一株特异性抗头孢噻呋单克隆抗体杂交瘤细胞株2e5及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明设及一株特异性抗头抱嚷巧单克隆抗体杂交瘤细胞株2E5及其应用，属于 食品安全免疫检测技术领域。
【背景技术】
[0002] 头抱嚷巧化FT)，英文名称为cef tio化r，分子式为Cl讯17化0巧3，分子量为523.56， 化学名称为(6R，7R)-7-[2-(2-氨基嚷挫-4-基）（甲氧基亚胺基）乙酷胺基]-3-[(2-巧喃基 幾基)硫甲基]-8-氧代-5-硫杂-1-氮杂双环[4.2.0]辛-2-締-2-甲酸。CAS登录号为80370-57-6。头抱嚷巧为抗微生物药，是头抱菌素类半合成的第Ξ代动物专用头抱菌素。
[0003] 头抱嚷巧是第一个动物专用的头抱菌素类抗生素。其母核是由头抱菌素 C裂解而 获得的7-氨基头抱烧酸(7-ACA)。具广谱杀菌作用，对革兰氏阳性，革兰氏阴性包括产内酷 胺酶菌株均有效。抗菌活性比氨节西林强，对链球菌的活性也比哇诺酬类抗菌药强。由于其 优良的抗菌活性和药动力学特点，陆续被美国、加拿大、日本及欧洲一些国家正式批准用于 肉牛、奶牛、马、猪、羊的呼吸道疾病的治疗，显示了其在兽医临床应用的广阔前景。
[0004] -般来说，头抱嚷巧对各种动物的毒副作用较为轻微，大多数动物多可耐受，无需 停药。少数动物可能出现皮疹、痊痒等不良症状，偶见极度过敏现象。另一方面，长期食用头 抱嚷巧残留的动物性食品还可引起细菌耐药性，造成人体微生物环境平衡素乱和失调。由 于头抱嚷巧被广泛用于治疗牛乳腺炎和其它乳牛疾病，该药物在乳汁中的残留也会给乳制 品的质量带来严重影响。此外，头抱嚷巧主要排泄途径为肾脏，所W肾毒性较强。欧盟颁布 头抱嚷巧最大残留限量在牛奶中最低，限量不得超过l(K)yg/kg。所W有必要建立头抱嚷巧 的快速检测方法。
[000引目前头抱嚷巧的检测方法主要是仪器检测方法和免疫分析检测方法，仪器检测方 法仪器成本高，操作复杂，需要专职人员操作，而免疫分析方法具有低成本、高通量、高灵 敏、对技术人员相对要求低等特点，因此适用于大量样品的快速筛查。
【发明内容】
[0006] 本发明的目的提供一株特异性抗头抱嚷巧单克隆抗体杂交瘤细胞株，由该细胞株 制备的抗体对头抱嚷巧具有较好的亲和力和检测灵敏度，可W用来建立头抱嚷巧酶联免疫 检测方法，或建立胶体金免疫层析技术快速检测方法。
[0007] 本发明的技术方案，一株特异性抗头抱嚷巧单克隆抗体杂交瘤细胞株2E5,已保藏 于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中屯、，简称CGMCC，保藏编号为CGMCC No.10873。
[000引抗头抱嚷巧单克隆抗体，它由所述保藏编号为CGMCC No. 10873的特异性抗头抱 嚷巧单克隆抗体杂交瘤细胞株沈5分泌产生。
[0009]所述抗头抱嚷巧单克隆抗体的应用，其在食品安全中头抱嚷巧残留检测中的应 用。
[0010] 本发明提供的杂交瘤细胞株沈5细胞株的制备基本步骤为： (1) 免疫原的制备与鉴定：头抱嚷巧通过活化醋法与蛋白载体的氨基相连，反应结束 后，通过透析分离完全抗原和未偶联的小分子半抗原，完全抗原通过SDS-PAGE凝胶电泳表 征； (2) 小鼠的免疫:将抗原与福氏佐剂乳化完全后，通过皮下多点注射免疫BALB/c小鼠。 首次免疫采用福氏完全佐剂，加强免疫使用福氏不完全佐剂，冲刺免疫时免疫剂量为前一 次免疫剂量的一半，与生理盐水混合均匀后直接进行腹腔注射;各次免疫间隔为Ξ周。第Ξ 次免疫后，间隔一周采血检测血清效价和抑制； (3) 细胞融合与细胞株建立:通过聚乙二醇(PEG 4000)法，使小鼠脾细胞和小鼠骨髓瘤 细胞融合，通过HAT培养基培养，利用间接化ISA检测阳性细胞孔，并进一步利用间接竞争 ELISA法测定阳性细胞孔的抑制效果，通过有限稀释法对有最好抑制的阳性细胞孔进行Ξ 次亚克隆，最终筛选获得杂交瘤细胞株沈5; (4) 杂交瘤细胞株性质的鉴定：采用小鼠单抗Ig类/亚类鉴定用酶标二抗套装测定； IC50值、交叉反应率和亲和力的测定通过化ISA法。
[0011] 本发明的有益效果:本发明获得的抗头抱嚷巧单克隆抗体杂交瘤细胞株，不仅有 较好的检测灵敏度和亲和力，且对其它头抱类抗菌素的交叉反应率低，可W达到特异性检 测头抱嚷巧的目的。本发明一种新的制备针对特定头抱菌素特异性抗体的思路，得到很好 的特异性单克隆抗体细胞株。
[0012] 生物材料样品保藏:一株特异性抗头抱嚷巧单克隆细胞株沈5,已保藏于中国微生 物菌种保藏管理委员会普通微生物中屯、，简称CGMCC，地址为:北京市朝阳区北辰西路1号院 3号，中国科学院微生物研究所，保藏日期2015年5月19日，保藏编号为CGMCC No.10873。
【附图说明】
[0013] 图1是免疫原的505斗466凝胶电泳表征。1、854,2、6。1'斗0(：-854化。1':854摩尔比= 120:1)，3、EFT-EDC-BSA 化FT: BSA摩尔比=100:1)，4、EFT-EDC-BSA 化FT: BSA摩尔比=80: 1)。
[0014] 图2是沈5单克隆抗体对头抱嚷巧EFT的标准曲线。
【具体实施方式】
[0015] 本发明下面的实施例仅作为本
【发明内容】
的进一步说明，不作为本发明的限定内容 或范围。下面通过实施例对本发明作进一步说明。
[0016] 本发明通过将EFT完全抗原免疫小鼠，通过细胞融合，HAT选择性培养基培养，通过 间接ELISA和间接竞争ELISA筛选细胞上清，最终得到了对EFT有较好亲和力和灵敏度的单 克隆抗体杂交瘤细胞株。
[0017]实施例1杂交瘤细胞株沈5的制备 (1)完全抗原的合成:取4.5mg EFT，再加入2.0mg EDC和l.Omg NHS，使用DMF溶解，室溫 揽拌，活化地;另取5 mg BSA溶解于2mL、0.05 M、p朋.6的CB溶液中，将上述活化后的头抱嚷 巧溶液慢速逐滴加入BSA的CB溶液中，室溫揽拌反应过夜后，4°C透析Ξ天，得免疫原，-20°C 分装保存。
[0018] (2)动物免疫:选择健康的6~8周龄的BALB/c小鼠进行免疫。取头抱嚷巧完全抗原 (Img/mL)与等量福氏佐剂乳化均匀后，通过皮下多点注射免疫BALB/c小鼠，每只l(K)yL。首 次免疫采用福氏完全佐剂，加强免疫使用福氏不完全佐剂，冲刺免疫时免疫剂量为前一次 免疫剂量的一半，与生理盐水混合均匀后直接进行腹腔注射;各次免疫间隔为Ξ周。第Ξ次 免疫后，间隔一周采血检测血清效价和抑制；选择抑制最好的小鼠，在五免后21天冲刺免 疫，准备融合。
[0019] (3)细胞融合:在冲刺免疫Ξ天后，按照常规PEG(聚乙二醇，分子量为4000)方法进 行