸 光度。P-氨基己糖苷酶的释放表示为在细胞溶胞后确定的总P-氨基己糖 苷酶的百分比。为了检测粒状肥大细胞组胺的IgE依赖性释放，根据来自 生产商的说明，使用用于测量组胺的可商购酶免疫化验试剂盒(EIA/ELISA 试剂盒)。
为了检测老鼠肥大细胞细胞因子和趋化因子比如IL-6、 IL-4、 TNF、 IL-1(3、 KC、 MCP-1、 IL-IO、 IL-12p70、 IFNy的IgE依赖性释放，根据生 产商的说明，使用Cytometric Bead Array (美国圣地亚哥的BD Biosciences Pharmingen)。还可以根据来自生产商的说明使用用于测量细胞因子和趋化 因子的可商购酶免疫化验试剂盒(EIA/ELISA试剂盒)。
除上述肥大细胞实验以外，还可以使用已经确立并且经证明的用于分 析组胺、(3-氨基已糖苷酶或类胰蛋白酶从新分离的腹膜大鼠或老鼠肥大细 胞的诱导释放(使用例如抗-IgE (在使用或者不使用大鼠或老鼠IgE预处理 细胞的情况下，或没有该预处理的情况下)伴刀豆球蛋白A、蛋白质L、 化合物48/80、离子载体A23187、 PMA)的实验方法和化验，研究一种或 多种试验药物(同上)的肥大细胞抑制作用。
实施例4
RAW 264.7细胞发炎介体释放化验
将RAW 264.7细胞在DMEM中培养(37。C/5。/。C02)， DMEM补充有100单位/mL青霉素以及100 pg/mL链霉素和10%牛胎儿血清。
为了刺激发炎细胞因子和趋化因子比如IL-6、 TNF、 IL-ip、 KC、 MCP-1、 IL-IO、 IL-12p70、 IFNy的释放，使用脂多糖(LPS，最终浓度 l-100ng/mL)、佛波醇-12-肉豆蔻酸酯-13-乙酸酯(PMA，最终浓度1-100 ng/mL)、或LPS/PMA混合物，将RAW 264.7细胞(在l-10xl()6/mL)培育 (37°C/5%C02)4-24小时(在具有1-10%牛胎儿血清的DMEM中，具有或者 不具有补充物)。还可以在有或没有上述的PMA禾n/或LPS的情况下，使 用经证明的生物活性浓度的腺苷二磷酸(ADP)、花生四烯酸、钙离子载体 A23187和/或血栓烷类似物U-46619刺激RAW264.7细胞。RAW264.7培 育/刺激还可以在老鼠或人(来自健康捐赠者血液)的血小板存在下进行，其 中RAW264.7:血小板的比率为1:10至l:10000。在用于细胞因子/趋化因子 释放的RAW 264.7刺激之前，使用一种或多种试验药物(与他汀(匹伐他汀、 氟伐他汀、洛伐他汀、普伐他汀或者优选地，辛伐他汀、罗苏伐他汀或阿 托伐他汀)组合的吡嘧司特，单独的吡嘧司特和单独的他汀)将细胞培育(在 37°C/5%C02，在含1-10%牛胎儿血清、具有或者不具有补充物的DMEM 中)l分钟至24小时(对于关于药物储备溶液和浓度的细节，参见上述实施 例l;还可以与RAW264.7刺激同时添加一种或多种试验药物)。为了比较， 一些实验在没有药物的情况下进行。在培育/刺激后离心分离出细胞之后， 使用Cytometric Bead Array(美国圣地亚哥的BD Biosciences Pharmingen)， 根据生产商的说明，量化上层清液中的老鼠细胞因子和趋化因子的浓度。 还可以根据生产商的说明使用用于测量细胞因子和趋化因子的可商购酶 免疫化验试剂盒(EIA/ELISA试剂盒)。将细胞血小板冷冻保存(-80。C)在 RLT缓冲液(QIAGEN， Valencia, CA)中，直至用于微阵列实验的进一步 处理(参见下面的实施例12)。
实施例5
由角叉菜胶导致的大鼠脚爪炎症
该化验是基本上根据由Winter等(尸rac. 所o/. MW.,
111， 544 (1962))所述的化验。将一种或多种试验药物(与他汀(匹伐他汀、 氟伐他汀、洛伐他汀、普伐他汀或者优选地，辛伐他汀、罗苏伐他汀或阿托伐他汀)组合的吡嘧司特、单独的吡嘧司特和单独的他汀)以0.03至50
mg/kg的剂量每隔2-24小时对重量约为150-400 g的雄性Sprague-Dawley 或Wistar大鼠进行皮下、静脉内、腹膜内或口腔内给药(为了比较， 一些 实验在没有药物的情况下进行)。在给药之前，根据需要将药物的储备溶液 (参见上面的实施例l)在水.(用于口腔治疗)或盐水(用于肠胃外给药)中例如 0.5%或1%的甲基纤维素中稀释。还可以使用其它媒介物。在第一药物剂 量之后1分钟至24小时，将在0.9%盐水中的0.5、 1.0或2.0%角叉菜胶溶 液(型号IV Lambda, Sigma Chemical Co.)注入到麻醉大鼠的一个后爪的下 脚底区域。在角叉菜胶注入之前和在角叉菜胶注入后指定的时间间隔3-24 小时，使用连接至具有数字显示器的压力传感器的移位器官充满度测量器 (displacement plethysmometer)测量被注射爪的体积。肿胀程度表示发炎浮 肿的程度。在角叉菜胶注射之后的3-24小时，大鼠死亡并且灌满了盐水或 PBS(还可以使用其它灌注介质)。将来自发炎爪的脚底软组织活体收集、 称重、冷冻保存(用于微阵列分析的样品在TRIzol， Invitrogen， Carlsbad， CA中于-80。C冷冻)，以及如下所述(实施例10和12)，随后对l)反映发 炎嗜中性白细胞累积量的髓过氧化物酶(MPO)累积量和/或2)使用微阵列 技术组织基因表达进行分析。来自未处理大鼠的未发炎爪组织提供了MPO 的基线水平和基因表达。还可以使用常规的组织学和免疫组织化学技术研 究组织炎症。爪炎症还可能通过化合物48/80(48/80，在50-100 (il PBS或 盐水中为1-5 pg)(代替角叉菜胶)的下脚底注射引起，随后在48/80注射后 30分钟至8小时测量发炎爪肿胀，并且收集用于微阵列和/或MPO分析(同 上)的组织活体。
实施例6
由巴豆油引起的老鼠耳朵炎症
该化验基本上根据由Tonelli等CEmfocn'"o/ogy 77， 625 (1965))等所述 的化验(还可以使用其它种类的老鼠)。每隔2-24小时将一种或多种试验药 物(与他汀(匹伐他汀、氟伐他汀、洛伐他汀、普伐他汀或者优选地，辛伐 他汀、罗苏伐他汀或阿托伐他汀)组合的吡嘧司特、单独的吡嘧司特和单独 的他汀)以0.03至50mg/kg的剂量通过皮下、静脉内、腹膜内或口服方式给药(为了比较， 一些实验在没有药物的情况下进行)。在给药之前，根据 需要将药物的储备溶液(参见上面的实施例l)在例如水(用于口腔治疗)或 者盐水(用于肠胃外给药)中0.5%或1%甲基纤维素中稀释。还可以使用其
它媒介物。在第一次药物剂量后1分钟至24小时，将10-30 pL在丙酮或 乙醇中的2.0或4.0%巴豆油溶液局部地涂敷在一只或两只耳朵上。在巴豆 油涂敷之后的规定时间间隔4-12小时，动物死亡，并且称量耳朵的穿孔活 组织，以确定耳朵的发炎肿胀(也可以测量耳朵厚度以确定肿胀)。收集来 自发炎耳朵的活组织、冷冻保存(将用于微阵列分析的样品在-80。C冷冻于 TRIzol中)，并且如下所述(实施例IO和12)，随后对l)髓过氧化物酶(MPO) 累积量、这反映发炎嗜中性白细胞累积量；和/或2)利用微阵列技术的组 织基因表达进行分析。来自未处理的老鼠的未发炎的耳朵活组织提供了肿 胀、MPO和基因表达的基线水平。组织炎症也可以使用常规的组织学和 免疫组织化学技术进行研究。
实施例7
由佛波醇酯或花生四烯酸引起的老鼠耳朵炎症
这些化验基本上根据由Chang等(五w: /尸/wmwco/. 142， 197 (1987))
所述的化验(但是可以使用其它种类的老鼠)。每隔2-24小时将一种或多种 试验药物(与他汀(匹伐他汀、氟伐他汀、洛伐他汀、普伐他汀或者优选地， 辛伐他汀、罗苏伐他汀或阿托伐他汀)组合的吡嘧司特、单独的吡嘧司特和 单独的他汀)以0.03至50mg/kg的剂量通过皮下、静脉内、腹膜内或口服 方式对雄性或雌性老鼠给药(为了比较， 一些实验在没有药物的情况下进 行)。在给药之前，根据需要将药物的储备溶液(参见上面的实施例l)在例 如水(用于口腔处理)或者盐水(用于肠胃外给药)中0.5%或1%甲基纤维素 中稀释。还可以使用其它媒介物。在第一次药物剂量后1分钟至24小时， 将在10-30 pl丙酮或乙醇中的1-10 pg佛波醇12-肉豆蔻酸酯13-乙酸酯 (PMA)、十四烷酰基佛波醇乙酸酉旨(TPA)或1-5 mg花生四烯酸局部地涂敷 在一只或两只耳朵上。在涂敷PMA或TPA后4-12小时以及在涂敷花生 四烯酸后30min至6小时，动物死亡，并且称量耳朵的穿孔活组织，以确定耳朵的发炎肿胀(也可以测量耳朵厚度以确定肿胀)。收集来自发炎耳朵
的活组织、冷冻保存(用于微阵列分析的样品在-80。C冷冻于TRIzol中)， 并且如下所述(实施例10和12)，随后对l)髓过氧化物酶(MPO)累积量、 其反映发炎嗜中性白细胞累积量；和/或2)利用微阵列技术层组织基因表 达进行分析。来自未处理的老鼠的未发炎的耳朵活组织提供了肿胀、MPO 和基因表达的基线水平。组织炎症也可以使用常规的组织学和免疫组织化 学技术进行研究。
实施例8
在老鼠和大鼠受伤反应中的严重组织反应和炎症
采用重约15-30 g的雄性CBA或NMRI老鼠或重约150-450 g的雄性 Wistar或Sprague-Dawley大鼠(还可以采用其它种类的老鼠和大鼠)。在无 菌条件下使用解剖刀在尾巴末端部分或一个耳朵处实现严重的组织受伤 以及严重的炎症。 一个、两个或三个平行的约5-15mm长的纵向切口穿过 皮肤的所有层。每隔2-24小时将一种或多种试验药物(与他汀(匹伐他汀、 氟伐他汀、洛伐他汀、普伐他汀或者优选地，辛伐他汀、罗苏伐他汀或阿 托伐他汀)组合的吡嘧司特、单独的吡嘧司特和单独的他汀)以0.03至50 mg/kg的剂量通过皮下、静脉内、腹膜内或口服方式给药，其中第一次剂 量是在组织受伤前l分钟至24小时提供的(为了比较， 一些实验在没有药 物的情况下进行)。在给药之前，根据需要将药物的储备溶液(参见上面的 实施例l)在例如水(用于口腔处理)或者盐水(用于肠胃外给药)中0.5%或 1%甲基纤维素中稀释。还可以使用其它媒介物。在受伤后2-48小时，动 物被杀死，并且将组织的受伤部分取出，称量并且冷冻保存(用于微阵列分 析的样品在-80。C冷冻于TRIzol中)，并且如下所述(实施例10和12)，随 后对l)髓过氧化物斷MPO)累积量、其反映发炎嗜中性白细胞累积量；和 /或2)利用微阵列技术的组织基因表达进行分析。来自未治疗动物的相应 的未受伤/未发炎组织提供了 MPO和基因表达的基线水平。对受伤反应的 组织反应和炎症也可以使用常规的组织学和免疫组织化学技术进行研究。实施例9
在大鼠受伤反应中的严重组织反应和炎症
采用重350-500 g的雄性Sprague-Dawley大鼠(但是还可以使用其它种 类的大鼠)。动物被氧中的异氟垸麻醉，并且按如下在左边颈总动脉中实现 严重的组织受伤和严重的炎症在左边颈总动脉、颈外动脉和颈内动脉的 外科暴露和使用临时绷带临时终止局部血液流动之后，使球状导液管(2-法国Fogarty)穿过颈外动脉进入主动脉。接着，用足够的水使球膨胀以使 颈总动脉扩张，然后向后拉到颈外动脉上。该过程重复三次，然后移除导 液管，绑扎颈外动脉并且封闭伤口。将一种或多种试验药物(与他汀(匹伐 他汀、氟伐他汀、洛伐他汀、普伐他汀或者优选地，辛伐他汀、罗苏伐他 汀或阿托伐他汀)组合的吡嘧司特、单独的吡嘧司特和单独的他汀)以0.03 至50mg/kg的剂量在皮下、静脉内、腹膜内或口腔内每隔2-24小时给药， 在组织受伤之前的1分钟至24小时给出第一次剂量(为了比较， 一些实验 在没有药物的情况下进行)。在给药之前，根据需要将药物的储备溶液(参 见上面的实施例l)以例如在水(用于口腔处理)或盐水(用于肠胃外给药)中 的0.5%或1%的甲基纤维素中进行稀释。还可以使用其它媒介物。在受伤 之后2-48小时，动物被氧中的异氟烷麻醉，并且暴露它们的左边颈动脉。 将夹子分别放在颈总动脉和颈内动脉的很接近部分，然后将夹子之间的脉 管轻柔地用无菌盐水和/或TRIzol冲洗、移除、称重，并且冷冻保存(用于 微阵列分析的样品在TRIzol中于-80。C冷冻)，以及如下所述(实施例10 和12)那样，随后对l)反映发炎嗜中性白细胞累积量的髓过氧化物酶(MPO) 累积量和/或2)使用微阵列技术的组织基因表达进行分析。来自未处理大 鼠的相应的未受伤/未发炎的脉管提供了 MPO和基因表达的基线水平。还 可以使用常规的组织学和免疫组织化学技术研究对受伤响应的组织反应 和炎症。
实施例10
组织髓过氧化酶的发炎累积量
酶髓过氧化物酶(MPO)富含于嗜中性白细胞中，通常被用作检测发炎 组织中的嗜中性累积量的指标(marker)。为了确定在发炎的老鼠和大鼠组织中的发炎髓过氧化物酶累积量(如上述实施例5-9中所述)，将组织在
0.5%溴化十六烷基三甲基铵中均匀化，并且解冻。以在由MPO催化的 H202-四甲基联苯胺的氧化还原反应中发生的对650 nm (25。C)的吸光度变 化的方式，光谱学测定上层清液的MPO活性。值以MPO单位/mg组织表
实施例11 平滑肌细胞化验
如前所述分离大鼠主动脉平滑肌细胞(RASMQ(Hedin等，A&n'osc/a T7z画6. F置,飾/" 17， 1977 (1997》。将细胞在Ham培养基F-12中培养 (37°C/5%C02)，生长至融合，通过胰蛋白酶作用连续地传代(passage)，并 且在2-6代之后用于实验，所述Ham培养基补充有10%牛胎儿血清、50 吗/mLL-抗坏血酸、50昭/mL链霉素、50 IU/mL青霉素(F-12/10。/。牛胎儿 血清。将RASMC以F-12/10。/。牛胎儿血清中每个孔约4xl04个细胞的密 度种于24孔板中(还可以使用每个板具有更大量的孔的板以及每个孔具有 适当更少量的细胞的板)。在24小时之后，细胞在Ham培养基F-12中由 于饥饿而在G0/G1阶段(phase)同步24-48小时，所述Ham培养基F-12补 充有0.1。/。牛血清白蛋白(BSA)、 50吗/mLL-抗坏血酸、50吗/mL链霉素和 50 IU/mL青霉素(F-12/0.1。/。 BSA)。为了评估DNA合成，使用10 ng/ml IGF-1或10%牛胎儿血清在12-48小时内剌激饥饿的RASMC (还可以使用 其它良好地确定的促细胞分裂剂比如PDGF)。在刺激之前l分钟至24小 时，添加一种或多种试验药物(与他汀(匹伐他汀、氟伐他汀、洛伐他汀、 普伐他汀或者优选地，辛伐他汀、罗苏伐他汀或阿托伐他汀)组合的吡嘧司 特、单独的吡嘧司特和单独的他汀)(对于关于药物储备溶液和浓度的细 节，参见上述实施例l;还可以与刺激同时添加一种或多种试验药物)。为 了比较， 一些实验在没有药物的情况下进行。在刺激周期结束之前将细胞 用1 ^Ci [3H]-胸(腺嘧啶脱氧核)苷标记8小时。然后将板用冰冷的PBS洗 涤，采用冰冷的10。/。(w/v)三氯乙酸通宵培育，溶解在0.2M氢氧化钠中， 并且在液体闪烁计数器中测量放射性。还可以使用可商购的溴脱氧尿苷 (BrdU)细胞增生化验(例如细胞增生ELISA、 BrdU，来自Roche AppliedScience)、细胞增生试齐U WST-1 (Roche Diagnostics Scandinavia AB ， Bromma，瑞典)(两者都根据生产商说明)或者通过细胞计数分析刺激的 RASMC增生。在单独的实验(为了研究基因表达)，使用同上的10 ng/ml IGF-1或10%牛胎儿血清(或PDGF)或者是使用LPS(l-lOO ng/mL)，使用 1-10%牛胎儿血清(所有刺激物含有和不含同上的一种或多种试验药物)在 4-48小时内刺激更大量饥饿的RASMC(每个孔1-5 x 106细胞)。然后将细 胞收集并且冷冻保存(-80。C)在RLT缓冲液(QIAGEN， Valencia, CA)直至 用于微阵列实验的进一步处理(参见下面的实施例12)。
将人的支气管平滑肌细胞(HBSMC， Promocell， Heidelberg,德国) 在DMEM中培养，所述DMEM补充有10%FBS、 100单位/mL青霉素、 100 )ig/mL链霉素、0.12IU/mL胰岛素，并且含有或者不含2吗/mL两性 霉素B。在实验之前，在低FBS(0.3-5%)、无胰岛素的培养基中阻止细胞 生长24小时。为了刺激发炎的细胞因子和趋化因子比如IL-8和eotaxin 的形成和释放，使用IL-1(3和TNF-a (两者均在1-50 ng/mL)的不同组合， 将HBSMC(在80%融合处，对应约8xl05/25 cm2烧瓶)培育 (37。C/5。/。C02)24-48小时(在含有1-10%牛胎儿血清、具有或者不具有补充 物的DMEM中)。在HBSMC刺激之前，使用一种或多种试验药物(与他汀 组合的吡嘧司特，单独的吡嘧司特和单独的他汀，同上)将细胞培育(在 37°C/5%C02，在含0.3-10%牛胎儿血清、具有或者不具有补充物的DMEM 中)l分钟至24小时(对于关于药物储备溶液和浓度的细节，参见上述实施 例l;还可以与HBSMC刺激同时添加一种或多种试验药物)。为了比较， 一些实验在没有药物的情况下进行。在培育/刺激后，使用可商购的酶免疫 化验试剂盒(EIA/ELISA试剂盒)，根据生产商的说明，量化上层清液中的 人细胞因子和趋化因子的浓度。然后将细胞收集并且冷冻保存(-80。C)在 RLT缓冲液(QIAGEN， Valencia, CA)中，直至用于微阵列实验的进一步 处理(参见下面的实施例12)。
实施例12
基因表达的分析
使用TRIzol (Invitrogen， Carlsbad， CA)，随后使用RNeasy提纯(QIAGEN， Valencia, CA)，根据生产商的规程，分离来自老鼠和大鼠组织 的总RNA (参见实施例5至9、 15和16)。使用或不使用不含无RNase的 DNase组(QIAGEN)的RNeasy Mini Kit (QIAGEN)的情况下，根据生产商 的规程，分离来自在上面和下面的实施例中所述的细胞培育/刺激的总 RNA(老鼠肥大细胞、莫诺美地-6、 PBMC、 PMN、 RAW264.7、 RASMC、 HBSMC、 NB4、 HL-60)。根据不同组织和细胞所来源的物种，使用 GeneChip⑧人类基因组U133 Plus 2.0 Array、 GeneChip 老鼠基因组430 2.0 Array或GeneChip 大鼠基因组230 2.0 Array或这些芯片的相应新版本 (所有阵列来自Affymetrix， Santa Clara, CA)，根据生产商的规程进行微阵 列分析。使用例如基因芯片操作软件(GeneChip Operating Software) (Affymetrix)禾口 Bioconductor/R (www.bioconductor.org)分析，敫阵歹!j表达数 据。还可以使用其它相关软件。
还可以使用人类基因组测量微阵列(Human Genome Survey Microarray)V2.0、老鼠基因组领!j量微阵歹!j(Mouse Genome Survey Microarray) V2.0或大鼠基因组测量微阵列(Rat Genome Survey Microarray)(或者这些 阵列的相应最新版本)，根据来自生产商Applied Biosystems (Foster City， CA)的规程，分析来自不同物种的基因表达。使用例如1700化学发光微 阵列分析仪(Applied Biosystems, Foster City, CA)分析这些微阵列表达数 据，所述分析仪提供有注解(annotation)的Oracle⑧数据库GeneSpring 7.2 (Agilent Technologies, Inc., Palo Alto, CA)禾卩微阵列套件(Microarray Suite) 版本5.0软件(MAS5.0， Affymetrix)。还可以使用其它相关的软件。
还可以使用定量或半定量的PCR分析基因表达(mRNA水平)。可以 使用可商购的酶免疫化验试剂盒(EIA/ELISA试剂盒)(根据来自生产商的 说明)或常规的蛋白质印迹和/或免疫组织化学方法分析在蛋白质水平的基 因表达的分析。
实施例13 细胞增生化验
使用细胞增生试剂WST-1 (Roche Diagnostics Scandinavia AB ， Bmmma，瑞典)或可商购的溴脱氧尿苷(BrdU)细胞增生化验(例如来自Roche Applied Science的细胞增生ELISA、 BrdU)，根据生产商的说明， 测量上述和下述实施例(在上述和下述实施例中添加相应的试验药物和/或 刺激物24-72小时之前，在0.1-5%牛胎儿血清中阻止或不阻止生长24-48 小吋)中刺激和未刺激的老鼠肥大细胞、莫诺美地-6细胞、RAW 264.7细 胞、NB4细胞、HL-60细胞和HBSMC的增生。还可以使用其它常规的细 胞增生试验。
实施例14
血小板聚集试验
使用例如Bertele等(五欲 /尸/2^maco/. 85, 331 (1982))所述的聚集法 (aggregometry)，分析由腺苷二磷酸(ADP)、花生四烯酸、胶原蛋白或血栓 垸类似物U-46619引起的兔子或人血小板(在富含血小板的血浆或者全血 中)的聚集。还可以使用经洗涤的人或兔子血小板和/或使用其它己建立的 用于测量血小板聚集的聚集法或其它相应方法分析诱导(同上)的血小板聚 集。在诱导血小板聚集之前1-120分钟，添加一种或多种试验药物(与他汀 (匹伐他汀、氟伐他汀、洛伐他汀、普伐他汀或者优选地，辛伐他汀、罗苏 伐他汀或阿托伐他汀)组合的吡嘧司特、单独的吡嘧司特和单独的他汀)(对 于关于药物储备溶液和浓度的细节，参见上述实施例1;还可以在诱导血 小板聚集的同时添加一种或多种试验药物)。为了比较， 一些实验在没有药 物的情况下进行。
实施例15
老鼠腹膜炎症-由酵母聚糖和其它刺激物引起
该化验基本上根据由Rao等(J尸/7awwco/.五;c; . T7zw 269， 917(1994))
所述的化验(但是也可以使用其它种类的老鼠)。每隔2-24小时将一种或多 种试验药物(与他汀(匹伐他汀、氟伐他汀、洛伐他汀、普伐他汀或者优选 地，辛伐他汀、罗苏伐他汀或阿托伐他汀)组合的吡嘧司特、单独的吡嘧司 特和单独的他汀)以0.03至50mg/kg的剂量通过皮下、静脉内、腹膜内或 口服方式对动物给药(为了比较， 一些实验在没有药物的情况下进行)。在 给药之前，根据需要将药物的储备溶液(参见上面的实施例l)在例如水(用于口腔治疗)或者盐水(用于肠胃外给药)中0.5%或1%甲基纤维素中稀释。
还可以使用其它媒介物。在第一次药物剂量后1分钟至24小时，将0.5-1 mL无菌PBS中的0.5-2 mg酵母聚糖A(Sigma，目录编号Z4250)(超声并 且混合良好)注射到腹膜内(代替使用酵母聚糖A的是，还可以通过腹膜内 注射发炎前浓度的其它建立好的发炎前刺激物比如抗老鼠IgE(使用或不 使用老鼠IgE进行1-3天腹膜内预治疗)、伴刀豆球蛋白A、角叉菜胶、朊 间质胨(proteosepeptone)、 LPS、 PMA、巯基乙酸盐、花生四烯酸、fMLP、 TNF、 IL-ip)(—种或多种试验药物还可以与酵母聚糖或其它发炎前刺激物 的腹膜内注射同时给药)引起腹膜炎症。在注射酵母聚糖(或一种或多种其 它发炎前刺激物)之后2-24小时，动物死亡。然后使用l-3mL灌洗缓冲液 (含或不含3-5 mM EDTA或5-10单位/mL肝素的冰冷PBS)冲洗腹膜腔。 在灌洗液中的总白细胞计数和分化白细胞计数在被Tiirk溶液染色之后采 用血球计进行和/或在分别用May-Gmnwald Giemsa或改性的Wright (Diff-Quik)染色剂染色的细胞离心涂片(cytospin)制剂中，通过使用标准形 貌标准的光学显微镜进行。还可以使用用于测定总白细胞计数和分化白细 胞计数的其它已确立的方法。将其余灌洗液离心(300-3000 x g， 4°C， 3-10 min)，并且将无细胞的灌洗液上层清液冷冻保存(-20。C至-80。)，直至分析 发炎介体LTB4、 PGE2、 TXB2的含量和/或如上面实施例1和4中所述的 老鼠细胞因子/趋化因子(例如IL-4、 IL-6、 TNF、 IL-ip、 KC、 MCP-1、 IL-IO、 IL-12p70、 IFN力的含量。通过使用可商购的组胺酶免疫化验试剂盒 (EIA/ELISA试剂盒)，根据来自生产商的说明确定灌洗液上层清液中的组 胺含量。还可以通过使用实施例3中所述的P-氨基已糖苷酶化验测量灌洗 液中的(3-氨基已糖苷酶活性，以研究发炎腹膜细胞激活。将灌洗液的细胞 血小板重新悬浮在具有0.5% HTAB的0.1-1.0 mL 0.05 M KHP04 pH 6.0中 并且冷冻保存(-20。C至-80。)，直至如Rao等(乂尸/wrmaco/. Exr; . 77^. 269, 917-25 (1994))所述的髓过氧化物酶(MPO)含量的分析。将来自单独的动物 的相同细胞血小板冷冻保存(-80。C)在RLT缓冲液(QIAGEN， Valencia, CA) 中，直至用于微阵列实验的进一步处理(参见实施例12)。在采用灌洗缓冲 液冲洗腹膜腔时，将来自发炎的腹膜腔的组织(腹膜壁、肠和/或其它腹膜 内或外器官/组织)活体收集、称重、冷冻保存(用于微阵列分析的样品在-80。C下冷冻在TRIzol， Invitrogen, Carlsbad, CA中)，并且如实施例12 所述，随后对使用微阵列技术的组织基因表达进行分析。来自未治疗的动 物的未发炎的腹膜腔提供MPO、发炎介体、细胞因子/趋化因子和基因表 达的基线水平。还可以使用常规的组织学和免疫组织化学技术研究组织炎 症。
实施例16
大鼠腹膜炎症-由酵母聚糖和其它刺激物引起
采用重约150-450 g的雄性Wistar或Sprague Dawley大鼠。每隔2-24
小时将一种或多种试验药物(与他汀(匹伐他汀、氟伐他汀、洛伐他汀、普 伐他汀或者优选地，辛伐他汀、罗苏伐他汀或阿托伐他汀)组合的吡嘧司特、 单独的吡嘧司特和单独的他汀)以0.03至50 mg/kg的剂量通过皮下、静脉 内、腹膜内或口服方式对动物给药(为了比较， 一些实验在没有药物的情况 下进行)。在给药之前，根据需要将药物的储备溶液(参见上面的实施例1) 在例如水(用于口腔治疗)或者盐水(用于肠胃外给药)中0.5%或1%甲基纤 维素中稀释。还可以使用其它媒介物。在第一次药物剂量后1分钟至24 小时，将1-10 mL无菌PBS中的1-100 mg酵母聚糖A(Sigma，目录编号 Z4250)(超声并且混合良好)注射到腹膜内(代替使用酵母聚糖A的是，还 可以通过腹膜内注射发炎前浓度的其它建立好的发炎前刺激物比如抗鼠 IgE(使用或不使用大鼠IgE进行l-3天腹膜内预治疗)、伴刀豆球蛋白A、 蛋白质L、化合物48/80、角叉菜胶、朊间质胨、LPS、 PMA、巯基乙酸 盐、花生四烯酸、fMLP、 TNF、 IL-ip引起腹膜炎症。 一种或多种试验药 物还可以与酵母聚糖或其它发炎前刺激物的腹膜内注射同时给药)。在注射 酵母聚糖(或一种或多种其它发炎前刺激物)之后2-24小时，动物死亡。然 后使用10-20 ml灌洗缓冲液(含或不含3-5 mM EDTA或5-10单位/mL肝 素的冰冷PBS)冲洗腹膜腔。在灌洗液中的总白细胞计数和分化白细胞计 数在被Tiirk溶液染色之后采用血球计进行和/或在分别用May-Grunwald Giemsa或改性的Wright (Diff-Quik)染色剂染色的细胞离心涂片制剂中，通
过使用标准形貌标准的光显微镜进行。还可以使用用于测定总白细胞计数 和分化白细胞计数的其它已确立的方法。将其余灌洗液离心(300-3000 x g，4。C， 3-10 min)，并且将无细胞的灌洗液上层清液冷冻保存(-20。C至-80°)， 直至分析发炎介体LTB4、PGE2、TXB2的含量和/或基本上如上面实施例1 和4中所述的大鼠细胞因子/趋化因子(例如IL-4、 IL-6、 TNF、 IL-1|3、 KC、 MCP-1、 IL-IO、 IL-12p70、 IFN力含量。通过使用可商购的组胺酶免疫化 验试剂盒(EIA/ELISA试剂盒)，根据来自生产商的说明确定灌洗液上层清 液中的组胺含量。还可以通过使用实施例3中所述的P-氨基己糖苷酶化验 测量灌洗液中的(3-氨基己糖苷酶活性，以研究发炎腹膜细胞激活。将灌洗 液的细胞血小板重新悬浮在具有0.5% HTAB的0.1-1.0 mL 0.05 M KHP04 pH 6.0中并且冷冻保存(-20。C至-80。)，直至如Rao等(j:尸/z"rmaco/.五jc/ . 77^. 269， 917-25 (1994))所述的髓过氧化物酶(MPO)含量的分析。将来自 单独的动物的相同细胞血小板冷冻保存(-80。C)在RLT缓冲液(QIAGEN， Valencia, CA)中，直至用于微阵列实验的进一步处理(参见实施例12)。在 采用灌洗缓冲液冲洗腹膜腔时，将来自发炎的腹膜腔的组织(腹膜壁、肠和 /或其它腹膜内或外器官/组织)活体收集、称重、冷冻保存(用于微阵列分析 的样品在-80。C冷冻在TRIzol， Invitrogen， Carlsbad, CA中)，并且如实 施例12所述，随后对使用微阵列技术的组织基因表达进行分析。来自未 治疗的动物的未发炎的腹膜腔提供MPO、发炎介体、细胞因子/趋化因子 和基因表达的基线水平。还可以使用常规的组织学和免疫组织化学技术研 究组织炎症。
实施例17
NB4和HL-60细胞发炎介体释放化验
将人的NB4细胞(Lanotte等，说ooA 77， 1080 (1991 ))在RPMI-1640 培养基中培养(37。C/5y。C02)，所述培养基补充有100单位/mL青霉素、 100吗/mL链霉素和10% (体积/体积)牛胎儿血清。为了分化，通常每隔3 天添加1-5 pM全反式视黄酸(ATRA)。
将人的HL-60细胞(Steinhilber等，S/Oc/w'm. Jcto 1178， 1
(1993))在RPMI-1640培养基中培养(37。C/5。/。C02)，所述培养基补充有100 单位/mL青霉素、100吗/mL链霉素和10-20% (体积/体积)牛胎儿血清。为 了分化，通常添加ATRA(l-5 iliM)、 DMSO(l-2%)、 PMA(100-500 ng/mL)或维他命D3 (1-15 pM) 5天。
为了刺激发炎介体白细胞三烯B4(LTB4)的形成和释放，使用10-40 fiM 花生四烯酸和2-10 pM钙离子载体A23187，将分化或未分化的NB4或 HL-60细胞(在l-15xl()6/mL)培育5-30分钟(在37°C，在含钙的PBS中)。 还可以在有或没有上述的A23187和/或花生四烯酸的情况下，利用经证明 的生物活性浓度的腺苷二磷酸(ADP)、 fMLP和/或血栓垸类似物U-46619 刺激NB4和HL-60细胞。上述NB4和HL-60培育/刺激也可以在人血小 板(来自健康捐赠者血液)的存在下进行，其中NB4/HL-60:血小板比率为 1:10至1:10000。使用1 mL的冷甲醇和作为内标添加的前列腺素B2停止 培育/刺激。将样品离心，并且用水稀释上层清液，以达到30%的最终甲 醇浓度，并且将pH调节至3-4。在预调节的(lmL甲醇，随后是lmLH20) C18固相柱子(SorbentTechnology,英国)上萃取上层清液中的花生四烯酸 代谢产物。使用甲醇洗脱代谢产物，之后将l体积的水添加到洗出液中。 对于反相HPLC，将76 的每一种样品与39 |iLH20混合(还可以使用其 它体积比)。使用甲醇/乙腈/H2O/乙酸(30:35:35:0.01体积/体积)以1.2 mL/min洗脱Waters RCM 8x10柱子。在270 nm监测洗出液的吸光度以检 测并且量化PGB2和LTB4。还可以根据来自试剂盒生产商的说明使用用于 测量LTB4的可商购酶免疫化验试剂盒(EIA/ELISA试剂盒)。使用可商购酶 免疫化验试剂盒(EIA/ELISA试剂盒)，根据来自生产商的说明，还可以分 析来自上述NB4/HL-60培育/刺激的上层清液的发炎介体前列腺素 E2(PGE2)禾卩/或血栓垸B2(TXB2)的含量。在用于发炎介体释放的NB4或 HL-60刺激之前，使用一种或多种试验药物(与他汀(匹伐他汀、氟伐他汀、 洛伐他汀、普伐他汀或者优选地，辛伐他汀、罗苏伐他汀或阿托伐他汀) 组合的吡嘧司特，单独的吡嘧司特和单独的他汀)将细胞培育(在37。C,具 有或者不具有补充物的情况下，在不含钙的PBS中，或者在含1-10%牛胎 儿血清的RPMI-1640中)l分钟至24小时(对于关于药物储备溶液和浓度的 细节，参见上述实施例1)。(还可以与NB4/HL-60刺激同时添加一种或多 种试验药物)。为了比较， 一些实验在没有药物的情况下进行。
为了剌激发炎细胞因子、趋化因子和介体比如IL-l(3、IL-6、TNF、IL-8、 IL-IO、 IL-12p70、 MCP-1、 PAF、 C5a的形成和释放，使用脂多糖(LPSl-100ng/mL)、佛波醇-12-肉豆蔻酸酯-13-乙酸酯(PMA 1-100 ng/mL)、或钙 离子载体A23187 (l-10iaM)或这些刺激物的组合，将分化或未分化的NB4 或HL-60细胞(在l-10xl06/mL)培育(37。C/5。/。CO2)4-24小时(在具有1-10% 牛胎儿血清、具有或者不具有补充物的RPMI-1640中)。还可以在有或没 有上述的LPS、 PMA禾Q/或A23187的情况下，利用经证明的生物活性浓 度的腺苷二磷酸(ADP)禾卩/或血栓垸类似物U-46619刺激NB4和HL-60细 胞。NB4和HL-60培育/刺激也可以在人血小板(来自健康捐赠者血液)的存 在下进行，其中NB4/HL-60:血小板比率为1:10至1:10000。在用于细胞因 子/趋化因子/介体释放的NB4或HL-60刺激之前，使用一种或多种试验 药物(与他汀组合的吡嘧司特，单独的吡嘧司特和单独的他汀，同上)将细 胞培育(在37°C/5%C02，在含1-10%牛胎儿血清、具有或者不具有补充物 的RPMI-1640中)l分钟至24小时(为了比较， 一些实验在没有药物的情 况下进行；还可以与NB4/HL-60刺激同时添加一种或多种试验药物)。在 离心分离出细胞之后，使用Cytometric Bead Array(美国圣地亚哥的BD Biosciences Pharmingen)，根据生产商的说明，量化上层清液中的人细胞因
子/趋化因子和介体浓度。还可以根据生产商的说明使用用于测量细胞因子 /趋化因子和介体的可商购酶免疫化验试剂盒(EIA/ELISA试剂盒)。将细胞 血小板冷冻保存(-80。C)在RLT缓冲液(QIAGEN， Valencia, CA)中，直至 用于微阵列实验的进一步处理(参见上面的实施例12)。
除研究上述药物对来自类似嗜中性粒细胞的NB4和HL-60细胞的 介体和趋化因子/细胞因子的释放的影响以外，还可以分析药物对这些细胞 的自发或受激的粘附和/或迁移的影响(还可以使用根据标准规程分离的刚 分离的人类血液多形核细胞(PMN))。使用良好地建立并且经证明的实验方 法和化验，研究PMN或类似嗜中性粒细胞的细胞对例如培养的内皮细胞 或蛋白质包覆的人造表面的自发或受激(使用fMLP、 IL-8、 PAF、 LTB4或
其它相关的PMN激活因子)的粘附。使用良好地建立并且经证明的实验方 法和化验，研究PMN或类似嗜中性粒细胞的细胞的迁移(受到fMLP、IL-8、 PAF、 LTB4或其它相关的PMN趋化因子刺激)，例如通过被设计用于这 种迁移研究的可商购的蛋白质包覆的膜的迁移。实施例18
在人全血中的血小板和白细胞激活
使用含有1/10体积的129 mM柠檬酸三钠(Becton Dickinson, Meylan， 法国)的硅化真空采血管，通过没有郁积的静脉穿剌收集静脉血液。使用基 本上如前所述的流动血细胞计数化验(参见例如用于参考的Li等， Cz)tm/加'w7 100， 1374 (1999))测量全血血小板P-选择蛋白表达(反应血小板 活性)、白细胞CDllb表达(反应白细胞活性)、单个血小板和血小板-血小 板微聚集体计数，以及血小板-白细胞聚集体(PLA)。简言之，在没有或有 血小板激活刺激物比如腺苷二磷酸(ADP)、 U-46619、 U-44069、血小板激 活因子(PAF)、花生四烯酸、胶原蛋白或凝血酶和/或白细胞激活刺激物比 如N-甲酰基-甲二磺酰基-亮氨酰基-苯基丙氨酸(fMLP)、花生四烯酸、PAF、 LPS、 A23187或LTB4的情况下，将5 全血等分试样添加到45 pL含有 适当稀释的抗体(参见下面)的Hepes缓冲盐水(150 mMNaCl、 5 mMKCl、 1 mM MgS04、 10 mM Hepes、 pH 7.4)中。在将血液暴露于血小板和/或白 细胞激活剌激物+抗体之前，使用一种或多种试验药物(与他汀(匹伐他汀、 氟伐他汀、洛伐他汀、普伐他汀或者优选地，辛伐他汀、罗苏伐他汀或阿 托伐他汀)组合的吡嘧司特、单独的吡嘧司特和单独的他汀)将血液样品 (0.1-1 ml)培育l-60分钟(还可以与上述刺激物同时添加一种或多种试验药 物)。为了比较，在不暴露于药物中的情况下如上述那样刺激一些血液样品。 通过R-藻红蛋白(RPE)-CD62P单克隆抗体(MAb) AC1.2 (美国加利福尼亚 州圣何塞的BectonDickinson)确定血小板P选择蛋白表达。通过荧光素异 硫氰酸酯(FITC)-共轭的MAbBEARl (Immunotech， Marseille,法国)确定 白细胞CDllb表达。使用FITC和RPE共轭的同型MAb作为负控制。用 于血小板计数的荧光珠子(SPHEROTM Rainbow粒子，1.8-2.2 ium)来自 PharMingen (美国加利福尼亚州圣地亚哥)。使用FITC共轭的抗 -CD42a(GPIX)MAb Beb 1 (Becton Dickinson)识别血小板，并且使用RPE 共轭的抗CD45MAbJ33(Immunotech)识别白细胞。在黑暗中，在室温下
将样品(含或不含剌激物的药物治疗或未治疗的血液+抗体，同上)培育20 min。然后，使用0.5%(体积/体积)甲醛盐水将样品稀释并且温和地固定， 并且使用Beckman-Coulter EPICS XL-MCL流动细胞计(Beckman-CoulterCorp.， Hialeah， FL)分析各种血小板和白细胞参数。血小板P-选择蛋白表 达数据以血小板种群中的P-选择蛋白正性细胞的百分比和以P-选择蛋白 正性血小板的绝对计数的形式报告。白细胞CDllb表达以总的白细胞种 群和白细胞亚种群的平均荧光强度(MFI)的形式报告。血小板-白细胞聚集 体(PLA)以在总的白细胞种群中和在淋巴细胞、单核细胞和嗜中性粒细胞 之中的血小板-共轭的白细胞的绝对计数和百分比的形式表示。还可以使用 其它相关的测量人全血中相应的血小板和白细胞激活的试剂、实验条件/ 方法、分析设备和方式。
实施例19
通过吡嘧司特和罗苏伐他汀抑制肥大细胞干扰素-Y的形成
通过培养来自雌性C57BL/6老鼠的骨髓细胞获得由骨髓得到的经培 养的老鼠肥大细胞(mMC)。将骨髓细胞(来自用PBS冲洗的老鼠大腿骨)在 富含10% X-63的经调节的RPMI 1640中培养(37。C/5。/。C02)，所述RPMI 1640补充有10%的热减活的牛胎儿血清、4 mM L-谷氨酰胺、50 pM 2-巯 基乙醇、lmM丙酮酸钠、0.1 mM非必需的氨基酸、10mMHepe、 100单 位/mL青霉素和100 pg/mL链霉素。通过甲苯胺蓝染色以证实肥大细胞的 发展。在培养6至8周之后进行实验。为了通过细胞表面IgE-受体的交联 激活mMC，首先使用作为15%杂交瘤上层清液形式使用的单克隆老鼠抗 -TNP IgE-抗体(IgEl-b4， ATCC， Rockville， MD，美国)在37。C (5%C02) 将培养的mMC在敏化90分钟。然后将细胞用PBS进行两次洗涤，并且 在细胞(0.5 mL含lx106细胞/mL的培养基)通过添加偶联比率为9/1(最终 的TNP-BSA浓度为100 ng/mL)的TNP-BSA (Biosearch Technologies, San Francisco, CA)被激活之前，重新悬浮在补充有0.2%牛血清白蛋白(BSA) 的RPMI-1640培养基中。使用TNP-BSA培育(37。C/5。/。C02) 24小时。在 使用TNP-BSA培育之前，使用试验药物吡嘧司特(钾盐，购自美国加利福 尼亚州圣地亚哥的American Custom Chemicals Corporation)和/或罗苏伐他 汀(如Bioorganic & Medicinal Chemistry,第5巻，第5期，第437-444页， 1997所述，通过添加CaCl2从可商购的Crestor⑧片剂提取并且纯化，并且 以钙盐的形式分离)处理/培育(37。C/5。/。C02)—些细胞30分钟，之后添加TNP-BSA(在无菌盐水中制备药物的储备溶液)。为了比较， 一些实验在没
有药物的情况下进行。在使用TNP-BSA培育之后，将样品在4°C离心以 离心分离出细胞，并且使用来自美国圣地亚哥的BD Biosciences Pharmingen的BDTM Cytometric Bead Array (CBA) Mouse Inflammation Kit (根据生产商说明使用该试剂盒)分析上层清液的老鼠的IFN，的含量。
来自用TNP-BSA刺激24小时(同上)的未治疗的mMC的上层清液中 的IFN-y浓度为1.80 ± 0,24 pg/mL(平均值士sem， n=8)。采用3岸吡嘧司 特、30 吡嘧司特、3pM罗苏伐他汀或30pM罗苏伐他汀(对于每一 种治疗，11=2)治疗的细胞的相应平均IFN-y值分别为2.00 pg/mL、 1.74 pg/mL、 2.26 pg/mL和1.88 pg/mL。因此，单独使用这些浓度的吡嘧司特 或罗苏伐他汀的治疗不抑制IFN-y水平(即，与未治疗细胞相比，30 pM吡 嘧司特降低IFN-y约3。/。，而其它三种治疗略微增加IFN-力。吡嘧司特+罗 苏伐他汀的组合剂量依赖性地并且协同地降低IFN-y水平。因此，采用3 pM 吡嘧司特+ 3pM罗苏伐他汀或30 pM吡嘧司特+ 30 pM罗苏伐他汀 的组合(对于每一种治疗，11=2)治疗的mMC的平均IFN-y浓度分别为1.58 pg/mL和0.55 pg/mL(即与未治疗对照相比，分别抑制12.3%和69.4%)。
实施例20
通过吡嘧司特和罗苏伐他汀抑制巨噬细胞增生
在RPMI-1640培养基中培养(37。C/5。/。C02)来自人的巨噬细胞细胞系 莫诺美地-6(MM6) (Ziegler-He池rock等，Ca"cw， 41， 456 (1988))细 胞，该RPMI-1640培养基补充有1 mM丙酮酸钠、lx非必需的氨基酸、1-100 昭/mL胰岛素、1 mM草乙酸、100单位/mL青霉素、100吗/mL链霉素 和10% (体积/体积)牛胎儿血清。在开始实验时，在密度为lxl()S细胞/mL (100 pl/孔)的96-孔板中种入MM6细胞的种子。使用细胞增生试剂 WST-l(Roche Diagnostics Scandinavia AB， Bromma，瑞典)或通过使用显微 镜的细胞计数测量MM6细胞的增生。将WST-1试剂设计为用于增生化 验中例如细胞生长的分光光度定量化，并且根据生产商的说明使用。用于 测量吸光度的波长为450nm并且暴露于WST-1试剂中的所有未治疗的对 照细胞的吸光度在1.0至2.5之间。吡嘧司特(钾盐；参见上述实施例19)和罗苏伐他汀(钠盐；参见上述实施例19)的储备溶液是以无菌盐水的形式 制备的。
在24和48小时之后，未治疗的MM6细胞从开始实验时的^105细 胞/mL分别增加至1.4x105 ± 0.06xl()5细胞/mL和2.3x105 ± 0.10乂105细胞 /mL(平均值士sem，对于三个时间点的每一个，n=4)。在使用上述WST-1 试剂开始实验之后48小时，研究吡嘧司特和/或罗苏伐他汀(在开始实验时 添加)对MM6细胞增生的影响。
使用最终浓度为10 pM、 30 |iM或100 的罗苏伐他汀治疗MM6 细胞分别导致剂量依赖性的16.6%、 22.7%和66.9%的MM6增生抑制(平 均值，对于每一种浓度，n=5)。相反，使用最终浓度为100 pM的吡嘧司 特治疗MM6细胞导致不可忽略的平均9.4%的增生抑制(11=5) (10 的吡 嘧司特具有与100 pM的吡嘧司特的效果很类似的效果，n=5，数据未显 示)。当在10 pM、 30 |iM或100 pM罗苏伐他汀的存在下使用100 pM吡 嘧司特治疗MM6细胞时，与分别单独使用10 (iM、 30 fiM和100 pM的 罗苏伐他汀的治疗相比，100 pM吡嘧司特分别导致协同的17.4%、 26.3% 和44.9。/。的MM6增生抑制(平均值，对于三种组合的每一种，n=5)。
实施例21
用吡嘧司特和阿托伐他汀抑制巨噬细胞增生
对于阿托伐他汀(钠盐；从印度Bangalore的Biocon， Ltd.接受的赠品阿 托伐他汀l丐通过以下方法转化为钠盐首先通过添加盐酸水溶液将钙盐转 化为游离酸，然后在通过萃取分离之后，添加1当量的N.aOH水溶液)， 重复实施例20中所述的步骤。
使用最终浓度为10 pM、 30 pM或100 pM的阿托伐他汀治疗MM6 细胞分别导致剂量依赖性的19.9%、 27,0%和54,4%的MM6增生抑制(平 均值，对于每一种浓度，n=5)。相反，使用最终浓度为100 pM的吡嘧司 特(钾盐)治疗MM6细胞导致不可忽略的平均9.4%的增生抑制(11=5) (10 )LiM的吡嘧司特具有与100jaM的吡嘧司特的效果很类似的效果，n=5，数 据未显示)。当在100 jiM阿托伐他汀的存在下使用100 MM吡嘧司特治疗 MM6细胞时，与单独使用100nM阿托伐他汀的治疗相比，100 |iM吡嘧司特导致协同的30.2。/。的MM6增生抑制(平均值，n=5)。在30 pM阿托伐 他汀的存在下，100 pM吡嘧司特抑制7.6%的增生(平均值，n=5)，而在 10 pM阿托伐他汀的存在下，100 pM吡嘧司特不抑制增生(11=5，数据未 显示)。
实施例22
通过吡嘧司特和阿托伐他汀抑制老鼠的由酵母聚糖引起的腹膜炎
将5组5-7只重32-37 g的远亲繁殖的雄性NMRI老鼠(Scanbur AB， Sollentuna，瑞典)用来研究由0.5 mL无菌PBS中的l mg酵母聚糖A(酵 母聚糖，Sigma-Aldrich)(超声并且充分混合)的腹膜内(i.p.)注射引起的腹膜 炎症(腹膜炎)。在酵母聚糖i.p.注射之前的24小时和90分钟，使用0.35 mg 阿托伐他汀钠(参见上述实施例21)治疗两组动物。在将酵母聚糖i.p.给药 之前24小时，进行阿托伐他汀注射，并且在皮下注射酵母聚糖之前90分 钟进行阿托伐他汀注射。在注射之前，根据需要釆用超声和加热将阿托伐 他汀以l mg/mL溶解在无菌PBS中。使用与酵母聚糖一起腹膜内给药的 0.5mg吡嘧司特(钾盐，购自美国加利福尼亚州圣地亚哥的American Custom Chemicals Corporation)(即，吡嘧司特以1 mg/mL溶解在PBS溶液 的2 mg/mL酵母聚糖中)治疗两组动物(其中一组已经采用上述阿托伐他 汀预先治疗)。
在注射酵母聚糖后5小时，动物死亡，并且使用含有3mMEDTA的 1.5 mL冰冷PBS灌洗发炎的腹膜腔(在灌洗液的i.p.注射之后，轻柔地按摩 腹部30秒，之后打开腹腔并且收集约1 mL液体)。在使用Ttirk溶液对核 染色之后，按每mL灌洗液计的多形核(PMN)白细胞数量用光学显微镜计 数(采用标准形貌标准)。来自未治疗动物的未发炎的腹膜腔的灌洗液提供 了 PMN白细胞的基线水平。
如图l(平均值土sem)中所示，未用酵母聚糖i.p.刺激的动物(基线，n=5) 几乎没有腹膜PMN白细胞。另一方面，在酵母聚糖i.p.注射之后5小时， 未用吡嘧司特或阿托伐他汀治疗的动物(未治疗，11=7)的腹膜腔中有显著的 PMN白细胞发炎累积量。
在单独采用吡嘧司特(Pemiro，『6)治疗的动物中，酵母聚糖引起的PMN白细胞累积量略微降低(降低10.1%;在该组中的NB，即一种动物被 认为无反应，并且从分析中排除)。在这种动物中，在酵母聚糖注射后5
小时的PMN白细胞累积量仅为采用i.p.酵母聚糖刺激的其它6只吡嘧司特 治疗的动物的平均PMN白细胞累积量的8.4%。在分析中包括或排除这种 无反应动物不改变下述结论)。
在单独采用阿托伐他汀(Atorva，『5)治疗的动物中，PMN白细胞累 积量也降低至一定程度(降低25.9 %)。
然而，在同时采用吡嘧司特和阿托伐他汀(Pemiro+Atorva，『5)治疗 的动物中，酵母聚糖诱导的PMN白细胞累积量协同地降低61.5e/。。因此， 尽管与未治疗动物相比，单独采用吡嘧司特的治疗仅仅使酵母聚糖引起的 PMN白细胞累积量降低10.1%，但是与单独采用阿托伐他汀的治疗相比， 在阿托伐他汀治疗的存在下采用吡嘧司特治疗的动物的酵母聚糖所引起 的PMN白细胞累积量降低48.0%。
上述实施例中的一个或多个证明吡嘧司特和相关他汀(匹伐他汀、氟 伐他汀、洛伐他汀、普伐他汀或者优选地，辛伐他汀、罗苏伐他汀或阿托 伐他汀)组合具有明显协同效应。因此，这样的组合可能对包括动脉粥样硬 化症和相关疾病在内的炎症的治疗有用。
权利要求
1.一种组合产品，其包含(a)吡嘧司特或其药学可接受的盐或者溶剂化物；和(b)他汀或其药学可接受的盐或者溶剂化物。
2. 如权利要求l所述的组合产品，其中所述他汀选自匹伐他汀、氟伐 他汀、辛伐他汀、洛伐他汀、罗苏伐他汀、普伐他汀和阿托伐他汀。
3. 如权利要求2所述的组合产品，其中所述他汀选自辛伐他汀、罗苏 伐他汀和阿托伐他汀。
4. 如权利要求3所述的组合产品，其中所述他汀选自罗苏伐他汀和阿 托伐他汀。
5. 如在前权利要求中任一项所述的组合产品，所述组合产品包括药物 制剂，所述药物制剂包含吡嘧司特或其药学可接受的盐或者溶剂化物； 他汀或其药学可接受的盐或者溶剂化物；以及药学可接受的助剂、稀释剂 或载体。
6. 如权利要求1至4中任一项所述的组合产品，所述组合产品包括包含如下组分的多部分的试剂盒(A) 药物制剂，其包含与药学可接受的助剂、稀释剂或载体混合的吡 嘧司特或其药学可接受的盐或者溶剂化物；以及(B) 药物制剂，其包含与药学可接受的助剂、稀释剂或载体混合的他汀 或其药学可接受的盐或者溶剂化物，所述组分(A)和(B)各自是以适于彼此结合给药的形式提供的。
7. —种制备如权利要求6所述的多部分的试剂盒的方法，所述方法包 括使组分(A)与组分(B)结合，从而使两种组分适于相互结合给药。
8. —种多部分的试剂盒，其包含 (I)如权利要求6所述的组分(A)和(B)中的一种；以及(n)将两种组分中的组分彼此结合使用的说明。
9. 如权利要求1至6中任一项或8所述的组合产品，其中所述他汀不 是以他汀内酯形式使用。
10. 如权利要求1至6中任一项或8所述的组合产品，其中所使用的他汀是洛伐他汀内酯或辛伐他汀内酯。
11. 如权利要求6、权利要求8或权利要求9或权利要求10 (从属于权 利要求6或权利要求8)中任一项所述的多部分的试剂盒，其中所述组分(A) 和(B)适于连续、单独和/或同时用于治疗炎症。
12. 如权利要求1至6或8至11中任一项所述的组合产品用于制备治 疗炎症的药物的用途。
13. —种治疗炎症的方法，所述方法包括将如权利要求1至6或8至 11中任一项所述的组合产品对需要这种治疗的患者给药。
14. 如权利要求11所述的多部分的试剂盒、如权利要求12所述的用 途、或如权利要求13所述的方法，其中所述病症选自偏头痛、哮喘、慢 性阻塞性肺病、局限性回肠炎、多发性硬化症、牛皮癣、类风湿性关节炎、 全身性红斑狼疮或溃疡性结肠炎。
15. 如权利要求11所述的多部分的试剂盒、如权利要求12所述的用 途、或如权利要求13所述的方法，其中所述病症是动脉粥样硬化症或相 关的心血管病症。
16. 如权利要求15所述的多部分的试剂盒、用途和方法，其中所述病 症是动脉粥样硬化症。
17. 如权利要求15所述的多部分的试剂盒、用途和方法，其中所述与 动脉粥样硬化症相关的心血管病症选自主动脉瘤、动脉硬化、末梢动脉阻 塞性疾病、冠状动脉病、冠心病、动脉粥样斑破裂、粉瘤破裂和/或不稳定、 脉管疾病、动脉疾病、缺血性疾病、局部缺血和中风。
18. 如权利要求17所述的多部分的试剂盒、用途和方法，其中所述冠 状动脉病选自心绞痛、心肌梗死和心脏病发作。
19. 如权利要求17所述的多部分的试剂盒、用途和方法，其中所述冠 心病选自心脏病和心脏疾病。
20. 如权利要求17所述的多部分的试剂盒、用途和方法，其中所述中 风选自脑血管意外和瞬间局部缺血性发作。
21. 如权利要求11至20中任一项所述的多部分的试剂盒、用途或方 法，其中所述患者具有严重的冠状综合症。
全文摘要
本发明提供组合产品，其包含(a)吡嘧司特或其药学可接受的盐或者溶剂化物；和(b)他汀或其药学可接受的盐或者溶剂化物。这些组合产品找到了治疗动脉硬化症和相关疾病方面的特殊用途。
文档编号A61K31/40GK101610765SQ200780051473
公开日2009年12月23日 申请日期2007年11月16日 优先权日2006年12月18日
发明者约翰·劳德 申请人:卡多兹公司