一种猪瘟病毒、猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒、伪狂犬病毒抗体的三联金标检测试纸条的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种猪瘟病毒、猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒、伪狂犬病毒抗体的三联金标检测试纸条，其包括样品垫、金标垫、硝酸纤维素膜和吸水纸，所述金标垫上喷射有金标CSFV反应原性多肽、金标PRRSV反应原性多肽、金标猪PRV反应原性多肽；所述硝酸纤维素膜上设有三条检测线和一条质控线，所述三条检测线上分别固定有CSFV反应原性多肽、PRRSV反应原性多肽、PRV反应原性多肽，所述质检线上固定有CSFV抗体、PRRSV抗体和PRV抗体。本发明的试纸条具有多联、特异、敏感，使用简便、快速等优点，可为我国生猪养殖基层提供高效、实用的抗体检测技术与产品，为生猪疫病的防疫监督提供有效的技术支撑。
【专利说明】一种猪瘟病毒、猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒、伪狂犬病毒抗体的三联金标检测试纸条
【技术领域】
[0001]本发明属于生物检测【技术领域】，具体涉及一种利用多肽抗原制备的猪瘟病毒、猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒、伪狂犬病毒抗体的三联金标检测试纸条。
【背景技术】
[0002]近年来危害我国养猪业的主要疫病有猪繁殖与呼吸综合征、猪瘟和伪狂犬病、口蹄疫和圆环等，其中蓝耳病危害最为严重。美国、欧洲养猪业发达国家普遍采用疫病净化战略，针对一些重要疫病如猪口蹄疫、猪瘟、伪狂犬等已停止使用疫苗，严格检疫、监测和净化的措施予以防控。我国因为现有基础条件和疫病形势的原因，目前尚不能完全照搬国外疫病净化的策略，疫苗免疫与疫病监控依然是我国生猪疫病防控最为有效的措施之一。
[0003]由于国内疫苗种类繁多，质量参差不齐，免疫流程与技术人员操作各不相同，因此，疫苗免疫后抗体效价与免疫效果的监测就显得极为重要，各类抗体水平的监测急需免疫检测技术与产品的支持。我国目前常用的免疫学检测方法有ELISA技术与乳胶凝集技术，然而ELISA技术需耗时2-3个小时，对操作人员有较高的技术要求，不太适应我国基层推广。乳胶凝集则敏感性较低。免疫胶体金层析技术因兼有ELISA与乳胶凝集技术的优点，既比ELISA快速(仅需5-10分钟)，又比乳胶凝集敏感(接近ELISA，可达ng/mL水平)，成为国内外动物疫病及抗体水平监测技术研究的热点之一。
[0004]猪瘟，是由猪瘟病毒(CSFV)引起的一种急性、热性和高度接触的病毒性传染病，该病以流行广、发病率和死亡率高为特征,给养猪业带来惨重损失。该病被国际动物法规列入A类16种传染病之一，被我国动物卫生法规列为一类传染病。
[0005]猪繁殖与呼吸综合征是由猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)引起的猪的一种繁殖障碍与呼吸系统传染病。猪是此病的唯一天然宿主。该病以接触性、高度传染性、高发病率，慢性和高死亡率为特征。病猪生长十分缓慢，甚至停滞生长，严重影响养猪业的经济效益，因此对该病及时做出诊断有利于降低经济损失。
[0006]伪狂犬病是由伪狂犬病毒(PRV)引起的多种家畜、野生动物的一种以发热、脑脊髓炎为主的急性传染病。猪是本病的主要宿主和带毒者。通常引起妊娠母猪流产、产木乃伊胎、死胎和弱仔；初生仔猪出现神经症状，感染率和病死率可达100%。伪狂犬病(PR) —旦传入猪群，将导致巨大的经济损失，且很难根除。
[0007]目前，酶联免疫吸附试验(ELISA)在上述几种病的诊断中已得到普遍应用，ELISA虽然灵敏度比较高，甚至可以区分野毒感染和疫苗免疫接种产生的抗体，但操作需要专门的技术人员和分析仪器，不适合基层的使用，因此，适用于现场使用的快速诊断与检测试剂如胶体金试纸条、核酸分子检测技术如实时荧光定量PCR技术，以及对一些多病原检测的试剂如核酸检测生物芯片等的研制与开发也很受关注。胶体金试纸卡应用简单、快速、直观，不需要配备专门的仪器以及技术人员，适于基本养殖场的检测需求，节省人力、物力成本。而目前猪病抗体的检测模式多是养殖场采集血清样本然后送到专门的检测单位通过ELISA方法进行检测，从样本送检到报告结果一般需要3-4天有时甚至更多的时间，不利于降低检测成本及提高检测速度。
[0008]就胶体金试纸条研发方面而言，目前文献报道的多是针对病原检测的单联、多联试纸卡以及各猪病抗体检测的单联试纸卡，尚无同时检测CSFV、PRRSV, PRV三种疾病抗体的胶体金检测试纸卡，且已有的检测用金标抗原多是利用表达蛋白或是全病毒抗原，利用多肽作为金标抗原的也尚未见报道。
【发明内容】
[0009]本发明的目的在于一种猪瘟病毒、猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒、伪狂犬病毒抗体的三联金标检测试纸条。
[0010]本发明所采取的技术方案是:
一种猪瘟病毒、猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒、伪狂犬病毒抗体的三联金标检测试纸条，包括样品垫、金标垫、硝酸纤维素膜和吸水纸，所述金标垫上喷射有金标猪瘟病毒反应原性多肽、金标猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒反应原性多肽、金标猪伪狂犬病毒反应原性多肽；所述硝酸纤维素膜上设有三条检测线和一条质控线，所述三条检测线上分别固定有猪瘟病毒反应原性多肽、猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒反应原性多肽、猪伪狂犬病毒反应原性多肽，所述质检线上固定有猪瘟病毒抗体、猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒抗体和猪伪狂犬病毒抗体。
[0011]作为优选的，所述猪瘟病毒反应原性多肽选自以下任一条:
【权利要求】
1.一种猪瘟病毒、猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒、伪狂犬病毒抗体的三联金标检测试纸条，包括样品垫、金标垫、硝酸纤维素膜和吸水纸，其特征在于:所述金标垫上喷射有金标猪瘟病毒反应原性多肽、金标猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒反应原性多肽、金标猪伪狂犬病毒反应原性多肽；所述硝酸纤维素膜上设有三条检测线和一条质控线，所述三条检测线上分别固定有猪瘟病毒反应原性多肽、猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒反应原性多肽、猪伪狂犬病毒反应原性多肽，所述质检线上固定有猪瘟病毒抗体、猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒抗体和猪伪狂犬病毒抗体。
2.根据权利要求1所述的检测试纸条，其特征在于，所述猪瘟病毒反应原性多肽选自以下任一条:
SEQ ID N0.1:c-HKVRNEVMVHWFDDE ；
SEQ ID N0.2:GLSTAENALLVALFGYV ；
SEQ ID N0.3:CTAVSPTTLRTE ；
SEQ ID N0.4:KYNTTLLNGSA-c。
3.根据权利要求1所述的检测试纸条，其特征在于，所述猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒反应原性多肽选自以下任一条:
SEQ ID N0.5:c-GFMVPPGLSSEGHLT ；
SEQ ID N0.6:KTKSVKSLPGNKPVP-c。
4.根据权利要求1所述的检测试纸条，其特征在于，所述猪伪狂犬病毒反应原性多肽选自以下任一条:
SEQ ID N0.7:VALALLLLALAAA ；
SEQ ID N0.8 =YYKNVIVTTYffSGSTYA ；
SEQ ID N0.9:LAIGLLYLAGLYAAFLAYR ；
SEQ ID N0.10:LLAALLAALYARTTL。
5.根据权利要求1~4任一项所述的检测试纸条，其特征线在于，金标垫上喷涂的金标猪瘟病毒反应原性多肽、金标猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒反应原性多肽、金标猪伪狂犬病毒反应原性多肽分别为猪瘟病毒反应原性多肽-生物素-链霉亲和素-胶体金颗粒复合物、猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒反应原性多肽-生物素-链霉亲和素-胶体金颗粒复合物、伪狂犬病毒反应原性多肽-生物素-链霉亲和素-胶体金颗粒复合物。
6.根据权利要求1~4任一项所述的检测试纸条，其特征在于，硝酸纤维素膜检测线上固定的猪瘟病毒反应原性多肽、猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒反应原性多肽、猪伪狂犬病毒反应原性多肽先与非蛋白多聚体偶联，得到多聚体偶联反应原性多肽，再进一步将多聚体偶联反应原性多肽固定到检测线上。
7.根据权利要求6所述的检测试纸条，其特征在于，所述多聚体偶联反应原性多肽的制备方法如下: 1)选取反应原性多肽溶解，得到反应原性多肽溶液； 2)取非蛋白多聚体溶解，得到非蛋白多聚体溶液； 3)在反应原性多肽溶液或非蛋白多聚体溶液中加入偶联剂，混合均匀； 4)将反应原性多肽溶液与非蛋白多聚体溶液混合均匀，搅拌反应，使反应原性多肽偶联到非蛋白多聚体上；5)用透析袋去除未参与结合的偶联剂及游离多肽，纯化，冻干，得到多聚体偶联反应原性多肽。
8.根据权利要求7所述的检测试纸条，其特征在于，所述非蛋白多聚体为聚乳酸-聚羟基乙酸共聚物、聚苯乙烯磺酸钠、壳聚糖、葡聚糖硫酸钠、海藻糖中的任一种。
9.根据权利要求7所述的检测试纸条，其特征在于，所述偶联剂为EDC1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐、乙烯基三乙氧基硅烷、I，5-戊二醛中的任一种。
10.一种猪瘟、猪蓝耳、伪狂犬病毒抗体三联金标检测试纸条的制备方法，包括以下步 骤: 1)合成猪瘟病毒反应原性多肽、猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒反应原性多肽、猪伪狂犬病毒反应原性多肽； 2)包被膜制备:将硝酸纤维素膜粘到PVC板上，用划膜喷金机将CSFV、PRRSV、PRV抗体的混合溶液喷涂到硝酸纤维素膜上，形成质检线；将与非蛋白多聚体偶联的猪瘟病毒反应原性多肽、猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒反应原性多肽、猪伪狂犬病毒反应原性多肽分别喷涂到硝酸纤维素膜上，形成三条检测线，干燥后保存备用； 3)金标垫制备:用胶体金颗粒标记链霉亲和素，然后与生物素化的猪瘟病毒反应原性多肽、猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒反应原性多肽、猪伪狂犬病毒反应原性多肽结合形成金标结合物，用金子稀释液稀释浓缩的金标结合物到10%~20%，再用划膜喷金机定量喷涂到玻璃纤维膜上，干燥保存备用； 4)样品垫制备:用样品处理液均匀处理玻璃纤维膜，干燥保存备用； 5)组装:金标垫与吸水纸分别紧密连接于硝酸纤维素膜的两端，然后将样品垫紧密连接于金标结合垫上组装成大板，再进一步切割成试纸条。
【文档编号】G01N33/558GK103954772SQ201410182377
【公开日】2014年7月30日 申请日期:2014年4月30日 优先权日:2014年4月30日
【发明者】林礼锟, 李其昌, 陈善真, 王志花, 刘博奇, 陈克宏, 王贵平 申请人:广东海大畜牧兽医研究院有限公司