一种猪繁殖与呼吸综合征病毒稀释液及其制备方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于兽用生物制品技术领域，具体设及一种猪繁殖与呼吸综合征病毒稀释 液及其制备方法。
【背景技术】
[0002] 猪蓝耳病又称猪繁殖与呼吸综合征（Porcine reproductive and respiratoiT syndrome, PRRS)，是由猪繁殖与呼吸综合征病毒（Porcine reproductive and respiratoiT syn化ome virus, PRRSV)引起的，W妊娠母猪发生早产、流产、产死胎、弱仔 和木乃伊胎，仔猪和育肥猪发生呼吸道症状的疾病。PRRS难W有效的防制，首先是PRRSVW 肺巨隧细胞为祀细胞，具有抗体依赖性增强作用（ADE)造成了一定的免疫抑制，其次是 PRRSV不断的发生着变异，并且PRRS没有有效的治疗药物，免疫接种是目前控制该病的最主 要措施。
[0003] 灭活疫苗的主要优点是安全，疫苗株不会传染给其他猪只，同时其毒力也不会返 强。田间试验研究表明，灭活疫苗的使用不会导致经产母猪和后备母猪的繁殖失败。目前蓝 耳病灭活疫苗主要采用油包水剂型的油乳剂疫苗。油包水型疫苗具有较好的缓释作用，免 疫后持续刺激机体达到免疫保护方面表现尤为突出。但油包水剂型的疫苗往往所需较高的 抗原浓度来提高疫苗的效力。为提高PRRS灭活疫苗的效力，需要在确保疫苗病毒株免疫原 性的前提下尽量提高疫苗在灭活前的病毒含量。研究表明，自1996年报道PRRSW来，国内许 多学者先后分离到PRRSV，但各地方分离株的滴度都呈现出较低的状态：（1)台湾分离株，为 美洲型毒株，毒价为l〇 6TCID5〇/0.1ml(台湾养猪科学研究所）；（2 乂 H-la、CH-化、CH-lc、CH-Id株，为美洲型毒株，毒价为106TCI化o/O.lml(哈尔滨兽医研究所）。因此为了提高病毒含 量，通常的做法是通过浓缩蓝耳病抗原十几倍甚至几十倍，如此W来不仅增加了生产成本， 同时在浓缩过程中蓝耳病病毒的免疫原性会有所降低。
[0004] 本发明针对上述不足，提出一种猪繁殖与呼吸综合征病毒稀释液，通过该稀释液 处理猪繁殖与呼吸综合征病毒后接种细胞，可特异性提高该病毒在祀细胞上的增殖量，可 W提高1-2个病毒滴度即病毒含量提高10-100倍。
【发明内容】
[000引针对现有技术存在的问题，本发明的目的在于设计提供一种猪繁殖与呼吸综合征 病毒稀释液及其制备方法。
[0006] 所述的一种猪繁殖与呼吸综合征病毒稀释液，其特征在于每1000ml憐酸缓冲液中 含有W下重量配比的组分:氨基酸组合10~30g、复方中药多糖10~30g和脂质体10~30g， 所述的氨基酸组合包括叶酸、核黄素憐酸钢、右泛醇和抗坏血酸，所述的复方中药多糖由独 活、云香草、蔓荆子、密蒙花、玄参和赤巧提取得到。
[0007] 所述的一种猪繁殖与呼吸综合征病毒稀释液，其特征在于该稀释液的pH为7.0~ 7.5。
[0008] 所述的一种猪繁殖与呼吸综合征病毒稀释液，其特征在于所述的憐酸缓冲液由氯 化钢6~lOg，氯化钟0.05~0.5g，憐酸氨二钢1~1.2g，憐酸二氨钟0.05~0.5g，氯化巧0.05 ~0.2g，含6个结晶水的氯化儀0.05~0.2g溶于1000ml双蒸水中得到。
[0009] 所述的一种猪繁殖与呼吸综合征病毒稀释液，其特征在于所述的每1000ml憐酸缓 冲液中含有W下重量配比的组分:氨基酸组合14~26g、复方中药多糖15~25g和脂质体12 ~28g〇
[0010] 所述的一种猪繁殖与呼吸综合征病毒稀释液，其特征在于所述的氨基酸组合含有 W下重量百分比含量的氨基酸：叶酸20~40%、核黄素憐酸钢10~40%、右泛醇10~30%和抗 坏血酸30~60%。
[0011] 所述的一种猪繁殖与呼吸综合征病毒稀释液，其特征在于所述的脂质体按W下步 骤制得:按大豆卵憐脂3重量份和甘氨胆酸1重量份称取大豆卵憐脂和甘氨胆酸，用氯仿进 行溶解，并使其混合均匀，并通过减压法去除溶液中氯仿，制备脂质体膜;配制pH值为7.0~ 8.0、浓度为O.lm/1的构祿酸和构祿酸钟缓冲溶液，将该缓冲溶液加入到脂质体膜溶液中， 脱水后用匀浆机制备成脂质体。
[0012] 所述的一种猪繁殖与呼吸综合征病毒稀释液，其特征在于所述的复方中药多糖按 W下步骤制得： a、 按独活5~20份、云香草10~30份、蔓荆子10~30份、密蒙花5~20份、玄参10~30和 赤巧20~40份称取各中药原料，切碎、洗净后用冷水浸泡过夜，再加入原料重量15倍的纯化 水，水浴至90°C，并保持在90°C，熬制2小时，熬制过程中每10分钟揽拌一次； b、 弃去a中药渣，收集药液，室溫冷却后经100(K)rpm离屯、10分钟，弃去沉淀，收集上清； C、将b中上清进行醇沉，沉淀得到粗制中药多糖； d、 用灭菌纯化水洗涂C中粗制中药多糖，洗涂后用20倍量的42°C灭菌纯化水进行溶解， 溶解后，按0.5%比例加入活性炭4°C吸附过夜，吸附后经1000化pm离屯、10分钟，弃去沉淀，收 集上清； e、 将d中上清液进行10倍浓缩，制得中药多糖浓缩液； f、 将e中中药多糖浓缩液进行真空冷冻干燥制得复方中药多糖。
[0013] 所述的一种猪繁殖与呼吸综合征病毒稀释液，其特征在于所述的步骤a中按独活 10~15份、云香草15~25份、蔓荆子15~25份、密蒙花10~15份、玄参15~25和赤巧25~35 份称取各中药原料。
[0014] 所述的一种猪繁殖与呼吸综合征病毒稀释液的制备方法，其特征在于包括W下工 艺步骤： 1) 憐酸缓冲溶液的配制： 按氯化钢6~lOg，氯化钟0.05~0.5g，憐酸氨二钢1~1.2g，憐酸二氨钟0.05~0.5g，氯 化巧0.05~0.2g，含6个结晶水的氯化儀0.05~0.2g溶于1000ml双蒸水中，无菌条件下通过 0.22皿滤膜，过滤除菌备用； 2) 复方中药多糖的制备： a、按独活5~20份、云香草10~30份、蔓荆子10~30份、密蒙花5~20份、玄参10~30和 赤巧20~40份称取各中药原料，切碎、洗净后用冷水浸泡过夜，再加入原料重量15倍的纯化 水，水浴至90°C，并保持在90°C，熬制2小时，熬制过程中每10分钟揽拌一次； b、弃去a中药渣，收集药液，室溫冷却后经100(K)rpm离屯、10分钟，弃去沉淀，收集上清； C、将b中上清进行醇沉，沉淀得到粗制中药多糖； d、 用灭菌纯化水洗涂C中粗制中药多糖，洗涂后用20倍量的42°C灭菌纯化水进行溶解， 溶解后，按0.5%比例加入活性炭4°C吸附过夜，吸附后经1000化pm离屯、10分钟，弃去沉淀，收 集上清； e、 将d中上清液进行10倍浓缩，制得中药多糖浓缩液； f、 将e中中药多糖浓缩液进行真空冷冻干燥制得复合中药多糖冻干粉； 3) 脂质体按的制备： 按大豆卵憐脂3重量份和甘氨胆酸1重量份称取大豆卵憐脂和甘氨胆酸，用氯仿进行溶 解，并使其混合均匀，并通过减压法去除溶液中氯仿，制备脂质体膜;配制pH值为7.0~8.0、 浓度为O.lm/1的构祿酸和构祿酸钟缓冲溶液，将该缓冲溶液加入到脂质体膜溶液中，脱水 后用匀浆机制备成脂质体； 4) 猪繁殖与呼吸综合征病毒稀释液的配制： 按氨基酸组合10~30g、复方中药多糖10~30g和脂质体10~30g称取各原料，所述的按 氨基酸组合含有叶酸20~40%、核黄素憐酸钢10~40%、右泛醇10~30%和抗坏血酸30~60%， 将上述原料溶解于步骤1)制得的憐酸缓冲溶液中，充分混匀，用酸或碱调节pH至7.0~7.5 之间，无菌条件下通过0.22皿滤膜，过滤除菌后置4°C保存备用。
[001引本发明的有益效果是： (1)病毒接种后，可促进细胞生长，保持细胞正常生长。
[0016] (2)处理后病毒更容易感染细胞，大幅提高病毒感染细胞几率。
[0017] (3)相同培养时间可W大幅提高病毒滴度，病毒含量提高10-100倍。
【具体实施方式】
[0018] 为了使本发明更加容易理解，下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解， 运些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。
[0019] 实施例1 一种猪繁殖与呼吸综合征病毒稀释液，该病毒稀释液每1000ml憐酸缓冲液中含有:氨 基酸组合20g(叶酸4g、核黄素憐酸钢6g、右泛醇4g、抗坏血酸6g)、复方中药多糖20g和脂质 体20g，该稀释液pH为7.2。
[0020] -种猪繁殖与呼吸综合征病毒稀释液的制备方法，其步骤是： (1)憐酸缓冲溶液的配制:按上述憐酸盐缓冲液配方准确称取氯化钢8g，氯化钟0.2g， 憐酸氨二钢1.15g，憐酸二氨钟0.2g，氯化巧0.1 g，含6个结晶水的氯化儀0.1 g溶于1000ml双 蒸水中，无菌条件下通过0.22皿滤膜，过滤除菌备用。
[0021] (2)复方中药多糖的制备 a、按独活5份、云香草30份、蔓荆子20份、密蒙花20份、玄参20和赤巧20份称取所述中药 原料，切碎、洗净后用冷水浸泡过夜，再加入原料重量15倍的纯化水，水浴至90°C，并保持在 90°C，熬制2小时，熬制过程中每10分钟揽拌一次。
[0022] b、弃去a中药渣，收集药液，室溫冷却后经1000化pm离屯、10分钟，弃去沉淀，收集上 清。
[0023] c、将b中上清进行醇沉，沉淀得到粗制中药多糖； d、 用灭菌纯化水洗涂C中粗制中药多糖，洗涂后用20倍量的42°C灭菌纯化水进行溶解， 溶解后，按0.5%比例加入活性炭4°C吸附过夜，吸附后经1000化pm离屯、10分钟，弃去沉淀，收 集上清； e、 将d中上清液进行10倍浓缩，制得中药多糖浓缩液； f、 将e中中药多糖浓缩液进行真空冷冻干燥制得复方中药多糖。
[0024] (3)脂质体制备 按大豆卵憐脂3重量份和甘氨胆酸1重量份称取大豆卵憐脂和甘氨胆酸，用氯仿进行溶 解，并使其混合均匀，并通过减压法去除溶液中氯仿，制备脂质体膜;配制pH值为7.0~8.0、 浓度为O.lm/1的构祿酸和构祿酸钟缓冲溶液，将该缓冲