测定急性呼吸窘迫综合征(ards)相关生物标志物的方法、监测患者的ards的发展和治疗 ...的制作方法
【专利说明】测定急性呼吸窘迫综合征(ARDS)相关生物标志物的方法、监测患者的ARDS的发展和治疗的方法发明领域
[0001]本发明涉及用于监测患者的急性呼吸窘迫综合征(ARDS)的发展和用于治疗患者的急性呼吸窘迫综合征(ARDS)的方法。用于监测ARDS的发展的方法基于将在较晚时间点提取的样品中获得的生物标志物的水平或活性与先前时间点提取的样品中的相同生物标志物的水平或活性进行比较。某些生物标志物的水平或活性的有利变化表示疾病消退(患者恢复)，相反地，某些生物标志物的水平或活性的不利变化表示疾病恶化。例如，如果所监测的一种或多种生物标志物的水平或活性停止显示有利变化或开始显示不利变化，则通过给予可用于治疗ARDS的治疗活性剂，加强对患者的治疗。
[0002]本发明另外涉及用于同时确定患者样品中的多种生物标志物的方法，其中所述生物标志物与ARDS有关。确定了生物标志物的水平或活性。本发明还涉及可用于进行所述方法的诊断试剂盒，特别是包含适用于生物芯片技术的芯片(例如微阵列)的试剂盒。
[0003]发明背景
本文用于说明本发明的背景的出版物和其它材料，具体地说提供关于实践的另外的详情的案例，通过引用予以结合。
[0004]多重测定，即用于样品中多种分析物的同时检测或定量的方法是本领域本身众所周知的。这类测定是在单一轮中同时测量多种分析物的测定。多重测定可根据每次测定可测量多少分析物来分类:分析物的量的范围在从几种(至少两种)开始直到非常高的数目。商品化多重测定通常被设计用于同时检测多达约50种分析物。这些方法可用于核酸和蛋白质(例如抗体)的分析。还可测量碳水化合物和其它化学化合物。
[0005]多重方法可以以许多备选方式进行。
[0006]作为实例可提及微阵列，其是同时确定许多生物分析物的固体支持物上的2D阵列。在蛋白质微测定(例如抗体微测定)中，将不同的抗体以预定方式在固体支持物上固定到分开的位置上。这些抗体用作能够俘获存在于样品中的分析物(蛋白质)的俘获分子。
[0007]作为市购可得的测定的实例可提及Luminex? xMAP技术，其是直接在微量滴定板中进行的基于珠粒的测定。各测定含有不同微球的混合物(珠粒混合物)，其中各珠粒类型由用于分析物分类的各荧光色调限定，并在其表面上携带特异性俘获试剂，例如特异性蛋白质(抗体)。在珠粒混合物与患者样品温育期间，互补反应配偶体(抗原)与在微球上的俘获抗体结合。在第二温育步骤中，用携带特异性荧光标志物的标记抗体检测结合的抗原。结合的分析物(抗原)的量与检测抗体的荧光强度正相关，这允许定量分析物。珠粒的分类和抗原的定量用Luminex分析系统进行，该系统基于使用两种不同激光的流式细胞术的技术。
[0008]还提出了使用用于疾病的诊断和预后的多连续生物标志物(multiplesequential b1markers)。
[0009]Chirag R Parikh 等，Crit Care Med 2008，第 36 卷，第 4 期(Suppl);第S159-S165页，提出使用用于评价AKI (急性肾损伤)的持续时间和用于预测有关透析需要和死亡率的总体预后的多连续生物标志物。生物标志物是血浆组(plasma panel)中的NGAL (嗜中性粒细胞明胶酶相关脂笼蛋白)和胱抑蛋白C和尿液组(urine panel)中的NGAL、IL-18 (白介素-18)和IQM-1 (肾损伤分子-1)。
[0010]O Beran等，Eur J Clin Microb1l Infect Dis (2009) 28:793-799描述了生物标志物例如IL-6 (白介素-6)、IL-1ra (白介素-1受体拮抗剂)、IL-1 β (白介素-1 β )、IL-8 (白介素-8)、MIP-1 β (巨噬细胞炎性蛋白-1 β )和MCP-1 (单核细胞化学引诱蛋白-1)的序贯分析及其与MD (侵入性脑膜炎球菌病)的相关性及其严重性。
[0011]WO 2009/053523，Faron Pharmaceuticals 0y，公开了 CD73 是用于监测患者的炎性疾病，具体地说SIRS (全身炎症反应综合征)、ALI (急性肺损伤)、ARDS和MOF (多器官衰竭)的有用生物标志物。在不同时间点从患者中提取组织液样品，确定样品中的CD73活性。发现CD73活性水平的提高与疾病的消退相关。
[0012]迄今为止，无人提出将多连续生物标志物用于监测患者的ARDS的发展。特别是，无人提出将由⑶73和IL-6组成或包括⑶73和IL-6的一组生物标志物用于此目的。
[0013]发明概述
本发明的目的在于提供在该病况的治疗期间跟踪ARDS的严重性的方法和手段。通常ARDS患者接受最合理的重症监护，但更重要的是，使用生物标志物预测任何药物治疗正成为评价治疗功效的非常有价值的资源。一种这样的治疗是Traumakine? FP-1201 (干扰素β )，已显示该治疗降低ARDS患者的死亡率。通过获得有关患者病况的有价值的预测数据，I⑶医生可使患者的护理最优化。
[0014]因此，在一方面中，本发明涉及同时确定从患者中提取的样品中的多种ARDS相关生物标志物的方法，其中生物标志物之一是⑶73蛋白。按照本发明，所述方法包括以下步骤
i)通过将样品加入识别生物标志物的结合剂中，定量所述样品中生物标志物的水平，
或
?)通过采用薄层色谱法或通过将所述样品加入生物标志物的底物中，并监测所述底物的变化确定所述样品中生物标志物的活性。
[0015]在另一方面中，本发明涉及在用于同时确定从患者中提取的样品中的多种ARDS相关生物标志物的生物亲和力测定方法中使用的诊断试剂盒，其中包括⑶73和其它生物标志物的生物标志物的数目为至少2种、优选2-50种、最优选2-8种。按照本发明，所述试剂盒包含
-固定在固体支持物或能够固定在固体支持物上的一组俘获结合剂，其中各俘获结合剂对待确定的某种生物标志物特异，和
-一组标记的生物亲和力组分，其中这类标记的生物亲和力组分各自具有对某种固定化生物标志物特异的生物亲和力，或其中这类标记的生物亲和力组分各自具有与某种固定化生物标志物竞争结合位点的能力。
[0016]在第三方面中，本发明涉及用于监测患者的ARDS的发展的方法，其中确定了在不同时间点从患者中提取的样品中的至少2种、优选2-50种、最优选2-8种ARDS相关生物标志物，且其中生物标志物之一是⑶73蛋白，所述方法基于将在较晚时间点提取的样品中获得的生物标志物的水平或活性与在先前时间点提取的样品中的同一生物标志物的水平或活性进行比较，其中某种生物标志物的水平或活性的有利变化表示疾病消退，且其中某种生物标志物的水平或活性的不利变化表示疾病恶化。
[0017]在第四方面中，本发明涉及用于通过给予患者有效治疗ARDS的治疗活性剂来治疗患有ARDS的患者的方法，其中按照本发明，用于监测ARDS的发展的一种或多种生物标志物，
-一停止显示有利变化，或 -一开始显示不利变化就开始给药。
[0018]附图简述
图1A显示具有能够结合俘获结合剂的点的支持物，
图1B显示俘获结合剂在其上固定的图1A的支持物，
图1C显示在其上待确定的生物标志物已经固定在俘获结合剂上的图1B的支持物，
图1D显示在其上标记的结合剂已经固定在待确定的生物标志物上的图1C的支持物，图2显示标记的抗体，其包含定向到生物标志物的第一抗体和携带标记并与第一抗体的Fe区结合的第二抗体的套件，
图3显示所测量的生物标志物的水平随时间而变的一组曲线。B1-B4的直线表明随时间的变化是有利的。B5的虚线意味着其水平的降低表示不利变化。
[0019]图4a-4h显示从ALI或ARDS恢复的一组患者的8种生物标志物随时间而变的水平或活性(图4a-4g显示水平；图4h显示活性)。
[0020]图5显示作为实例的从ALI或ARDS恢复的一名患者的可溶性⑶73随时间而变的活性和水平(浓度)两者。从相同样品的等分试样中测量可溶性CD73活性(■，左y轴)和可溶性⑶73浓度(.，右y轴)。图5显示活性和浓度测量相当。可以看出，⑶73 (图5)和IL-6 (图4b)值显示在血浆浓度中的显著变化，这表明了有利变化。
[0021]发明详述
样品可以是任何组织液，其浸润并围绕着细胞。该术语包括例如血浆、血清、全血、淋巴、尿液、渗出液(胸膜、腹膜)和脑脊液。
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