同时测定血浆中脂蛋白磷脂酶a2和c反应蛋白的层析法快速检测卡及试剂盒的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种采用层析法同时测定血浆中脂蛋白磷脂 酶A2(Lp-PLA2)与C反应蛋白（CRP)含量的检测试剂盒，从而对缺血性脑卒中的分型、病情 或预后评估进行辅助诊断的试剂盒。
【背景技术】
[0002] 缺血性脑卒中是脑血管病中最常见者，其常见的病因为动脉粥样硬化导致管腔狭 窄和脑血栓形成，造成局部脑供血区血流中断，发生脑组织缺血、缺氧、软化坏死。大量研宄 表明动脉粥样硬化本身是一个炎症的过程，持续的低水平炎症预示着心脑血管疾病发生的 可能性。LP-PLA2为新近发现的炎症标志物，属于磷脂酶A2超家族中的非钙离子依赖型磷 酸酯酶，主要由炎症细胞（如巨噬细胞、淋巴细胞等）分泌，并受炎症介质的调节。CRP是由 肝脏合成的一种全身性炎症反应急性期的非特异性标志物，是心脑血管疾病最强有力的预 测因子之一，对心血管、脑血管以及外周血管疾病有着最好的预测及预后效果。
[0003] 有研宄表明，LP-PLA2与CRP水平都升高者患缺血性脑卒中的风险最高，其水平随 神经功能缺损程度增加而呈递增趋势，差异有统计学意义。高水平的Lp-PLA2、CRP对预测 脑梗死风险有重要意义。尽管Lp-PLA2、CRP都是炎症形成的标志物，但它们在体内作用的 机制不同，Lp-PLA2主要与脂类的代谢，特别是LDL代谢相关。CRP与炎症及血栓形成都存 在密切的关系，标明炎症和血栓形成的交互关系。
[0004] 目前对缺血性脑卒中的诊断与预测尚未出现将LP-PLA2与CRP两个指标进行联合 的检测方法，且对其单指标检测的方法主要有酶联免疫法和免疫比浊法，而这两种方法的 前处理过程较为复杂，大规模推广存在局限性。
[0005] 在免疫分析领域缺乏能够同时检测LP-PLA2和CRP的技术及其应用。因此，在实 践中有必要建立一种敏感度高、操作简单、成本低、适合大规模推广的检测方法。
【发明内容】
[0006] 发明目的：针对现有技术不足，本发明提供一种同时测定血浆中LP-PLA2和CRP的 层析法快速检测卡，其可以解决现有技术存在的不能在一个试纸条中同时检测Lp-PLA2和 CRP的问题。
[0007] 技术方案：为实现上述技术目的，本发明提出了一种同时测定血浆中Lp-PLA2和 CRP的层析法快速检测卡，包括底衬以及从左到右顺次相互搭接粘贴在底衬上方的样品垫、 涂覆有胶乳微球标记抗体的试剂垫、包被膜和吸水纸，所述包被膜上在靠近吸水纸的一端 划有一条包被了兔抗鼠IgG单克隆抗体的质控线，所述包被膜上在靠近试剂垫的一端划有 两条平行的第一检测线和第二检测线，其中，靠近试剂垫的第一检测线上包被有能与待检 抗原Lp-PLA2特异性结合的单克隆抗体，第二检测线上包被有能与待检抗原CRP特异结合 的单克隆抗体。包被膜上在靠近试剂垫的一端划有两条平行的检测线。其中，靠近试剂垫的 第一检测线上包被有能与待检抗原Lp-PLA2特异性结合的单克隆抗体，另一条检测线（第 二检测线）上包被有能与待检抗原CRP特异结合的单克隆抗体。所述的待检抗原Lp-PLA2 是人Lp-PLA2,所述待检抗原CRP是人CRP。
[0008] 优选地，所述的底衬为PVC底板或其他硬质不吸水的材料；所述样品垫为吸滤纸 或滤油纸；所述试剂垫可为聚酯膜；包被膜为硝酸纤维素膜或醋酸纤维素膜。
[0009] 本发明同时提出了上述层析法快速检测卡的制备方法，包括如下步骤：
[0010] 1)包被膜的制备：用包被缓冲液分别稀释能与待检抗原LP-PLA2特异性结合的抗 体、能与待检抗原CRP特异结合的抗体和兔抗鼠IgG抗体，并将稀释后的三种抗体分别平行 地喷于包被膜上对应的第一检测线、第二检测线和控制线，待三种抗体渗入包被膜后分别 形成第一检测线、第二检测线和控制线；
[0011] 2)喷涂有胶乳颗粒标记抗体的聚酯膜（试剂垫）的制备：分别制备连接了 Lp-PLA2特异性抗体的胶乳颗粒与连接了CRP特异性抗体的胶乳颗粒，这两种颗粒可以具 有相同或者不同的颜色，利用这两种胶乳颗粒的混合物喷涂聚酯膜；
[0012] 3)组装试纸条：在试纸条底衬上顺次相互搭接粘贴样品垫、喷涂有胶乳颗粒标记 抗体的聚酯膜、包被膜及吸水纸。
[0013] 其中，所述抗体与胶乳颗粒连接可通过如下方法实现：物理吸附法和化学偶联法， 其中，物理吸附法主要适用于胶体金标记抗体；化学偶联法主要适用于彩色胶乳颗粒标记 抗体包括碳二亚胺缩合法、过碘酸盐氧化法及重氮盐偶联法等。
[0014] 具体地，上述的胶乳微球是自制的胶体金颗粒或者彩色聚苯乙烯胶乳颗粒，颗粒 的粒径在50nm-75nm之间。其中，胶体金颗粒采用柠檬酸三钠还原法制备，具体步骤为：用 三蒸水将1?4wt%氯金酸稀释成0. 01?0. 04wt%，置于95?100°C反应10?15分钟， 加入1?2mL柠檬酸三钠，继续反应15?20分钟，待胶体金溶液颜色由蓝经紫变红后，冷 却后加入2?3mL1 %碳酸钾溶液备用；彩色聚苯乙烯胶乳颗粒购自默克公司。
[0015] 具体地，标记抗体的制备包括如下步骤：用1 %碳酸钾溶液调节制备的标记物颗 粒的pH值至7. 5,按照10yg链霉亲和素每毫升标记物颗粒的量加入链亲和素溶液并充分 混匀，置于25°C水浴反应30?40分钟后再加入5wt%BSA，封闭20分钟后，离心取沉淀， 用BSA恢复其终浓度为lwt%，4°C保存备用，按50yg单抗-生物素每mL标记物的量加入 标记物中，37°C搅拌反应40?45分钟，加入5wt%BSA，封闭20分钟，6000r/min离心20? 25分钟，弃上清，沉淀以标记抗体保存液恢复体积，得到标记抗体，4°C保存。
[0016] 本发明进一步提出了一种同时测定血浆中Lp-PLA2和CRP的试剂盒，包括上述的 层析法快速检测卡、说明书和外包盒，每单人份层析法检测卡由铝箔袋密封包装，每个包装 内另配有一根塑料滴管和一小袋干燥剂。所述试剂盒的检测灵敏度为：l)Lp-PLA2100ng/ mL;2)CRP100ng/mL。
[0017] 有益效果：与现有技术相比，本发明具有如下优点：
[0018] (l)CRP为反应炎症的急性时相反应蛋白，与损伤关系密切，可作为预测脑梗死体 积大小与严重程度的指标；Lp-PLA2参与了急性脑梗死的病理生理过程，是缺血性脑卒中 的独立预测指标，也可反映病情的严重程度；同时已有研宄发现，Lp-PLA2反映动脉病变的 严重程度的价值明显高于CRP。因此，检测血浆Lp-PLA2活性可以更佳地识别高危个体，而 联合检测两种指标，即Lp-PLA2和CRP则可有助于判断病情严重程度，判断梗死的面积大 小。
[0019] (2)本发明采用了现代POCT(即时检验）检测中最流行的层析法技术，通过试纸条 上同时设置包被有Lp-PLA2单克隆抗体或Lp-PLA2多克隆抗体检测线、包被有CRP单克隆 抗体或CRP多克隆抗体的检测线和兔抗鼠IgG抗体的控制线来实现。
[0020] (3)本发明的试剂盒具有敏感度高、检测指标多、成本低、操作简单、便于携带、检 测时间短、适合各种单位使用、储存简单、保质期长的优点。其中，采用高特异性的Lp-PLA2 单克隆抗体和CRP单克隆抗体，保证了检测结果的可靠性。
[0021] (4)用本发明试剂盒能够同步检测两个指标（待测抗原或蛋白），并且两种抗原不 会相互干扰，结果准确、快速、操作简便，可以广泛用于急性脑梗死等疾病的检测，可省时、 省力、节省样本消耗量等。
【附图说明】
[0022] 图1为本发明的快速检测试剂条的横断面结构示意图，
[0023] 其中：1、底衬；2、样品垫；3、试剂垫；4、包被膜；5、吸水纸；6、包被Lp-PLA2抗体的 检测线（T2线，即第一检测线）；7、包被CRP抗体的检测线（T1线，即第二检测线）；8、包被 兔抗鼠IgG抗体的控制线（C线）。
[0024] 图2为试剂条检测结果判定图，其中：
[0025] a.对照试剂条；
[0026] b.Lp-PLA2 与Lp-PLA2 阳性；
[0027] c.CRP阳性，Lp-PLA2 阴性；
[0028] d.CRP阴性，Lp-PLA2 阳性；
[0029] e.试剂条无效的实例之一，若C线不显色，则试剂条无效。
【具体实施方式】
[0030] 实施例1 :本发明提供了一种同时测定血浆中脂蛋白磷脂酶A2和C反应蛋白的层 析法快速检测卡及试剂盒。
[0031] 试剂来源：本发明中Lp-PLA2抗体（货号CLM0019006,购买自深圳市常量医学工 程有限公司）；鼠抗Lp-PLA2单克隆抗体（货号CLM0019005,购买自深圳市常量医学工程有 限公司）；CRP抗体（货号CLM0032003,购买自深圳市常量医学工程有限公司）；抗CRP单克 隆抗体（货号CLM0032005,购买自深圳市常量医学工程有限公司）；兔抗鼠IgG抗体（购买 自深圳市常量医学工程有限公司）。
[0032] 制备步骤