用于早期检测潜在炎症特别是与移植物的排斥、神经变性病症或抑郁症有关的潜在炎症 ...的制作方法
【专利说明】用于早期检测潜在炎症特别是与移植物的排斥、神经变性病症或抑郁症有关的潜在炎症的体外方法
[0001]本发明涉及诊断领域。由于医药在疾病的治疗中实现了重大的进步，特别是通过将身体或器官的一部分用源自外部来源的部分取代来替换，现代医学治疗影响着越来越多的人。当身体特别是器官的一部分不能适宜发挥功能时，可以移植器官或通过人工元件替换身体的部分例如植入的牙。这类治疗经常引起身体的应答，其经常以炎症开始且可能最终导致移植物排斥。
[0002]EP 2 284 540A1披露了一种诊断器官衰竭的方法。该衰竭可能是炎症相关的(败血症)O所述方法描述了利用定量代谢组学概况(metabolomics profile)并将结果与一定量的内源代谢物的定量参照代谢组学概况比较。这背后的想法似乎是检测由于感染/败血症所致的器官衰竭。在该申请中，没有提到关于移植、排斥及其在唾液中的模式。
[0003]然而，本发明公开了一种检测和诊断早期炎症的方法。该方法描述了利用定量代谢组学概况并将结果与定量参照比较。这背后的想法似乎是从检测先天免疫应答的激活的意义上来检测早期炎性应答。该激活独特地见于几种疾病中，特别是在早期。这是在病原体或称为报警物(alarmin)的分子上的反应且导致炎性体(infIammasome)的激活。下一步是在至少6至7天后激活适应性免疫应答。
[0004]当植入物并非源自同一身体时，人体识别身体内植入的元件为不相容的。因此，必须仔细检查外来植入物和受体的相容性并小心监测可能的排斥作用。当移植实体器官如心脏、肝、肺、胰或肾时，通常可通过用药物适宜处理来下调受体身体的排斥作用。然而，不想要的副作用是，身体对移植物的应答下调经常同时导致免疫应答的下调。
[0005]因此，必须非常小心地监测接受移植物的患者的潜在的感染(例如细菌性或病毒性)，因为这类感染对于已接受移植物的患者可能是致命的。然而，对已接受移植物的人的复杂医学治疗具有的不想要的副作用是，患者未意识到感染和/或炎症的早期迹象。对移植物的排斥可能产生炎症，而患者由于移植后的医学治疗通常未识别早期阶段。患者仅会在更后期的阶段意识到他或她患有炎症，然而产生的不期望的后果是对患者开始进行适宜治疗以避免移植物排斥可能已太迟。因此，需要简单和可靠的体外方法来早期检测潜在的炎症，特别是检测对移植器官的潜在排斥。
[0006]本发明涉及犬尿氨酸(kynurenine)途径。色素是可经由不同路径代谢的基本氨基酸，其中一种主要路径是犬尿氨酸途径。该途径例示于图1。该途径的第一个酶，吲哚胺-2，3-双加氧酶，受炎性分子特别是干扰素-γ强烈刺激。如此，当免疫应答激活时，犬尿氨酸途径经常系统性上调。其生物学意义是在一方面，色氨酸的消耗和犬尿氨酸的生成在免疫应答中起着关键的调控作用。在另一方面，令人惊讶地发现在唾液中测量的犬尿氨酸水平可用于早期检测潜在的移植物排斥反应，其以其他方式是不能容易检出的。
[0007]色氨酸分解代谢中牵涉的主要酶吲哚胺-2，3-双加氧酶(ID0 I)的活化生成免疫抑制性代谢物，其反向调节免疫活化。在显示IDO活性对于小鼠模型中半同种异源胎儿(semiallogeneic foetus)的免疫接受具有重要意见后，移植免疫学家对该控制环路的兴趣急剧增加。实验数据产生以下假说，即调节性T细胞通过启动IDO活性发挥其免疫抑制功能。这一基础性发现使得色氨酸代谢对于临床移植和不同疾病也具有意义(Chen等，Int.J.0f Tryptophan Research 2009 ；2,1-19)。
[0008]用于早期测量和预测炎性形成的可靠的监测方法对于患者治疗有益。
[0009]目前已知曾经认为相对惰性的内皮牵涉多种功能，如纤维蛋白溶解、凝固作用、血管紧张度、生长和免疫应答。人体中最常见的反应可在由先天免疫介导的炎性应答中看到。
[0010]吲哚胺-2，3-双加氧酶(IDO)，一种IFN-γ可诱导的胞内酶，催化犬尿氨酸途径中基本氨基酸色氨酸的降解中的第一且限速步骤。IDO的免疫调控效果由阻止T细胞增殖、促进T细胞凋亡、诱导T细胞忽略、无反应性、和T调节细胞的生成代表。虽然IDO显现为免疫调节物，但是其在控制同种异体应答(allo-response)中的作用正在展开中。
[0011]本文中公开的方法可用作方便的监测工具来测量炎症或激活的先天免疫应答。尽管对IDO的分子T细胞调节机制的认知逐渐增多，但其在同种异型免疫(al1immunity)和临床移植中的生理作用仍是争议性的。可获的实验数据表明通过将IDO基因引入同种异体移植物的遗传操作与延长的存活有关，且抗原呈递细胞(APC)如树突细胞能增加IDO的表达，如此调节免疫应答。此外，IDO充当树突细胞和调节性T细胞(Treg)之间的桥梁以获得完全效应器功能。这些发现显示IDO对于移植中的免疫调控和抗原特异性耐受诱导具有相当大的潜力。这同样适用于犬尿氨酸。犬尿氨酸是在N-甲酰犬尿氨酸之后色氨酸的头一个降解产物。犬尿氨酸相当早地显示炎性应答的激活且可以用于早期检测排斥发作(episode)。
[0012]本发明提供了用于早期检测潜在炎症(其特别是与移植物排斥有关)的体外方法。在所述方法中测定唾液中犬尿氨酸的水平。虽然在本发明的方法中优选测定L-犬尿氨酸的水平，但也可以测定N-甲酰犬尿氨酸、3-轻基犬尿氨酸和犬尿稀酸(kynureninicacid)的水平。根据检测的方法，可以在不同中间体之间测定。然而，还可以利用与不同中间体反应的测定检验。对唾液中犬尿氨酸的测定优选定量或半定量进行，因为检测在常规值外的犬尿氨酸水平的变化是重要的。尤其有利的是所述体外方法可在没有医生或医学受训人员的情况下进行。
[0013]本发明的方法优选用于尽早地检测可能与对移植器官的排斥有关的任何并发症。在本发明的优选实施方案中，移植的器官选自那些经常移植的器官，如肾、肝、胰、心脏或肺。
[0014]然而，在另一个实施方案中，本发明的方法可在移植身体的一部分时使用。这类部分可以是眼的部分如角膜或视网膜。还能移植其他身体部分，如软骨、骨、骨髓或皮肤。
[0015]在一个进一步的实施方案中，移植物并非源自另一个人或源自动物。在这类实施方案中，从并非源自另一人或动物身体的材料制备移植物。这类材料可以是骨替换物、关节替换物、用于牙齿的植入物、乳房植入物或阴茎植入物等等。通常选择这类材料以将身体的潜在排斥活性保持在最低可能水平。
[0016]然而，监测对移植物的接受且用于早期检测可能导致移植物的最终排斥的潜在并发症的方法可能是有帮助的。本发明的体外方法优选可用于容易和可靠地监测患者在接受移植物后的恢复。
[0017]在本发明的一个特别优选的实施方案中，本文中描述的检验方法可用于治疗控制。可以在非常早的阶段检测炎症的早期迹象而不需要侵入性手段。患者能通过用其唾液容易地实施检验，且本文中提供的检验试剂盒允许早期指示治疗中的潜在风险。
[0018]在另一个实施方案中，本发明提供用于实施依照本发明方法的适宜的试剂盒。这类试剂盒包含用于测定唾液中犬尿氨酸的手段。这类手段可基于不同的原理工作。可以使用特定的显色试剂，其检测犬尿氨酸和/或犬尿氨酸衍生物的存在。或者，试剂盒可包含至少一种或优选两种特异性结合犬尿氨酸的抗体。优选地，当使用两种抗体时，这类抗体不结合相同表位，从而允许形成由第一抗体、犬尿氨酸或其衍生物和第二抗体形成的夹心。
[0019]在本发明的一个实施方案中，通过显色反应来实施对犬尿氨酸或其衍生物的测定。测定检验中的样品是唾液。在可以测定犬尿氨酸或其衍生物的含量之前，必须除去可能不利地影响正确和准确检验结果的组分。在一个优选的实施方案中，优选通过将扰乱测量结果的组分沉淀来除去可能扰乱正确检验结果的不想要的唾液组分。这类沉淀优选可通过使用三氯酸(trichloric acid)进行。然而，除了使用三氯酸以外，可以使用其他用于唾液去蛋白作用的方法。在已通过沉淀除去唾液的扰乱组分之后，可能必需通过离心分离相。然后，优选使上清液与显色试剂反应，所述显色试剂优选可以是Ehrlich氏试剂。在显色后通过测量在适宜波长处的吸光度来测量样品。优选地，所述检验以定量或半定量方式进行。在检验方法中，可以使用校正曲线或在检验试剂盒中固定某个阈值以避免假阳性结果。
[0020]发现早在实体器官移植后第I天，与在移植物手术后具有非并发性过程的患者相比，血清犬尿氨酸在随后患有急性排斥发作的患者中显著升高。将色氨酸代谢中的这些变化用于开发针对实体器官同种异体移植的急性排斥的新的预后检验。在移植后立即分析犬尿氨酸含量能协助定义最可能经历急性排斥的患者亚组，并对立即执行挽救移植治疗(graft-saving therapy)